الحصول على الإسفار الوقت الفاصل بين الأفلام من الخميرة في مهدها وتحليل ديناميات وحيدة الخلية باستخدام الطعوم

Summary

نقدم بروتوكول بسيط للحصول على الأفلام المجهري مضان من خلايا الخميرة في التزايد، ومجموعة من البرامج المستندة إلى واجهة المستخدم الرسومية لاستخراج البيانات وحيدة الخلية سلسلة زمنية. يتضمن تحليل النسب الآلي وتقسيم الوقت الاحالة متكاملة مع الفحص البصري وكرأيشن اليدوي للبيانات مجنزرة.

Abstract

أصبحت مضان الوقت الفاصل بين المجهري أداة قوية في دراسة العديد من العمليات البيولوجية على مستوى خلية واحدة. على وجه الخصوص، والأفلام التي تصور الاعتماد الزمانية في التعبير الجيني توفير نظرة ثاقبة على ديناميات تنظيمه، ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية إلى الحصول على وتحليل الأفلام مضان من الخلايا واحد. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة باستخدام المتاحة تجاريا جهاز الثقافة ميكروفلويديك لتوليد مثل هذه البيانات، و، واجهة المستندة إلى MATLAB المستخدم الرسومية (GUI) المستندة إلى حزمة برامج لقياس الصور مضان. قطاعات البرمجيات وخلايا المسارات، وتمكن المستخدم من الإشراف أخطاء في البيانات بصريا، وتلقائيا بتعيين النسب والأوقات الانقسام. يحلل GUI مزيد من السلسلة الزمنية لإنتاج آثار خلية كاملة وكذلك مشتقاتها المرة الأولى والثانية. في حين تم تصميم البرنامج لS. الخباز، ينبغي نمطية وبراعة تسمح لها رس تكون بمثابة منصة لدراسة أنواع الخلايا الأخرى مع بعض التعديلات.

Introduction

وقد عززت تحليل وحيدة الخلية في التعبير الجيني فهمنا لكثير من جوانب تنظيم الجينات. لقطات ثابتة من الفلورسنت التعبير مراسل باستخدام التدفق الخلوي أو المجهري تقديم معلومات مفيدة عن توزيع للتعبير عن خلية واحدة، ولكنها تفتقر إلى تاريخ وتطور بيانات السلاسل الزمنية اللازمة لإبلاغ مباشرة ديناميات التعبير الجيني. يعرض مضان المجهري الوقت الفاصل بين وسيلة للحصول على كل القياسات وحيدة الخلية وتاريخهم. وقد تم تطوير تقنيات التجريبية والتحليلية المختلفة للحصول على وكميا أفلام من الفلورسنت التعبير الصحفي، وبالتالي إضفاء نظرة ثاقبة ميزات تنظيم الجينات (انظر ¹ للمراجعة) مثل الاختلاف الخلية الى خلية ^2،3، تشكيل persister البكتيرية ^4، النسخ بدء واستطالة ^5، النسخي انفجار ^6،7، والاعتماد دورة الخلية ^8،9، والتوريث ^10. ومع ذلك، OBTينطوي aining سلسلة زمنية مضان وحيدة الخلية جودة تحديات تقنية كبيرة في زراعة أحادي الطبقة من الخلايا في بيئة يمكن السيطرة عليها والكمي في الإنتاجية العالية من الأفلام مضان المكتسبة. هنا، نحن تصف الإجراء إلى الحصول على وتحليل الأفلام مضان من S. الخباز مع عدم وجود الخبرة المطلوبة في خلية تصنيع جهاز الثقافة أو في مجال تطوير البرمجيات (الشكل 1).

أولا، نحن بالتفصيل بروتوكول سبيل المثال لتوليد مضان سلسلة أفلام وقت لالخميرة في مهدها التعبير عن واحد أو أكثر للصحفيين الفلورسنت. على الرغم من الغرف ثقافة ميكروفلويديك مخصصة تم بناؤها واستخدامها بنجاح ^11-13 سابقا، ونحن نستخدم جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا من CellAsic (هايوارد، كاليفورنيا). حدود خلايا الجهاز إلى نمو أحادي الطبقة ويسمح التحكم المستمر للبيئة نضح. بروتوكول المجهري نقدم وسيلة بسيطة للحصول على fluorescقد تكون بديلا الأفلام جزأين من الخميرة في مهدها، ولكن أي تعديل بروتوكول التجريبية (جهاز الثقافة حسب الطلب، وظروف وسائل الإعلام البديلة، الخ.) مما أسفر عن بيانات الفيلم مضان مماثلة لخلايا الخميرة واحد.

المقبل، ونحن الخطوط العريضة لتحليل الأفلام باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) المستندة إلى حزمة البرامج في MATLAB (ماثووركس، ناتيك، MA)، ويطلق عليها اسم واجهة المستخدم الرسومية لتحليل سريع من الإسفار السلاسل الزمنية (قلم الكتاب)، لاستخراج بيانات السلاسل الزمنية للخلايا واحدة. قلم الكتاب له سمات مشابهة لتنوعا، وحزمة برمجيات المصدر المفتوح ¹⁴ خلية-ID في بتجزئة وتتبع الخلايا واستخراج في كثافة مضان والمعلومات الهندسية. ومع ذلك، قلم الكتاب يوفر ميزات إضافية هامة. أولا، فإنه يوفر سهولة التحرير التفاعلية من تجزئة والنتائج تتبع للتحقق من دقة البيانات، بدلا من مجرد النابضة الإحصائية من آثار المنطقة ناشز بعد التحليل. وعلاوة على ذلك، فإنه يمتد إلى تحليل تلقائيا.Y المكلف النسب ونقاط دورة الخلية من الفائدة من الخميرة في مهدها. تحديد متى الأم وابنتها تقسيم لتشكيل منطقتين خلية مستقلة أمر حاسم لتحديد الخلية بأكملها (بما في ذلك أي الأم برعم متصل) القياسات طوال دورة الخلية ^8. يتكون الجناح من ثلاث وحدات لإنجاز هذه المهام. شرائح أول المناطق الخلايا استنادا إلى التناقض بين الصور مجال مشرق مركزة وغير مركزة، ويسمح للمستخدم لتحديد واختبار بصريا المعلمات تجزئة. المسارين الثاني (. باستخدام بلير وتنفيذ MATLAB Dufresne لمن كروكر وآخرون IDL الروتينية، متاحة في: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ويقيس مناطق الخلية عبر الزمن؛ تلقائيا بتعيين الأنساب، وتمكن الفحص البصري وتصحيح الخطأ. يتم تضمين واجهة المستخدم الرسومية بسيطة بالتآمر لاستعلام خصائص خلية واحدة. وحدة ثالث ينسب ظهور برعم والانقسام TIMES، وإخراج كاملة بيانات السلاسل الزمنية المحمولة، فضلا عن مشتقاتها المرة الأولى والثانية (كما تمت مناقشته في ^9). وحدة تحليل إخراج البيانات كملف نصي الفضاء بفواصل لدراسة لاحقة في البرنامج الإحصائي للاختيار. وهكذا، فإن حزمة تمكن المستخدم لاستخراج بيانات السلاسل الزمنية ذات جودة عالية من خلال واجهة رسومية. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لتقدير معدلات النسخ في الوقت الحقيقي في خلايا الخميرة في مهدها واحدة بوصفها وظيفة من دورة الخلية ^9. بينما تم تحسين وحدات للخميرة في مهدها، المعلمات أو، إذا لزم الأمر، يمكن تكييفها رمز متاحة بحرية للكائنات الحية الأخرى وأنواع الصور. قد يكون الإنقسام، وتتبع، ونسب خوارزميات مهمة محددة لأنواع التصوير وتعيين الكائن في السؤال. ويمكن الاستعاضة عن خوارزميات القائمة، ولكن ما زالت تحتفظ واجهة المستخدم الرسومية التي تتيح التفتيش سهلة الاستخدام البصرية وتصحيح الأخطاء تجزئة وتتبع دائما أن occuR مع أي خوارزمية.

Protocol

1. الحصول على أفلام المجهر الفلورسنت من خلايا الخميرة واحدة تنمو في غرفة ميكروفلويديك

1. تطعيم 1 مل سائل الإعلام SC (وسائل الإعلام الاصطناعية تعريف مع 2٪ الجلوكوز وتكملة كاملة من الأحماض الأمينية) مع خلايا من لوحة المتزايد طازجة، واحتضان الثقافة بين عشية وضحاها ~ 16 ساعة على الأسطوانة عند 30 درجة مئوية. إعداد مثل هذه الثقافة أن المباراة النهائية OD _{ل 600Nm} هو ~ 0.1 للنمو على مرحلة وسجل في وقت مبكر.
2. تمييع ثقافة كاتب حسب الحاجة وتنمو 1 مل في أنبوب اختبار جديد ل6-8 ساعات إضافية لOD _{​​ل 600Nm} = 0.1. وهذا يوفر خلايا تنمو في حالة مستقرة الغنية بالمغذيات في مناطق ذات كثافة مناسبة لتحميل في الجهاز ميكروفلويديك. (بدلا من ذلك، استبدال الخطوات 1،1-1،2 للإجراءات اللازمة لإعداد الخلايا كما هو مطلوب للتجربة.)
3. إعداد Y04C لوحة الثقافة ميكروفلويديك من CellAsic: إزالة الحل الشحن؛ شطف الآبار مع الماء المعقم، وباستخدام نظام نضح تدفق ONIXالمياه من خلال الآبار 1-6 في 6 رطل لمدة 5 دقائق لمسح القنوات. ثم، وتدفق من التحميل بشكل جيد 8 في 6 رطل لمدة 10 ثانية (قناة التحميل ديها معدلات تدفق أعلى من ذلك بكثير، وينبغي أن يتم مسح منفصل).
4. إزالة المياه من جميع الآبار واستبدالها مع 250 ميكرولتر SC في مدخل الآبار 1-6 و 50 ميكرولتر من ثقافة من الخطوة 1.2 في الخلية التحميل جيدا 8. (بدلا من ذلك، وضع وسائل الاعلام المطلوب في الآبار مدخل 1-6 للتجارب التي تتطلب التبديل بين الأوضاع المختلفة.)
5. ختم متعددة ONIX إلى لوحة، وتبدأ فتيلة القنوات وغرفة الثقافة التي تتدفق من مدخل الآبار 1-6 في 6 رطل لمدة 2 دقيقة تليها لا يقل عن 5 دقائق في 6 رطل فقط من مدخل عقد جيدا وسائل الإعلام انطلاق لل التجربة. تتدفق باستمرار حتى هذه الخطوة 1.7.
6. إعداد المجهر للتجربة. ونحن نستخدم زايس محوري Observer.Z1 widefield المجهر مع الكاميرا II EMCCD الخلفية مضاءة تتالي (Photometrics، توكسون، من الألف إلى الياء) والتجويف 200 قوس من المعدن هاليدمصباح (قبل العلمية، روكلاند، MA) لإثارة مضان الموهن إلى 10٪ لمنع photobleaching. لتقليل الوقت اللازم لاكتساب التحول في قنوات الفلورسنت متعددة، ونحن زوجين، مكعب مرشح الثلاثي ممر الموجة مزدوج اللون واحد لمرشحات الإثارة / الانبعاثات المناسبة لCFP، YFP، وطلب تقديم العروض (كروما تكنولوجيا كورب، الخوار فولز، VT، مجموعة 89006) تعيين في الخارجية، في التحول بسرعة عجلات تصفية (Ludl المنتجات الالكترونية، نوفاتو، CA).
7. ضع بضع قطرات من السائل الغمر على الهدف (إذا لزم الأمر، ونحن نستخدم زايس خطة-امزيغ 63X/1.40 DIC النفط)، وتركيب جهاز ميكروفلويديك بشكل آمن في مرحلة مجهر مقلوب. ضمان لوحة لا تحول على الإطلاق في مرحلة في كافة مراحل التجربة يحسن تتبع الخلية خلال تحليل البيانات. نحن ببساطة بتصوير لوحة إلى جبل مرحلة لمنع تحول لها.
8. التركيز على ثالث أقصى اليسار من الغرفة الثقافة الأول (حيث ارتفاع الغرفة هو أصغر) باستخدام واحدة من POSI جزءا لا يتجزأ منعلامات نشوئها. إيقاف تدفق من مدخل وسائل الإعلام بشكل جيد، وتدفق من خلية التحميل جيدا 8 في 6 رطل في 5 ثانية رشقات نارية. نقل المرحلة أن ننظر في جميع أنحاء غرفة الثقافة للخلايا. زيادة التحميل الوقت التدفق والضغط حتى يتم تحقيق كثافة الخلية المطلوبة، ولكن تجنب الحمولة الزائدة وانسداد الحاجز الموجود في أقصى اليسار حيث يدخل وسائل الإعلام الجديدة للغرفة.
9. تبدأ تتدفق من مدخل سائل الإعلام التي تحتوي كذلك وسائل الإعلام ابتداء من الساعة 6 رطل.
10. في MetaMorph (الأجهزة الجزيئية، سانيفيل كاليفورنيا) أو غيرها من التشغيل الآلي المجهر ومراقبة البرامج، إعداد اكتساب متعددة الأبعاد لالتقاط صور متعددة في مواقع متعددة المراحل مع مرور الوقت. تعيين عدد من والفاصل الزمني بين نقطة زمنية. اختر العديد من المناصب المرحلة مع ~ 10 خلايا لكل منها (أكثر سوف ازدحام بسرعة). نحن عادة استخدام 5 فترات دقيقة وصورة يصل إلى 16 وظيفة، والتي تتطلب كل ~ 11 ثانية لاقتناء في كل نقطة زمنية.
11. إعداد اقتناء بحيث في كل مرحلة موقف في كل نقطة مرة البرنامج البريد و: التركيز على مجال مشرق ضوء المنقولة (BF) الصورة باستخدام MetaMorph الذي بني في طريقة ضبط تلقائي للصورة (تنفيذ ضبط تلقائي للصورة بوصفها مجلة مخصصة مكتوب في بداية كل موقف المرحلة توفر قدرا أكبر من السيطرة على دقة التركيز)؛ اكتساب BF صورة في +1 ميكرون إلى المستوى البؤري (FP)؛ الحصول على BF من التركيز (BFOOF) الصورة في ميكرون -4 إلى FP (استخدام المجلات المخصصة مكتوبة لتغيير التركيز على النحو المطلوب بين الصور)، والحصول على واحد الرمادي صورة لكل مراسل فلوري في FP باستخدام إعدادات الأمثل لاقتناء السريع مع الحد الأدنى من photobleaching.
12. إذا لزم الأمر، يجب الحصول خلفية وتظليل الصور التصحيح لكل مراسل فلوري في منطقة من الغرفة الثقافة مع عدم وجود الخلايا.
13. إعداد برنامج تدفق للتجربة في برنامج حاسوبي لمراقبة ONIX. تبدأ في وقت واحد برنامج الاستحواذ في MetaMorph وبرنامج التدفق في برنامج حاسوبي لمراقبة ONIX.
14. في نهاية التجربة، تصحيح للأمم المتحدةحتى الخلفية والتظليل في الصور الفلورسنت (إذا لزم الأمر)، واختياريا الجمع بين. TIF الملفات لكل قناة صورة في كل موقف المرحلة إلى ملف فيلم STK (على سبيل المثال إنشاء BF، BFOOF، CFP، YFP والأفلام RFP للموضع 1 ).

2. وشكل قطعة بيانات لتتبع استخدام واجهة المستخدم الرسومية FormatData في MATLAB (الشكل 2)

1. تشغيل ملف FormatData.m في MATLAB لفتح واجهة المستخدم الرسومية إدخال البيانات. في الجزء العلوي، حدد أو استعرض للوصول إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات الصور لتعيين دليل البيانات، ومن ثم استخدام واجهة المستخدم الرسومية لتحديد أنواع البيانات وملفات الصور تسجيلها في التجربة.
2. إلى اليمين، حدد زر الاختيار بجوار "الوقت الفاصل" للإشارة إلى أي نوع من التحليل لأداء. "الوقت الفاصل" سوف يعامل صورة سلسلة على شكل سلسلة الوقت (على سبيل المثال فيلم من خلايا تنمو في غرفة ميكروفلويديك). "ثابت" سوف يعامل كل سلسلة صورة ومجموعة من لقطات مأخوذة من السكان (مثل صور متعددة المتخذة في DIFمواقف مختلفتين على عينة شريحة واحدة). في هذا الإصدار قلم الكتاب، يمكن معالجة البيانات في الوقت الفاصل بين لشغل وظائف متعددة ولكن كملف منفصل لكل منصب (راجع الخطوة 2.14).
3. ضع علامة في المربع للتسجيل الصورة لتصحيح الحركات مرحلة دقيقة عن طريق تحويل كل صورة في الأفلام لتقليل حركة الخلية واضح ضمن الإطار. ونحن نوصي بشدة هذا لأنه يحسن إلى حد كبير تتبع (الحد دليل كرأيشن المسار في وقت لاحق)، لكنه سيضيف عشوائية، "الضوضاء البيضاء" القيم بكسل لملء حيث تم تحويل الصور على الحدود. ويمكن أيضا أن يتم تحديده بعد مشاهدة الصور BF مجزأة في الخطوة 2.7 أو في أي نقطة حتى الخطوة 2.13.
4. تحقق من "برايت حقل" مربع في لوحة "بيانات القنوات". انقر فوق "تحديد" إلى اليمين لتحميل الصور BF. ل*. TIF الملفات، حدد كافة الصور BF المقابلة لفيلم واحد عن طريق الضغط على مفتاح Shift أثناء اختيار، ثم انقر فوق "فتح". ل*. الملفات STK، ما عليك سوى اختيار مكدس BF من الفائدة. إذا كانت الصور هي النجاحالاعتراف الكامل، سيتم سرد أسماء الملفات في القائمة المنبثقة إلى اليمين في "بيانات معترف بها" لوحة. . ل* TIF الملفات، تأكد تظهر أسماء الملفات بالترتيب الصحيح (حفظ الملفات مع أسماء متسلسلة خلال الاستحواذ - BF_t001، الخ).
5. تحقق من "حقل مشرق (من التركيز)" مربع واستخدم زر "اختيار" كما في الخطوة 2.4 لتحميل الملفات BFOOF، والتي سوف تكون مدرجة في الإطار إلى اليمين. (BFOOF الحصول عليها BF -4 ميكرون نسبة إلى FP في 63X شرائح جيدا.)
6. تحقق من "خلية قناع" مربع. في "قناع المصدر" لوحة، حدد زر الاختيار بجوار "الجزء BF". دفع "معلمات" زر لفتح واجهة المستخدم الرسومية تجزئة. (بدلا من ذلك، حدد فيلم قناع قبل مجزأة عن طريق اختيار زر الراديو بجانب "ملف قناع اختر" زر، الضغط على هذا الأخير، واختيار الفيلم كما في الخطوة 2.4. في هذه الحالة، ليست هناك حاجة فيلم BFOOF، و يمكن انتقل إلى الخطوة 2.8.)
7. تعيين المعلمات تجزئة مختلفة (أوصاف كل يمكن عرضإد عن طريق الضغط على "أوصاف المعلمة")، واختبار جودة تجزئة بالنقر على "اختبار" (الشكل 3). بنجاح مناطق مجزأة سوف تكون خضراء ذات حدود أرجواني. تأكد من استخدام شريط التمرير للتحقق من نقاط زمنية متعددة في الفيلم. عندما تجزئة غير مرضية، حدد "تم" للعودة المعلمات تجزئة إلى FormatData واجهة المستخدم الرسومية.
8. تحقق من "لون الصور" مربع. أدخل اسم اللون لأول قناة صورة الفلورسنت في مربع التحرير النص، ثم اضغط على "إضافة وحدد" لتحميل الملفات اللون كما في الخطوة 2.4. سيتم إضافة اسم اللون إلى مربع القائمة على اليسار، وسيتم إضافة أسماء الملفات إلى الجدول على اليمين. إذا ارتكبت خطأ في تحميل الملفات اللون، حدد اسم اللون في مربع القائمة على اليمين وانقر على "إزالة اللون" لإزالة الملفات. كرر لكل قناة لون.
9. إذا أقنعة المنطقة فرعي إضافي على أساس واحد من الألوان فلوري (على سبيل المثال fluorescently المسمى نواة → nuclوالمطلوب الأذن قناع المنطقة)، والتحقق من "اللون قناع" مربع. إذا لم يكن كذلك، انتقل إلى الخطوة 2.12. في "قناع المصدر اللون" لوحة، أدخل اسم قناع الإقليم الفرعي في مربع التحرير النص. اختيار لون من القائمة المنبثقة في "اللون قناع المصدر" لوحة (يتطلب لون قد اضيفت في الخطوة 6) ودفع "معلمات" لفتح عتبة اختبار واجهة المستخدم الرسومية.
10. تضغط على الزر "لصناعة السيارات في عتبة" لتحديد تلقائيا عتبة باستخدام طريقة أوتسو في ^15، وسوف صورة تسليط الضوء على المحميات فوق عتبة (الشكل 4). عتبة يمكن تعديلها يدويا باستخدام مربع التحرير. استخدام شريط التمرير لتأكيد عتبة هو مناسبة لجميع نقاط الوقت. عندما راض، ودفع "تم" للعودة إلى عتبة FormatData واجهة المستخدم الرسومية.
11. دفع "إضافة والقطاع" لتوليد قناع المنطقة الفرعية باستخدام وحدة عتبة تطبيقها على الصور اللون المحدد. سيتم عرض اسم قناع لون ومصدر في الجدول إلى اليسار، مع R ذات الصلةأسماء الملفات ecognized تظهر في الجدول على اليمين. (بدلا من ذلك، دفع "إضافة وحدد" لتحميل الملفات قناع شبه المنطقة مسبقة الصنع.)
12. في الجزء السفلي، تحديد أو استعرض للوصول إلى المجلد المطلوب ليتم استخدامها كدليل الحفظ.
13. اضغط على "تنسيق البيانات" لقراءة ملفات الصور (باستخدام الرمز tiffread2.m التي وضعتها فرانسوا Nedelec، متاحة في: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 )، معالجة البيانات، وإنشاء * ملف. حصيرة في المجلد المحدد. سيكون هذا الملف بمثابة مدخلات إلى ProcessTimeSeries واجهة المستخدم الرسومية.
14. كرر الخطوة 2،4-2،13 لمجموعة من الأفلام لكل منصب المرحلة.

3. خلايا المسار والأنساب عبر الزمن مع واجهة المستخدم الرسومية ProcessTimeSeries، والهوية الخوري وظائف بيتية النسب (الشكل 5)

1. تشغيل ملف ProcessTimeSeries.m في MATLAB لفتح تتبع واجهة المستخدم الرسومية. تعيين المعلمات التالية بعد فتحواجهة المستخدم الرسومية:
   • "ارتفاع الدائرة" ("ملف I / O" لوحة، اليسرى العليا) - وهذا يدل على ارتفاع للغرفة التي محاصرون الخلايا. يتم استخدامه كعقبة في تقريب حجم الخلية كما الإهليلجي 3D استنادا إلى محور الرئيسية والثانوية في المنطقة كما هو الحال في الخلية ^8.
   • "ميكرون / بكسل" ("ملف I / O" لوحة) - عامل التحويل لمعايرة بكسل لمسافة ميكرومتر في الصور بحيث يمكن حساب مساحة المقطع العرضي وحجم ميكرون في ² و ³ ميكرون، على التوالي.
   • "لوحة فلاتر" (أدناه "ملف I / O" لوحة) - مجموعة الحد الأدنى والحد الأقصى المعلمات لتصفية المناطق غير المرغوب فيه في القناع: "المنطقة" - منطقة المنطقة بالبكسل؛ "سفر الجامعة" - عامل الانحراف، أكثر دائرية كما → 0 ؛ "SF" - عامل الشكل، وأكثر دائرية كما → 1.
2. انقر على زر "تحميل الصور" في "ملف I / O" لوحة، وحدد ملف البيانات *. حصيرة من الناتج الفائدة من قبل FormatData واجهة المستخدم الرسومية. يتم تطبيق القناع المنطقة (أي أقنعة ودون الإقليمية) لكل قناة لون، ويتم إجراء عدد من القياسات المختلفة (الجدول 1). ثم يتم حفظ ملف البيانات. (إذا تحميل ملف إلى ProcessTimeSeries من دورة سابقة، وسوف أسأل ما إذا كان يجب إعادة تشغيل التحليل من البداية تنبيه:. هذا وسوف يمحو أي كرأيشن المسار أنجزت بالفعل وعلاج البيانات كما لو كانت طازجة من FormatData GUI إذا إعادة تشغيل طريق الخطأ، اضغط Ctrl + بسرعة C في إطار الأوامر MATLAB لمنع * من تنسيق ملف سابقا. حصيرة من الكتابة فوق.)
3. المقبل، وتتبع الخلايا. في لوحة "تعقب الخلايا" (بجانب لوحة "فلاتر")، تعيين المعلمات التالية:
   • "ماكس التشرد" - أقصى مسافة بالبكسل خلية يمكن السفر بين الصور المتجاورة قبل أن توصف بأنها مختلفة من الخلايا. الإزاحة العالي يعني الخوارزمية يمكن حساب لخلايا تتحرك أكثر، لكنه يزيد أيضا من تعقيد مطابقة المناطق خلية في الحشود. نبدأ في 12 و نقصان في حالة حدوث خطأ في تتبع (راجع الخطوة 3.4).
   • "طول الحد الأدنى" - الحد الأدنى لعدد الحوادث لخلية تتبع لاعتبار سلسلة بيانات صالحة. نحن نستخدم 1 إلى منع إزالة أي آثار حقيقية، ولكن يمكن زيادة هذا إذا كانت النتائج تجزئة في يدم طويلا، وآثار المنطقة زائفة.
   • "ذاكرة الإطار" - الحد الأقصى لعدد إطارات متتالية منطقة الخلية يمكن أن تختفي وأن تعطى نفس ID عندما تعود. إذا كان يختفي لمدة أطول من "ذاكرة الإطار"، سيتم منحها هوية جديدة لدى عودته. نحن نستخدم 2 للسماح المناطق ينبغي تفويتها من قبل تجزئة لل2 إطارات قبل أن يعود.
4. انقر فوق "خلايا المسار" لتعقب مناطق من إطار واحد إلى التالي باستخدام النقطة الوسطى المنطقة (بلير وتنفيذ MATLAB Dufresne من كروكر، جرير، والأسابيع IDL الروتينية، متاحة في: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ، لتعيين الأنساب للبراعم التي تظهر حديثا، وحفظ البيانات. يتم تعيين تلقائيا الأنساب من قبل دقيقةimizing المسافات بين براعم المفترضة والأمهات المحتملين في كل إطار. (إذا ظهر خطأ في إطار الأوامر MATLAB بسبب "التوافقية صعبة"، وانخفاض "ماكس التشرد" وكرر تتبع.) تغيير المعلمات في النوافذ المنبثقة عند الضرورة للبيانات الخاصة بك.
5. الإشراف المناطق وأخطاء في رقم أو تعيينات نسب مجزأة على نحو رديء باستخدام مختلف أدوات واجهة المستخدم الرسومية أو مفاتيح الاختصار (كما هو موضح في نافذة منبثقة عن طريق الضغط على زر فوق لوحة "معلومات مختارة الخلية").
   • المنزلق، "السابق صورة"، "الصورة التالية" (CTRL + يسار / يمين) - استخدامها لعرض والتنقل بين الإطارات في صورة سلسلة.
   • "صورة #" - يعرض عدد من إطار الصورة الحالية في المحاور اليسار واليمين. الانتقال إلى الإطار المحدد عن طريق كتابة رقم في الحق "صورة #" مربع التحرير.
   • "دلتا الإطار" - يظهر الفرق في عدد الإطار بين محاور اليمنى واليسرى (Δ = حق - يسار).
   • "إخفاء النص" (CTRL + T) - تبديل بين عرض معرفات خلية فيمحاور حق أم لا.
   • "إخفاء تسميات" (CTRL + L) - تبديل بين عرض معرفات خلية في محاور اليسار أو لا.
   • "قناع" القائمة المنبثقة - الاختيار بين عرض أي قناع، قناع الخلوية، أو أي أقنعة شبه المعرفة من قبل المستخدم للعرض في اللوحة اليسرى.
   • "تراكب" القائمة المنبثقة (السيطرة 1-9) - اختيار عرض BF وطبقات اللون في الإطار الأيسر. عرض BF هو الوحيد الذي تبديل طبقة BF أو إيقاف تشغيله في كلا المحورين. تبديل بين عرض أم لا عن طريق اختيار اسم تراكب في القائمة مرة أخرى ("*" ترمز يتم عرض تراكب). CTRL +1 تبديل BF تراكب، مع 2-9 تبديل وتراكب اللون في النظام.
   • "مجموعة الألوان" - استخدامها لتحديد لون للعرض تراكب. وهناك نافذة منبثقة الاستعلام التي قناة مضان لتعيين، ومن ثم سوف تظهر لوحة الألوان لتعريف المستخدم.
   • "تعديل الأقاليم والمسارات" لوحة - التحكم هذه التغييرات تأثير على قناع المنطقة الخليوي ومعلومات التتبع:
     • "مسارات التحديث" (CTRL + U) - استخدامها لإعادةتعيين معرفات الخلية. إذا تم تحديد أي خلايا في محاور الحق، فإن واجهة المستخدم الرسومية المطالبة هوية الخلية للتغيير. عندما يتم تغيير ID X إلى Y، وسيتم تغيير جميع الحالات المستقبلية من X إلى Y، وأية حالات مستقبل Y الحالي، وسيتم تبديل لاكس (أحيانا خلية واحدة ستتحول ذهابا وإيابا بين 2 معرفات، مرارا وتكرارا، وهذا ويرجع ذلك إلى تتبع تحاول استيعاب معرفات متعددة في المنطقة oversegmented بدلا من خطأ في وظيفة معرف التحديث.) خلايا متعددة يمكن اختيار وتغيير هوياتهم في وقت واحد، ولكن تأكد لإعطاء كل هوية فريدة من نوعها. لتعيين المنطقة لمعرف غير موجود في الملف الحالي، أدخل "0" وسيتم إنشاء واحد. استخدم Ctrl + W لمبادلة معرفات اثنين من الخلايا المميزة.
     • "حذف المسارات المحددة" (على Ctrl + D) - استخدامها لحذف الخلية المحددة أو المناطق خلية متعددة في محاور حق الحالية الإطار. (إذا لم يتم اختيار الخلايا، سيدفع لID.) لحذف جميع الحالات من أثر معرف بشكل دائم، والتحقق من المربع المجاور للديوليته زر المسارات المحددة (سوف النص تغيير إلى "حذف الكل"). وهذا مفيد للتخلص من المناطق غير المرغوب فيه الثابتة، ولكن الاختيار الأول إطارات المستقبل للتأكد من هوية لا تبديل لخلية صالحة أو المنطقة برعم.
     • "المناطق دمج" (CTRL + A أو M) - ينعم ويجمع بين المناطق الخلية. انقر فوق خلية أو خلايا في المحاور الحق في تحديد (المنطقة سوف تتحول حمراء إذا مختارة). ودمج في منطقة واحدة قريبة شكليا لملء الشقوق أو في مجموعات صغيرة في عداد المفقودين باستخدام عنصر على شكل قرص. سوف دمج اثنين أو أكثر من المناطق القريبة الجمع بينهما في منطقة واحدة وإعطاء أدنى ID إلى منطقة جديدة. وهذا مفيد لمناطق الإفراط في مجزأة (غالبا عندما يكون خلايا فجوات كبيرة).
     • "ارسم المنطقة" - استخدام الماوس لرسم المنطقة في المحاور الحق حيث المطلوب والنقر المزدوج وحتى النهاية. توفير معرف فريد غير موجود في مجموعة البيانات (بين 1 و 65535). إلغاء حذف عن طريق الضغط على لوحة المفاتيح.
   • "النسب تتبع" لوحة - بعد تتبع،يتم إنشاؤها تلقائيا تعيينات النسب. عندما تظهر المناطق الهوية الجديدة، يظهر معرف الخلية الجديدة باللون الوردي ويتم رسم خط أحمر في المنطقة الأم. مناطق جديدة كبيرة جدا ليكون براعم أو بعيدة جدا من الأمهات المحتملين تظهر باللون الأخضر ويتم تعيين هوية أم "نان" ("ليس رقما"، انظر الجدول 2). المناطق الموجودة عند نقطة مرة الأولى يكون لديك معرف أم "0". لإصلاح التعيينات الفردية، أدخل الأم ومعرفات برعم في مجالات تحرير النص وانقر على زر "فيكس". لمحو الأم الخلية، أدخل "0" كما أمه. وهناك طريقة أسرع هو اختيار منطقتين في الصورة الصحيحة واضغط على Ctrl + F. هذا وسوف تلقائيا تعيين المنطقة القديمة والأم والمنطقة أجدد كابنة، في حين محو أي تعيينات الأم الموجودة سابقا للخلية ابنة. تنبيه: بالنقر على "حساب الأنساب" في أي وقت وسوف حساب جميع التخصيصات النسب، بما فيها تلك التي قام المستخدم من تنسيق سابقا.
   • "الخلية المحددة المعلومات" لوحة - "الحصول على INFO "سيتم عرض بعض القياسات من مناطق مختارة في محاور الحق." القياسات ... "يسمح للمستخدم لتحديد القياسات التي يتم عرضها (وكذلك تحديد القائمة الافتراضية لعمليات أخرى مثل" تصدير البيانات "). ويمكن استخدام لتحديد هويات والأنساب (على سبيل المثال إذا كانت الخلية X لديه برعم في الزمن t، فإنه على الأرجح لا يملك برعم آخر في الوقت t + 5 دقائق) الصحيح.
   • "حفظ التغييرات" (CTRL + S) - تحديث الملف * حصيرة لتعكس التغيرات المستخدم. تستخدمها بشكل متكرر (ليس هناك تراجع وظيفة)!
   • "إنشاء مؤامرات" - يفتح GeneratePlots واجهة المستخدم الرسومية. تستخدم لرسم المعلومات بسرعة متغير اختيارها والعمليات الحسابية البسيطة للمناطق وحيدة الخلية أبرزت في المحاور اليمنى من ProcessTimeSeries واجهة المستخدم الرسومية، يعني، أو الوسط من جميع المناطق في كل إطار. وهذا يمكن أن GUI حساب المشتقات الأولى الخام، ولكن تأكد من تحديد الفاصل الزمني الصحيح في أعلى اليسار. قد تكون المؤامرات الإخراج إلى الرقم لإنقاذ عن طريق الضغط على "إنشاء الشكل".
6. إلى الإشراف البيانات بشكل صحيح: أي دمج المناطق oversegmented؛ حذف أي المناطق التي لم الاستيلاء على خلية كاملة؛ تأكد يتم تعيين بشكل صحيح العلاقات الأم برعم (يظهر خط أحمر بينهما في وقت ظهور برعم، عندما ID برعم وردي، انظر الجدول 2)، والقضاء على أي معرفات الخضراء عن طريق تحديد الهوية، تعيين المنطقة الأم، وتكليف أي الأم ("0")، أو حذف المنطقة. ستتم إضافة البيانات برعم إلى أن الأم أثناء التحليل النهائي لذلك لا دمج المنطقة برعم إلى أمه (ذلك سيؤدي الى عدم دقة تقدير حجم).
7. تفقد البصر البيانات لكل إطار حتى الوقت الأخير من الفائدة، ولكن ليس مطلوبا من السلسلة الزمنية بأكملها إذا لم تكن تستخدم الإطارات في وقت لاحق.
8. تأكد من حفظ التغييرات.
9. كرر الخطوات من 3،1-3،7 لملف *. حصيرة لكل منصب المرحلة.

4. تصدير البيانات لتحليل

1. ببساطة تصدير قياسات المنطقة الخام لكل خلية من خلال تيمه، ودفع "تصدير البيانات". يمكن تحديد القياسات من الاهتمام في واجهة المستخدم الرسومية التي يتم فتحها، وأنها سوف يكون الناتج في بفواصل الفضاء *. TXT ملف مع أسماء المتغيرات ورؤوس الأعمدة.
2. لتحليل السلاسل الزمنية للخلايا كلها على مر الزمن، وحساب المعلومات دورة الخلية، واتخاذ المشتقات، ودفع "تحليل السلاسل الزمنية". وهناك نافذة مفتوحة تسمح اختيار قياسات المصالح والمدخلات من المعلمات تحليل (الشكل 6).
3. أدخل نقطة للمرة الأخيرة من تنسيق في واجهة المستخدم الرسومية (سيتم تجاهل جميع الأطر اللاحقة). وتجانس ودورة الخلية معلمات التعيين الافتراضي تعمل بشكل جيد لدينا فرداني وسلالات مضاعفا تصويرها في فترات 5 دقائق، ولكن هذه قد تحتاج إلى أن تختلف حصول على أفضل النتائج. (تأكد من أن القيم المعلمة المناسبة من قبل يدويا تحديد الوقت في مهدها، وتقسيم لمجموعة بيانات الاختبار ومقارنة أداء خوارزمية الآلي.)
4. عندما يتم تعيين كافة المعلمات، ودفع "تحليل" إلى:
   1. سلبياتtruct صفائف لكل قياس الخام وطرح الخلفية (التي تقاس على أنها متوسط ​​كثافة المنطقة غير خلية من الإطار الأول في كل فيلم الفلورسنت، أو يمكن أن تكون محددة لحساب متوسط ​​تألق ذاتي لكل بكسل الخلية).
   2. تناسب شريحة تمهيد للمقاييس المحددة للقضاء على الضوضاء قياس عالية التردد (كما تمت مناقشته في ^9).
   3. تحديد تلقائيا ظهور برعم ومرات انقسام الخلايا لكل خلية على أساس التغيرات في المنحدر من سلسلة زمنية كما نوقش في حجم ^9. وبعد ذلك تضاف القياسات برعم لقياسات الأم بين ظهور وتقسيم كل دورة لسلسلة زمنية خلية كاملة متجاورة. كما سيتم احتساب تطبيع تقدم دورة الخلية تتراوح 0-2 من شعبة إلى شعبة.
   4. تناسب شريحة تجانس لاتخاذ مستقرة ^شارع 1 و 2 المشتقات ^{الثانية} من القياسات المحددة. (لغرض مشتقات محددة جيدا، السلاسل الزمنيةمصنوعة المستمر عبر تقسيم عن طريق تحويل البيانات لدورة الخلية التالية لتلبية نقطة النهاية للدورة السابقة.)
   5. الناتج الخام والسلاسل الزمنية ممهدة لجميع المناطق، وكلها ممهدة الخلية، مستمرة، وسلسلة زمنية متباينة كصفيف لكل قياس. العنصر الأول هو مؤشر للون خلفية الطرح، والباقي من الصف الأول يحمل معرفات الخلية، والباقي من العمود الأول هو رقم الإطار، والعناصر المتبقية عقد السلسلة الزمنية لكل خلية واحدة في العمود مع كل صف المقابلة لإطار في العمود الأول. وهناك مجموعة مماثلة من دورة الخلية سلسلة زمنية التقدم والمعلومات النسب تكون أيضا الإخراج. مجموعة "LineageArray" يحتوي على جدول مع كل صف يمثل العلاقة بين الأم وبرعم، وأول من خلال أعمدة الخامسة هي هوية الأم، برعم ID، إطار المنطقة برعم الأول، إطار في مهدها يقدر، والإطار تقسيم المقدرة. ويتم تصدير البيانات إلى ملف *. حصيرة (ملف البيانات MATLAB).

النتائج

وهناك تجربة أجريت بنجاح وتحليل السلاسل الزمنية تسفر في الغالب المستمر للخلايا كل واحد مع تعيين واقعي ظهور برعم والأوقات الانقسام. وكمثال على ذلك، أجرينا البروتوكول أعلاه مع سلالة الخميرة فرداني إبداء نسخة متكاملة من بروتين فلوري أزرق (CFP) مدفوعا التأسيسي ADH1

Discussion

يصف البروتوكول أعلاه طريقة بسيطة للحصول على وتحليل مضان بيانات السلاسل الزمنية مع خبرة محدودة في على microfluidics أو في مجال تطوير البرمجيات. فإنه يسمح احد للحصول على الوقت الفاصل بين الأفلام مضان من خلايا الخميرة واحد؛ استخراج حجم الخلية ذات الصلة والقياسات التعبير؛ تت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit