Pyrosequencing لتحديد وتوصيف الميكروبية

Summary

Pyrosequencing هي تقنية متعددة الاستخدامات التي تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية، تميز السلالات البكتيرية، والكشف عن الطفرات الوراثية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات. في هذا الفيديو، سيظهر الإجراء لتوليد الميكروبية AMPLICON، AMPLICON pyrosequencing، وتحليل تسلسل الحمض النووي.

Abstract

Pyrosequencing هي تقنية متعددة الاستخدامات التي تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية، تميز السلالات البكتيرية وكشف الطفرات الجينية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات. وتشمل مزايا pyrosequencing لتطبيقات علم الأحياء الدقيقة سريعة وموثوقة الفرز الفائق الإنتاجية وتحديد دقيق للميكروبات والطفرات الجينية الميكروبية. Pyrosequencing ينطوي على تسلسل الحمض النووي عن طريق تجميع حبلا التكميلية قاعدة واحدة في وقت واحد، مع تحديد كائن النوكليوتيدات محددة أدرجت خلال رد فعل التوليف. يحدث رد فعل على يجمد واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي القالب حيث يتم إضافة ريبوزية أربعة (dNTP) بالتسلسل وdNTPs الفردية هي المتدهورة إنزيمي قبل اضافة dNTP بجانب رد فعل التوليف. ويتم رصد الكشف عن قاعدة محددة دمجها في قالب من قبل جيل من chemilumإشارات inescent. ترتيب dNTPs التي تنتج الإشارات chemiluminescent يحدد تسلسل الحمض النووي للقالب. القدرة التسلسل في الوقت الحقيقي التكنولوجيا pyrosequencing يمكن تعريف الميكروبي السريع في فحص واحد. وبالإضافة إلى ذلك، الصك pyrosequencing، يمكن تحليل التنوع الجيني الكامل لمكافحة الجراثيم المقاومة للأدوية، بما في ذلك كتابة من تعدد الأشكال، والطفرات نقطة، الإدراج، والحذف، وكذلك الكمي من نسخ الجينات المتعددة التي قد تحدث في بعض المقاومة المضادة للميكروبات أنماط.

Introduction

Pyrosequencing هو طريقة سريعة ودقيقة لتسلسل الأحماض النووية التي تقوم على مبدأ "التسلسل عن طريق التخليق". "التسلسل عن طريق التخليق" ينطوي على استخدام قالب DNA ضفيرة واحدة لتجميع حبلا التكميلية قاعدة واحدة في وقت واحد، والكشف عن قاعدة أدرجت (A، T، G، أو C) في كل خطوة من خلال الكشف عن إشارة chemiluminescent. يتضمن رد فعل pyrosequencing الحمض النووي القالب، dNTPs (dATP، dGTP، dTTP، dCTP)، البلمرة DNA، ATP sulfurylase، وسيفيرين، وسيفيراز، وآبيراز. يبدأ رد فعل التوليف عن طريق إضافة واحدة من dNTPs أربعة والبلمرة DNA إلى واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي القالب البيروكسيديز. البلمرة DNA يدمج dNTP التكميلية على القالب، مع الافراج اللاحقة من بيروفوسفات (الشكل 1). ATP sulfurylase يحول نسبيا في بيروفسفات إلى ATP. ATP يعمل كمحفز لتحويل وسيفيراز بوساطة من وسيفيرين إلى oxyluciferin، التييولد ضوء (الشكل 2). شدة الضوء يتناسب مع عدد من النيوكليوتيدات أدرجت ويحدد ما إذا كان هو واحد أو أكثر dNTP معينة (dATP، dTTP، dGTP، أو dCTP) موجودة على حبلا قالب بالتسلسل (الشكل 3). أي dNTP الفردية هي التي تدهورت بفعل آبيراز قبل اضافة dNTP المقبل لاستمرار رد فعل التوليف. ويتكرر هذا "التسلسل عن طريق التخليق" رد فعل مع اضافة كل من dNTPs أربعة حتى يتم تحديد تسلسل الحمض النووي من القالب الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد.

لعرض الرسوم المتحركة للتفاعل pyrosequencing اضغط هنا لمشاهدة الفيلم .

Protocol

مقدمة: مستعمرة بكتيرية واحدة ينبغي أن تستخدم لتطعيم مرق ثقافة المناسبة التي حضنت بين عشية وضحاها. ثم تتم معالجة بيليه البكتيرية لتنقية الحمض النووي الجيني باستخدام المتاحة تجاريا الجيني عدة العزلة. الحمض النووي الجيني تنقية ينبغي أن يكون لها نسبة 260/280 (نانومتر)> 1.8 لضمان أن تكون العينة خالية من التلوث البروتين. كمية من الحمض النووي الجيني اللازمة لتوليد القالب pyrosequencing هو 10-20 نانوغرام.

A. التضخيم من قالب

(PyroMark PCR الدليل؛ www.qiagen.com / كتيبات ¹⁾

إعداد رد فعل PCR

ملاحظة: يجب أن البيروكسيديز واحد التمهيدي في نهاية ه 5 '، ووينصح أن يكون HPLC المنقى لإعداد القالب. نوصي PyroMark الفحص تصميم البرمجيات 2.0 ل PCR وSEquence التصميم التمهيدي التي هي الأمثل لفترة قصيرة للقراءة التسلسل، ومع ذلك، التمهيدي للانفجارات ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi؟LINK_LOC=BlastHome يمكن) من NCBI أيضا أن تستخدم لتصميم التمهيدي.

1. ذوبان الجليد كل الحلول المطلوبة (المذكورة في الجدول 1) وتخلط كل بدقة. إعداد رد فعل وفقا للجدول 1. ويمكن أن يتم كل العمل في درجة حرارة الغرفة.

ملاحظة: PCR ماجستير ميكس يحتوي MgCl ₂ لتركيز النهائي من 1.5 ملم، والتي توفر نتائج مرضية في معظم الحالات. إذا كان أعلى ² ملغ مطلوب ⁺ تركيز، وتصل إلى 3.5 ميكرولتر من 25 ملم MgCl ₂ يمكن أن تضاف إلى رد فعل.

2. تخلط جيدا مزيج رد فعل من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا، ثم الاستغناء عن وحدات التخزين المناسبة في أنابيب PCR.
3. إضافة templatه الحمض النووي لكل أنبوب PCR. ونحن نوصي 10 نانوغرام من الحمض النووي الجيني.
4. برنامج cycler الحرارية وفقا للجدول 2. A عقد النهائي في 4 درجات مئوية لمدة ينصح الراحة. إذا باستخدام cycler الحرارية دون غطاء ساخنة، وردود الفعل تراكب مع 100 ميكرولتر الزيوت المعدنية.
5. وضع أنابيب PCR في cycler وبدء برنامج ركوب الدراجات.

B. البروتوكول محطة فراغ

شل حركة المنتجات PCR البيروكسيديز

1. جعل مزيج الرئيسي وفقا لالرقم 4.

ملاحظة: قبل pipetting ل، هز بلطف زجاجة من الخرز سيفاروز streptavidin المغلفة لضمان تعليق متجانسة.

2. اعتمادا على حجم المنتج PCR المستخدمة، الاستغناء 60-75 ميكرولتر مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة PCR لإعطاء حجم ما مجموعه 80 ميكرولتر لكل بئر.
3. إضافة 5-20 ميكرولتر منتج PCR البيروكسيديز إلى كل بئر.
4. اغلاق الآبار مع قطاع CAPS وتستنهض الهمم لوحة PCR في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) باستخدام شاكر المداري.

تمسخ من الحمض النووي وبالإضافة إلى ذلك من تسلسل التمهيدي

1. تمييع الاشعال التسلسل إلى 0.3 ميكرومتر مع الصلب العازلة والاستغناء عن 25 ميكرولتر في كل بئر من لوحة رد فعل. وضع لوحة على محطة العمل.
2. ملء أحواض محطة العمل وفقا لمخطط الشكل 5.
3. بدوره على مضخة فراغ، وتأكد من ضبط المفتاح على أداة فراغ لفي (الشكل 6). مسح تحقيقات مع فلتر المياه عالية النقاء (ملي-Q 18.2 ميغاواط X سم أو ما يعادلها) في الحوض الصغير 5 (الشكل 5). إعادة ملء الحوض بالماء عالية النقاء العذبة للاستخدام في الخطوة 12.
4. العمل بسرعة، ووضع لوحة PCR مع الخرز على محطة العمل. ضمان أن كلا من لوحات في نفس التوجه كما هو الحال عندما تم تحميل العينات.
5. مع التبديل فراغ ON، خفض الفراغأداة في الآبار من لوحة PCR لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. سوف يتم القبض على حبات من قبل أداة فراغ (الشكل 7).
6. مع الفراغ لا يزال ON، تدفق أداة مع الايثانول 70٪ (الحوض الصغير 1) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم.
7. مع فراغ ON، تدفق أداة مع حل تمسخ (حوض 2) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم.

ملاحظة: يحتوي الحل تمسخ هيدروكسيد الصوديوم، الذي هو العين وأنسجة الجلد. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات، ونظارات واقية.

8. مع فراغ ON، تدفق أداة مع غسل العازلة (الحوض الصغير 3) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم.
9. مع فراغ ON، رفع أداة الفراغ الى ما بعد 90 درجة عمودي لمدة 5 ثوانى، للسماح لجميع السائل إلى استنزاف للخروج من أداة فراغ. تحويل مضخة OFF، ومحاذاة أداة فراغ مع لوحة رد فعل. أخفض أداة فراغ فيالآبار ويهز بلطف من جانب إلى آخر للافراج عن الخرز في الآبار التي تحتوي على تسلسل التمهيدي.
10. من أجل تنظيف أداة فراغ، تستنهض الهمم تحقيقات مرشح في المياه عالية النقاء (الحوض الصغير 4) لمدة 10 ثانية.
11. تبديل ON فراغ ومسح أداة بالماء عالية النقاء (حوض 5) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم.
12. رفع أداة الفراغ الى ما بعد 90 ° C عمودي لمدة 5 ثوانى، ثم التبديل الفراغ من وتخزينها في موقف "انتظار".

الصلب التمهيدي لتسلسل الحمض النووي مسارات

1. وضع لوحة رد فعل في حامل لوحة قبل تحسنت.
2. تسخين لوحة على كتلة التدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
3. إزالة لوحة من حامل ووضعت على وصفة طبية لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.

Pyromark Q24 عملية

ملاحظة: شغل أداة باستخدام مفتاح الطاقة الموجود أعلى سلك الطاقة. نجمةكبش يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 1 دقيقة.

1. ملء خرطوشة وفقا للتعليمات الواردة في PyroMark الذهب Q24 الكواشف الدليل ^(2). لتحديد حجم الحاجة، إعداد ملف تشغيل في البرنامج الصك، وضمن القائمة أدوات اختيار تمهيدي معلومات تشغيل
2. إذا كان الصك بالفعل على، تأكد من أنه لا يؤدون شوط ومن ثم فتح الغطاء. سوف تنبعث إشارة تحذير مسموعة إذا تم فتح الغطاء عندما يكون غير آمن للقيام بذلك.
3. فتح باب خرطوشة وأدخل خرطوشة مع التسمية متقابلة إلى الأمام (الشكل 8). تأكد من أن خرطوشة يتم إدراج بشكل صحيح (يجب أن يكون خط مرئي في الجبهة) وإغلاق البوابة.
4. فتح إطار لوحة (الفيتو) ووضع لوحة مع عينات داخل الصك.
5. إغلاق إطار لوحة القابضة وغطاء صك (الشكل 9).

بدء التشغيل

1. إدراج عصا USB مع ملف التشغيلق إنشاؤها بواسطة هذه البرامج أداة في منفذ USB في مقدمة الصك.
2. حدد "تشغيل" في القائمة الرئيسية ثم اضغط على "OK".
3. استخدم الأسهم التمرير لتحديد ملف التشغيل المطلوب ثم اضغط على "اختيار".

ملاحظة: وسوف تبدأ صك الاستغناء الكواشف عندما يتم التوصل إلى كل الضغوط مسبقا ومستويات درجة الحرارة (قد يستغرق هذا عدة دقائق). خلال شوط، يعرض على الشاشة الصك pyrogram من اختيارها بشكل جيد في الوقت الحقيقي. استخدم الأسهم التمرير لعرض pyrogram من الآبار الأخرى.

استكمال تشغيل

1. عندما يؤكد الصك أن يتم الانتهاء من تشغيل وتم حفظ ملف تشغيل إلى عصا USB، اضغط على "إغلاق".
2. إزالة عصا USB. إذا تمت إزالته قبل تشغيل الانتهاء، إدراج عصا USB. حدد "إدارة" ثم "نسخ أشواط غير محفوظ".
3. يمكن الآن فتح ملف تشغيل وتحليلها باستخدام برنامج الصك ومقارنةإلى مكتبة من الميكروبات المعروفة باستخدام برنامج Identifire.

النتائج

نتائج شوط pyrosequencing نموذجي باستخدام برنامج يظهر الموقع من الاشعال إلى الأمام وعكس تستخدم لتوليد AMPLICON، والتمهيدي التسلسل تستخدم للتفاعل pyrosequencing داخل 16S الحفظ تسلسل الريباسي (الشكل 10). تسلسل hypervariable بين التمهيدي مواقع يسمح لتحديد البكتيريا من عدد كبير من الأنواع البكتيرية باستخدام التمهيدي تسلسل الحفظ (5'-TACATGCAAGTCGA). باعتبارها مراقبة الجودة الداخلية، وتسلسل الحمض النووي بين أقواس المنطقة متغير ويمكن التحقق من أن أؤكد أن المنطقة DNA الصحيح وقد تم تحليلها . البرنامج pyrosequencing يسمح للمقارنة ومحاذاة تسلسل ولدت لقاعدة بيانات داخلية من تسلسل الريباسي البكتيرية لتحديد البكتيريا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل تسلسل لتحديد الطفرات التي تمنح المضادات الحيوية المقاومة للأدوية. على سبيل المثال، تحليل الطفرات في الجينات 23S الريباسي من Helicobيوضح بيلوري acter نمطين الطفرة (غا أو AGA) التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية (الشكل 11). تحليل عزلات متعددة من نفس المريض يمكن أن يعاير في وقت واحد لتتبع ظهور المقاومة للأدوية على مر الزمن للمساعدة في التحقيقات الوبائية لانتشار الجراثيم المقاومة للأدوية.

الشكل 1. يتم استخدام المنتج PCR البيروكسيديز كقالب لدمج dNTPs بواسطة البلمرة DNA، مما يؤدي إلى توليد بيروفوسفات (نقطة في البوصة).

الشكل 2. ATP sulfurylase يحول نسبيا بيروفسفات إلى ATP. أعمال ATP كمحفز لتحويل وسيفيراز بوساطة من وسيفيرين إلى oxyluciferin، الذي يولد الضوء الذي هو برو portional لكمية من ATP. يتم تسجيل النور كما الذروة على تتبع pyrogram ويشير إلى إدماج النوكليوتيدات. وdNTPs الفردية هي التي تدهورت بفعل آبيراز قبل إضافة dNTP المقبل لمواصلة عملية التجميع.

الشكل (3). شدة الضوء ولدت يشير إلى ما إذا تأسست واحد أو أكثر dNTP معينة (dATP، dTTP، dGTP، أو dCTP) على قالب حبلا بالتتابع.

الشكل 4. الرسم البياني لإعداد مزيج الرئيسي لشل حركة المنتج PCR البيروكسيديز.

GE = "دائما"> الشكل 5. PyroMark محطة العمل، مع PCR لوحة، لوحة PyroMark، والمواقع الحوض الصغير.

الشكل (6). مواقع التبديل فراغ ON OFF والمواقف.

الرقم 7. أداة فراغ. التعامل الصحيح مع أداة فراغ.

الرقم 8. فتح باب خرطوشة مع خرطوشة في مكانها.

الشكل 9. خرطوشة إدخالها بشكل صحيح مع البوابة مغلقة.

"FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما ">
الشكل 10. Pyrosequencing نتائج تحديد البكتيريا القائم. صممت الاشعال PCR للمناطق المحمية من القالب الحمض النووي، ويتم وضع تسلسل التمهيدي فورا المنبع من A-تتميز كذلك تحديد تسلسل الحمض النووي hypervariable داخل AMPLICON (كما هو موضح باللون الأزرق).

الشكل 11. الكشف عن المضادات الحيوية المقاومة للأدوية في هيليكوباكتر بيلوري باستخدام pyrosequencing. تحليل الطفرات في الجينات 23S التي تمنح مقاومة للجراثيم في هيليكوباكتر بيلوري التي تحتوي على غا أو متواليات AGA. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

مكون	حجم في رد الفعل	تركيز النهائي
بايرو PCR ماجستير ميكس، 2X	12.5 ميكرولتر	1X
مركزات CoralLoad، 10X	2.5 ميكرولتر	1X
25 ملي MgCl 2 (اختياري)	متغير	≥ 1.5 ملم
Q-الحل، 5X (اختياري)	5 ميكرولتر	1X
التمهيدي A / B التمهيدي	متغير / متغير	0.2 ميكرومتر μM/0.2
الماء ريبونوكلياز خالية	متغير	-
اجمالى حجم التداول (بعد إضافة الحمض النووي القالب)	25 ميكرولتر

الجدول 1. PCR تفاعل الخليط.

	& NBSP؛		تعليقات إضافية
الخطوة الأولي تفعيل PCR	15 دقيقة	95 ° C	يتم تنشيط HotStartTaq الحمض النووي البلمرة
3 الخطوة الدراجات: تمسخ	30 ثانية	94 ° C
الصلب	30 ثانية	60 ° C 56 ° C	لالحمض النووي الجيني لبيسلفيت الحمض النووي تحويلها
تمديد	30 ثانية	72 ° C
عدد دورات	45
التمديد النهائي	10 دقيقة	72 ° C

الجدول 2. PCR دورة المواصفات.

Discussion

وقد تم تسويقها القليلة المقبلة أساليب جديدة التسلسل جيل. ثلاثة من أكثر الوسائل المستخدمة على نطاق واسع هي أيون تسلسل أشباه الموصلات، واحدة جزيء الحقيقي التسلسل الوقت، وتسلسل عن طريق التخليق (SBS). ^3-11 كل من هذه الطرق يعتمد على التسلسل عن طريق التخليق ولكن توظيف المنصات رواية للكشف عن النيوكليوتيدات يدمج. في أيون أشباه الموصلات التسلسل، ضفيرة واحدة من الحمض النووي بمثابة قالب لحبلا التسلسل. ¹² البلمرة والنيوكليوتيدات تضاف بالتتابع كما هو الحال في pyrosequencing. عند إضافة النوكليوتيدات إلى حبلا الحمض النووي المتزايد، ويتم تحريرها أيون الهيدروجين. تم الكشف عن أيون الهيدروجين بواسطة تأثير الترانزستور الاستشعار الميدانية.

واحد جزيء الحقيقي التسلسل الوقت يعتمد على وضع دليل موجة صفر (كتبها zmw). كتبها zmw ¹³ هو بنية صغيرة حيث يتم إرفاق جزيء البلمرة واحدة إلى أسفل البئر. يضيء في مثل هذه الطريقة أن فلورويمكن الكشف عن جزيء رائحة. غير الموسومة كل النوكليوتيدات مع جزيء نيون. كما أدرج النوكليوتيدات الموسومة fluorescently، كاشف يحدد النوكليوتيدات. عندما تتم إضافة النوكليوتيدات المقبل، هو المشقوق جزيء الفلورسنت ¹⁴

التسلسل عن طريق التخليق (SBS) يستخدم طريقة فريدة من نوعها لتضخيم الحمض النووي المستهدف بحيث يتم إنشاء مجموعات من متواليات فريدة من نوعها. قوالب ¹⁵ الذين تقطعت بهم السبل واحدة يتم إنشاؤها ثم يتم تصنيعه حبلا التكميلية. يتم تصنيف كل النوكليوتيدات مع جزيء الفلورسنت وبعد كل إضافة قاعدة يتم تسجيل مضان من قاعدة المضافة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PyroMark PCR Master Mix, 2x	Qiagen	978703
CoralLoad Concentrate, 10x	Qiagen	978703, 978705
Q-Solution, 5x	Qiagen	978703, 978705
MgCl2, 25 mM	Qiagen	978703, 978705
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Primers	Qiagen	978776 or 978777	Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM.
Pyromark Gold Q24 Reagents	Qiagen	970802
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent)
Streptavidin Sepharose High Performance Beads	GE Healthcare	17-5113-07
PyroMark Annealing Buffer	Qiagen	979009
PyroMark Denaturation Solution	Qiagen	979007
PyroMark Wash Buffer	Qiagen	979008
PyroMark Q24	Qiagen	9001514
PyroMark Q24 Cartridge	Qiagen	979202
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box	Qiagen	979105
PyroMark Q24 Vacuum Workstation	Qiagen	9001516
PyroMark Q24 Plate Holder	Qiagen	9022273
Orbital shaker	Fisher	11-675-297
Heat block	Fisher	11-718Q