Пиросеквенирования для идентификации микроорганизмов и характеристика

Резюме

Пиросеквенирование представляет собой универсальный метод, который облегчает микробных секвенирование генома, которые могут быть использованы для идентификации бактериальных видов, различать бактериальных штаммов, и обнаружить генетические мутации, которые придают устойчивость к антимикробным агентам. В этом видео, порядок микробной поколения ампликону, ампликону пиросеквенирования, и анализ ДНК будет продемонстрирована.

Аннотация

Пиросеквенирование представляет собой универсальный метод, который облегчает микробных секвенирование генома, которые могут быть использованы для идентификации бактериальных видов, различать бактериальных штаммов и обнаружить генетические мутации, которые придают устойчивость к антимикробным агентам. Преимущества пиросеквенирования для приложений микробиологии включают быстрые и надежные высокопроизводительного скрининга и точной идентификации микробов и микробных мутаций генома. Пиросеквенирование включает последовательности ДНК путем синтеза комплементарной нити одной базы за один раз, в то время как определения конкретной нуклеотидной существа вводят во время реакции синтеза. Реакция происходит на иммобилизованных одноцепочечной ДНК-матрицы, где четыре дезоксирибонуклеотидам (дНТФ) добавляли последовательно и некорпоративные дНТФ являются ферментативной деструкции перед добавлением следующего дНТФ в реакции синтеза. Обнаружение конкретной базы включены в шаблон контролируется поколения chemiluminescent сигналов. Порядок дНТФ, которые производят хемилюминесцентного сигнала определяет ДНК последовательность матрицы. В режиме реального времени последовательности возможности технологии пиросеквенирования позволяет быстро идентификации микроорганизмов в одном анализе. Кроме того, пиросеквенирования инструменте, можно проанализировать полный генетическим разнообразием антимикробных лекарственной устойчивости, включая ввод полиморфизмов, точечные мутации, инсерции и делеции, а также количественное множественных копий гена, которые могут иметь место в некоторых антимикробные сопротивление узоров.

Введение

Пиросеквенирование является быстрым и точным методом последовательность нуклеиновых кислот, которая основана на принципе "секвенирования путем синтеза". "Последовательность синтезом" предполагает использование одного шаблона нити ДНК для синтеза комплементарной нити одной базовой за один раз, и определение включены основание (A, T, G или С) на каждом этапе обнаружения хемилюминесцентного сигнала. Пиросеквенирования реакции, включает ДНК-матрицы, дНТФ (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ), ДНК-полимеразы, сульфурилаза АТФ, люциферин, люцифераза и апиразы. Синтез Реакцию инициируют добавлением одного из четырех дНТФ и ДНК-полимеразы с одноцепочечной биотинилированных ДНК-матрицы. ДНК-полимераза включает в себя дополнительные дНТФ на шаблоне, с последующим высвобождением пирофосфата (рис. 1). ATP сульфурилаза пропорционально преобразует пирофосфата к СПС. АТФ действует как катализатор для люциферазы, опосредованной преобразование люциферин в оксилюциферин, которыйгенерирует свет (рис. 2). Интенсивность света пропорциональна количеству нуклеотидов включены и определяет, является ли один или более конкретных дНТФ (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ или) присутствует на матричной нити последовательно (фиг.3). Любой дНТФ некорпоративные разлагается под апиразы перед добавлением следующего дНТФ для продолжения реакции синтеза. Эта «последовательности путем синтеза" Повтор ли реакцию с добавлением каждого из четырех дНТФ, пока последовательность ДНК одноцепочечной ДНК-матрицы не определен.

Для просмотра анимации пиросеквенирования реакции Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

протокол

Введение единственной бактериальной колонией, должна быть использована для инокуляции соответствующего культурального бульона, который инкубируют в течение ночи. Бактериальный осадок затем обрабатывается для очистки геномной ДНК с использованием коммерчески доступного набора геномной изоляции. Очищенной геномной ДНК должна иметь 260/280 (нм) соотношение> 1,8 заверить, что образец не содержит белка загрязнения. Количество геномной ДНК, необходимые для генерации пиросеквенирования шаблон составляет 10-20 нг.

А. Усиление шаблона

(ПЦР PyroMark справочник; www.qiagen.com / справочников ¹⁾

Настройка реакции ПЦР

Примечание: Один грунтовка должна быть биотинилированы в конце своей 5 ', и рекомендуется, чтобы он был очищен ВЭЖХ для подготовки шаблона. Мы рекомендуем Пробирной PyroMark Design Software 2.0 для ПЦР и SEпоследовательности праймеров, которые оптимизированы для чтения коротких последовательностей, однако, Primer-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome ) из NCBI также можете использоваться для праймеров.

1. Разморозить все необходимые растворы (перечисленные в таблице 1) и тщательно перемешать каждый. Установка реакции в соответствии с таблицей 1. Все работы можно сделать при комнатной температуре.

Примечание: PCR Master Mix содержит MgCl ₂ в конечной концентрации 1,5 мМ, что обеспечивает удовлетворительные результаты в большинстве случаев. Если выше Mg ^{2 +,} концентрация не требуется, до 3,5 мкл 25 мМ MgCl ₂ может быть добавлен к реакции.

2. Тщательно перемешать в реакционной смеси, осторожно пипеткой вверх и вниз, то обойтись соответствующие объемы в пробирки ПЦР.
3. Добавить Templatэлектронной ДНК в каждую пробирку PCR. Мы рекомендуем 10 нг геномной ДНК.
4. Запрограммируйте термоциклер согласно таблице 2. Окончательного выдерживания при 4 ° С рекомендуется для удобства. При использовании термоциклер без крышки с подогревом, наложение реакции со 100 мкл минерального масла.
5. Поместите пробирки для ПЦР в циклере и запустить программу Велоспорт.

B. Вакуумная Workstation протокола

Иммобилизации Биотинилированные продуктов ПЦР

1. Сделайте мастер-микс в соответствии с рисунком 4.

Примечание: Перед пипетки, аккуратно встряхнуть бутылку покрытых стрептавидином шарики сефарозой дл обеспечени гомогенной суспензии.

2. В зависимости от объема продукта ПЦР использовали, дозируют 60-75 мкл смеси мастер в каждую лунку пластины ПЦР для получения общего объема 80 мкл на лунку.
3. Добавить 5-20 мкл биотинилированного ПЦР-продукт в каждую лунку.
4. Печать скважин с полосой CAпс и перемешивать ПЦР планшет при 1400 оборотах в минуту в течение 5-10 мин при комнатной температуре (15-25 ° C) с использованием орбитальном шейкере.

Денатурация ДНК и добавление последовательности праймера

1. Развести праймеры для секвенирования до 0,3 мкм с отжигом буфера и 25 мкл в каждую лунку реакционного планшета. Установите пластину на рабочей станции.
2. Заполнить рабочую станцию ​​желоба в соответствии с рис 5 схеме.
3. Включите вакуумный насос, и убедитесь, что переключатель на вакуумном инструмент установлен в On (рис. 6). Промойте фильтр зонды с высокой чистоты воды (Milli-Q 18,2 МВт х см или эквивалент) в желоба 5 (рис. 5). Заполнить корыто со свежим воды высокой чистоты для использования на стадии 12.
4. Рабочие быстро, позиционировать ПЦР планшет с бисером на рабочей станции. Убедитесь, что обе пластины в той же ориентации, когда образцы были загружены.
5. С вакуумным выключателем ON, опустите вакуумаинструмента в лунки планшета ПЦР в течение 20 с или до полного объема была атмосферный. Шарики будут захвачены вакуума инструмента (рис. 7).
6. С вакуумным еще включен, промойте инструмент с 70% этанола (через 1) в течение 20 сек или пока весь объем не был атмосферный.
7. С вакуум, промойте инструмент с денатурации раствора (через 2) в течение 20 сек или пока весь объем не был атмосферный.

Примечание: денатурация Раствор содержит гидроксид натрия, который является глаз и раздражение кожи. Всегда надевайте халат, перчатки и защитные очки.

8. С вакуум, промойте инструмент промывочным буфером (через 3) в течение 20 сек или пока весь объем не был атмосферный.
9. С вакуум, вакуум поднять инструмент, чтобы за 90 ° по вертикали в течение 5 секунд, чтобы все жидкости вытечь из вакуума инструмента. Выключить насос и совместите вакуум инструмент с реактивной пластиной. Опустите вакуум инструмент вскважин и осторожно встряхните из стороны в сторону, чтобы освободить шарики в лунки, содержащие последовательности праймера.
10. Для того, чтобы очистить вакуумным инструментом, агитировать фильтра зондов в воды высокой чистоты (через 4) в течение 10 сек.
11. Включите вакуума на и промойте инструмент с высокой чистоты воды (желоба 5) в течение 20 сек или пока весь объем не был атмосферный.
12. Поднимите вакуум инструмент за 90 ° С вертикальным в течение 5 секунд, затем включите вакуум и храните в "Паркинг" положение.

Отжига праймеров для секвенирования ДНК

1. Поместите реакции пластины в предварительно нагретой пластине держателя.
2. Нагреть плиту на нагревательном блоке при 80 ° С в течение 2 мин.
3. Снять пластину из держателя и место на прилавке, чтобы охладить при комнатной температуре в течение 5 мин.

PyroMark Q24 операции

Примечание: Включите прибор с помощью выключателя, расположенного над шнур питания. Звездатуп может занять до 1 мин.

1. Заполните картридж в соответствии с инструкциями, приведенными в Руководстве PyroMark Золото Q24 Реагенты ^2. Чтобы определить объемы, необходимые, создана запустить файл в программное обеспечение прибора, и в меню Сервис, выберите Подготовка информации Run
2. Если прибор был уже включен, убедитесь, что он не выполняет перспективе, а затем откройте крышку. Предупреждающий звуковой сигнал будет выработан если крышка открывается, когда это опасно делать.
3. Откройте ворота картриджа и вставьте картридж этикеткой вперед (рис. 8). Убедитесь, что картридж установлен правильно (линия должна быть видна на переднем плане) и закрыть ворота.
4. Откройте пластину-холдинг кадра и расположить пластины с образцами внутри прибора.
5. Закройте пластины-холдинг рама и крышка прибора (рис. 9).

Начиная перспективе

1. Вставляем флешку USB с выполнения файла© Создано с прибором программное обеспечение в порт USB на передней панели прибора.
2. Выберите "Run" в главном меню и нажмите кнопку "OK".
3. Используйте стрелки прокрутки, чтобы выбрать нужный файл перспективе и нажмите "Выбрать".

Примечание: Прибор начинает дозирования реагентов при всех заданных давлении и температуре уровни достигнуты (это может занять несколько минут). Во время бега, прибор экране отображается пирограмма выбранной скважины в режиме реального времени. Используйте стрелки прокрутки для просмотра пирограмма другим скважинам.

Прохождение подземелья

1. Когда прибор подтверждает, что перспективы закончен и выполнения файла был сохранен на USB-модем, нажмите "Закрыть".
2. Вынуть флешку USB. Если он был удален до второго тура закончен, вставьте USB-модем. Выберите "Управление", а затем "Копировать Несохраненный прогонов".
3. Запустите файл теперь можно открыть и проанализированы с помощью программного обеспечения прибора и сравнилик библиотеке известных микробов использованием Identifire программного обеспечения.

Результаты

Результаты типичного эксперимента пиросеквенирования с помощью программного обеспечения показано расположение прямого и обратного праймеров, используемых для ампликона поколения, а секвенирование праймер, используемый для пиросеквенирования реакции в консервативных 16S рибосомальной последовательности (рисунок 10). Гипервариабельные последовательности между праймером участков позволяет идентификации бактерий из большого числа бактериальных видов использования консервативные последовательности праймера (5'-TACATGCAAGTCGA). В качестве внутреннего контроля качества, в скобки последовательности ДНК вариабельной области могут быть проверен, чтобы гарантировать, что правильный участок ДНК был проанализирован . Пиросеквенирования программное обеспечение позволяет сравнивать и выравнивание сгенерированную последовательность на внутренней базе данных бактериальной рибосомной последовательностей для идентификации бактерий. Кроме того, последовательность может быть проанализированы для определения мутации, которые придают устойчивость к антибиотикам препарата. Например, анализ мутаций в 23S рибосомных генов из Helicobтер Pylori демонстрируются два мутации шаблонов (ГАА или AGA), которые придают устойчивость к антибиотикам (рис. 11). Анализ нескольких изолятов из того же больного может быть одновременно анализировали отслеживать появление лекарственной устойчивости в течение долгого времени, чтобы помочь в эпидемиологических исследований микробных вспышки лекарственной устойчивостью.

Рисунок 1. Биотинилированных продукт ПЦР использовали в качестве матрицы для включать дНТФ с помощью ДНК-полимеразы, что приводит к генерации пирофосфат (ИЦП).

Рисунок 2. АТФ сульфурилаза пропорционально преобразует пирофосфат к АТФ. АТФ действует как катализатор для люциферазы, опосредованной преобразование люциферин в оксилюциферин, который генерирует свет, который пропропорциональна количеству АТФ. Свет отражается как пик на пирограмма след и указывает включение нуклеотидов. Неинкорпорированных дНТФ разлагаются апиразы до следующего дНТФ добавляется для продолжения синтеза.

Рисунок 3. Интенсивность света, генерируемого указывает, является ли один или более конкретных дНТФ (дАТФ, дТТФ, дГТФ, или дЦТФ) было зарегистрировано на матричной нити последовательно.

Рисунок 4. Блок-схема для подготовки мастер-микс для иммобилизации биотинилированному продукта ПЦР.

GE = "всегда"> Рисунок 5. PyroMark рабочая станция с ПЦР планшет, с PyroMark пластины, и впадина местах.

Рисунок 6. Места для вакуумной и выключать выключатель позиций.

Рисунок 7. Вакуумный инструмента. Правильное обращение с вакуумным инструментом.

Рисунок 8. Картридж ворота открылись с картриджем на месте.

Рисунок 9. Картридж правильно установлен с воротами закрыта.

"FO: держать-together.within-страницы =" всегда ">
Рисунок 10. Пиросеквенирования на основе бактериальных результатов идентификации. ПЦР-праймеры предназначены для консервативных участков ДНК-матрицы и последовательности праймера расположена непосредственно перед хорошо охарактеризованных определения гипервариабельные последовательности ДНК в ампликона (показан синим цветом).

Рисунок 11. Обнаружение антибиотиков лекарственной устойчивости хеликобактер пилори использованием пиросеквенирования. Анализ мутаций в 23S гены, которые придают антибактериальные сопротивления в Helicobacter Pylori содержащие ГАА или AGA последовательностей. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

TD>

Объем на реакцию	Конечная концентрация
Pyro PCR Master Mix, 2x	12,5 мкл	1x
CoralLoad концентрат, 10x	2,5 мкл	1x
25 мМ MgCl 2 (Необязательно)	Переменная	≥ 1,5 мМ
Q-решения, 5x (опционально)	5 мкл	1x
Грунтовка / Грунтовка B	Переменный / переменная	0,2 мкм μM/0.2
РНКазы без воды	Переменная	-
Общий объем (после добавления ДНК-матрицы)	25 мкл

< Component

Таблица 1. Реакционная смесь для ПЦР.

	& NBSP;		Дополнительные комментарии
Начальная активация ПЦР шаг	15 мин	95 ° C	HotStartTaq ДНК-полимераза активируется
3 Шаг Велоспорт: Денатурацию	30 сек	94 ° C
Отжиг	30 сек	60 ° C 56 ° C	Для геномной ДНК Для бисульфит превращается ДНК
Расширение	30 сек	72 ° C
Количество циклов	45
Окончательное удлинение	10 мин	72 ° C

Таблица 2. Спецификации цикла ПЦР.

Обсуждение

Несколько новых методов секвенирования следующего поколения были коммерческими. Три из наиболее широко используемых методов ионного полупроводниковых последовательности, одну молекулу реальном времени последовательности и последовательности путем синтеза (SBS). ^3-11 Каждый из этих методов зависит от последовательности путем синтеза, но использованию новых платформ для обнаружения объединенного нуклеотидов. В ионных полупроводниковых последовательности, одной нити ДНК служит в качестве матрицы для секвенирования нити. ¹² полимераза и нуклеотиды добавляют последовательно, как в пиросеквенирования. Когда нуклеотидной добавляется в растущую цепь ДНК, ион водорода будет отпущена. Водородных ионов обнаруживается полевой транзистор на основе датчика.

Одна молекула реальном последовательности в зависимости от времени ноль волновода режим (ZMW). ¹³ ZMW небольшое структура, в которой одна молекула полимеразной прикреплен к нижней части скважины. Это освещается таким образом, что флорезапах молекулы могут быть обнаружены. Каждый нуклеотид помечен флуоресцентной молекулой. В качестве флуоресцентно меченый нуклеотид включен, детектор определяет нуклеотида. Когда следующий нуклеотидных добавлен, флуоресцентные молекулы отщепляется ^14.

Секвенирование путем синтеза (SBS) использует уникальный метод для амплификации ДНК-мишени так, что кластеры из уникальных последовательностей генерируются. ¹⁵ Одноцепочечную шаблоны генерируются и затем комплементарной нити синтезируется. Каждый нуклеотид метят флуоресцентной молекулы и после каждого основно-аддитивные флуоресценции добавленного основания записывается.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
PyroMark PCR Master Mix, 2x	Qiagen	978703
CoralLoad Concentrate, 10x	Qiagen	978703, 978705
Q-Solution, 5x	Qiagen	978703, 978705
MgCl2, 25 mM	Qiagen	978703, 978705
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Primers	Qiagen	978776 or 978777	Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM.
Pyromark Gold Q24 Reagents	Qiagen	970802
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent)
Streptavidin Sepharose High Performance Beads	GE Healthcare	17-5113-07
PyroMark Annealing Buffer	Qiagen	979009
PyroMark Denaturation Solution	Qiagen	979007
PyroMark Wash Buffer	Qiagen	979008
PyroMark Q24	Qiagen	9001514
PyroMark Q24 Cartridge	Qiagen	979202
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box	Qiagen	979105
PyroMark Q24 Vacuum Workstation	Qiagen	9001516
PyroMark Q24 Plate Holder	Qiagen	9022273
Orbital shaker	Fisher	11-675-297
Heat block	Fisher	11-718Q