רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Summary

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

Abstract

מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה הפכה לכלי רב עוצמה בחקר תהליכים ביולוגיים רבים ברמת התא בודד. בפרט, סרטים המתארים את התלות הזמנית של ביטוי גנים לספק תובנות לגבי הדינמיקה של הרגולציה שלה, עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים לקבלת וניתוח של סרטי הקרינה של תאים בודדים. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי כדי להפיק נתונים כאלה, וממשק מבוסס MATLAB, משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה לכמת את תמונות הקרינה. מגזרי התוכנה ותאי מסלולים, מאפשרים למשתמש לאצור חזותי טעויות בנתונים, ומקצים באופן אוטומטי שושלת וזמני החלוקה. GUI נוסף מנתח את סדרת הזמן לייצר כל עקבות סלולריים, כמו גם נגזרות בפעם הראשונה והשנייה שלהם. בעוד התוכנה תוכננה עבור ס cerevisiae, מודולריות והרבגוניות שלו צריכה לאפשר לו לאo לשמש כפלטפורמה ללימוד סוגי תאים אחרים עם כמה שינויים.

Introduction

ניתוח תא בודד של ביטוי גנים שקדם את ההבנה של היבטים רבים של ויסות הגנים שלנו. תמונות סטטיות של ביטוי ניאון כתב באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופיה לספק מידע שימושי על חלוקת ביטוי תא בודד, אבל חסרה את ההיסטוריה והאבולוציה של נתוני סדרת זמן הנדרשים כדי להודיע ​​ישירות דינמיקת ביטוי גנים. מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה מציגה אמצעים כדי להשיג את שני מדידות תא בודדות ואת ההיסטוריה שלהם. ניסיוני בטכניקות ואנליטיות שונות פותחו כדי להשיג ולכמת סרטים של ביטוי ניאון כתב, ובכך הקניית תובנות תכונות ויסות הגנים (ראה ¹ לביקורת), כגון תא אל תא וריאציה ^2,3, היווצרות חיידקי persister ^4, שעתוק ייזום והתארכות ^5, תעתיק מתפוצץ ^6,7, תלות מחזור תא ^8,9, ותורשתיות ^10. עם זאת, obtסדרת זמן הקרינה aining איכות תא בודד כרוכה באתגרים טכניים משמעותיים בculturing monolayer של תאים בסביבה לשליטה וכימות בתפוקה גבוהה של הקרינה בסרטים שנרכשו. כאן, אנו מתארים הליך להשיג ולנתח את סרטי הקרינה של ס ' cerevisiae ללא ניסיון הנדרש בייצור מכשיר תרבית תאים או בפיתוח תוכנה (איור 1).

ראשית, אנו פירוט פרוטוקול דוגמה ליצירת סרטי סדרת זמן הקרינה לשמרי ניצנים הביעו אחד או יותר כתבי ניאון. למרות שכבר נבנו תאי microfluidic תרבות מותאמים אישית והועסקו בעבר בהצלחה ^11-13, אנו משתמשים במכשיר microfluidic זמין מסחרי מCellAsic (הייוורד, קליפורניה). מערכת תאי הגבולות לצמיחה monolayer ומאפשר שליטה מתמדת של סביבת זלוף. פרוטוקול מיקרוסקופיה אנו מציגים הוא אמצעי פשוט להשיג fluorescסרטי ence של שמרי ניצנים, אלא כל פרוטוקול ניסויי שונה (מכשיר תרבות מותאם אישית תנאי מדיה חלופיים, וכו '). מניבים נתונים סרט הקרינה דומים של תאי שמרים בודדים עשויים להיות תחליף.

בשלב הבא, אנו מתארים את הניתוח של הסרטים באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה בMATLAB (MathWorks, Natick, MA), המכונה GUI עבור ניתוח מהיר של סדרות עתיות הקרינה (שתלים), כדי לחלץ נתונים זמן סדרה לתאים בודדים. יש שתלי תכונות דומות לתוכנת ¹⁴ צדדי, הקוד פתוח חבילה נייד-ID בפילוח ומעקב אחר תאים וחילוץ בעוצמת הקרינה ומידע גיאומטרי. עם זאת, שתלים מספק תכונות חשובות נוספות. ראשית, היא מציעה עריכה אינטראקטיבית קלה של פילוח ותוצאות מעקב כדי לוודא דיוק הנתונים, ולא רק gating הסטטיסטי של עקבות אזור outlier לאחר ניתוח. יתר על כן, הוא מרחיב את הניתוח לautomaticallשושלת המיועדת y ונקודות מחזור תא עניין של שמרי ניצנים. קביעה כאשר האם והבת מתחלקות ליצירת שני אזורים סלולריים עצמאיים היא חיונית לקביעת תא כולו (אם לרבות כל ניצן מחובר) מדידות לאורך כל מחזור ⁸ התאים. החבילה מורכבת משלושה מודולים כדי לבצע משימות אלה. האזורים הסלולריים הקטעים הראשונים המבוססים על הניגוד בין תמונות שדה בהירות ממוקדות ולא ממוקדות, ומאפשר למשתמש להגדיר ולבחון את פרמטרים חזותי פילוח. המסילה השנייה (. באמצעות בלייר והיישום של Dufresne MATLAB של אל שגרת קרוקר et IDL, זמינה בכתובת: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/) ומודדת אזורים סלולריים דרך זמן; מקצה אוטומטית שושלות, ומאפשרת בדיקה ויזואלית ותיקון שגיאות. GUI זומם פשוט כלול לנכסי תא בודד השאילתה. המודול השלישי מייחס ניצן הופעה והחלוקה TIMES, ומוציא כפלט את כל נתוני תא סדרת הזמן, כמו גם נגזרים בפעם הראשונה והשנייה שלהם (כפי שנדון ^ב9). מודול ניתוח פלטי את הנתונים כקובץ טקסט מופרדי רווחים למחקר שלאחר מכן בתוכנה הסטטיסטית של בחירה. לפיכך, החבילה מאפשרת למשתמש לחלץ נתוני סדרת זמן באיכות גבוהות באמצעות ממשק גרפי. יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי להעריך שיעורי שעתוק בזמן אמת בתאי שמרי ניצנים בודדים כפונקציה של מחזור התא ^9. בעוד שמודולים שעברו אופטימיזציה עבור שמרי ניצנים, הפרמטרים או, במידת צורך, הקוד זמין באופן חופשי יכול להיות מותאם לאורגניזמים אחרים וסוגי תמונות. פילוח, מעקב, ושושלת אלגוריתמי הקצאה עשויים להיות ספציפיים לסוגי הדמיה הוקצתה ואורגניזם בשאלה. את האלגוריתמים הקיימים יכולים להיות מוחלפים, אבל עדיין שומרים על ממשק GUI המאפשר מעקב שגיאות שתמיד occu בדיקה ותיקון של פילוח חזותי ידידותית למשתמש וR עם כל אלגוריתם.

Protocol

1. השג סרטים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי שמרים יחיד הגוברים בלשכת Microfluidic

1. לחסן 1 תקשורת SC מ"ל (תקשורת מוגדרת סינטטי עם גלוקוז 2% ומשלים של חומצות אמינו מלא) עם תאים מצלחת גדלה טרי, דגירה תרבות הלילה ~ 16 שעות על תוף גלגלת ב 30 ° C. הכן את התרבות כזו שOD _600nm הסופי הוא ~ 0.1 לצמיחת יומן בשלב מוקדם.
2. לדלל את תרבות המתנע לפי צורך וצמיחה המחודש של 1 מ"ל במבחנה טרי 6-8 שעות נוספות לOD _600nm = 0.1. זה מספק תאים גדלים במצב יציב תזונתי עשיר בצפיפות מתאימה לטעינה למכשיר microfluidic. (לחלופין, החלף את צעדי 1.1-1.2 עם ההליך הדרושים כדי להכין את התאים כפי שנדרש לצורך הניסוי.)
3. הכן צלחת תרבות microfluidic Y04C מCellAsic: להסיר את פתרון הספנות; לשטוף את הבארות עם מים סטריליים, ובאמצעות זרימת מערכת זלוף ONIXמים באמצעות בארות 1-6 ב6 PSI ל5 דקות כדי לשטוף את הערוצים. לאחר מכן, זרימה מהטעינה גם 8 ב6 PSI ל10 שניות (יש לו את ערוץ טעינת ספיקות גבוהות הרבה יותר וצריך להיות סמוק בנפרד).
4. הסר את כל מים מהבארות ולהחליף עם SC 250 μl בכניסת בארות 1-6 ו -50 μl מהתרבות מהשלב 1.2 בתא הטעינה גם 8. (לחלופין, למקם את המדיה הרצויה בבארות כניסת 1-6 לניסויים הדורשים מיתוג בין תנאים שונים.)
5. לאטום סעפת ONIX לצלחת, ולהתחיל תחול אפיקים וחדר תרבות בזורם מכניסת בארות 1-6 ב6 PSI למשך 2 דקות ואחריו לפחות 5 דקות ב6 PSI מרק המפרצון גם מחזיק כלי התקשורת מוצאת ל ניסוי. זרימה זו ללא הרף עד שלב 1.7.
6. הכן מיקרוסקופ לצורך הניסוי. אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss Axio Observer.Z1 widefield עם מצלמה EMCCD אשד השנייה בעל תאורה אחורית (Photometrics, טוסון, אריזונה) וקשת מתכת הליד 200 לומןמנורה (לפני מדעי, רוקלנד, MA) לעירור הקרינה נחלש עד 10% כדי למנוע photobleaching. כדי למזער את זמן המעבר הנדרש לרכישה בערוצים מרובים ניאון, אנחנו זוג קוביית מסנן יחידה, משולש bandpass dichroic למסנני עירור / פליטה המתאימים לCFP, YFP, וRFP (Chroma הטכנולוגיה קורפ, מפוח פולס, VT; סט 89,006) להגדיר בגלגלי מסנן חיצוניים, מיתוג מהיר (מוצרי Ludl אלקטרוניים, Novato, קליפורניה).
7. מניחים כמה טיפות של נוזל על טבילה האובייקטיבית (אם יש צורך, אנחנו משתמשים בשמן דסק"ש Zeiss תכנית-Apochromat 63X/1.40), ולעגן את מכשיר microfluidic מאובטח בשלב של מיקרוסקופ ההפוכה. הבטחת הצלחת אינה עוברת בכלל בשלב לאורך הניסוי משפרת את מעקב תא במהלך ניתוח הנתונים. אנחנו פשוט מדביקים את הצלחת להר הבמה כדי למנוע התזוזה שלה.
8. להתמקד בשליש השמאלי של חדר התרבות הראשון (שבו הגובה הוא התא הקטן ביותר) באמצעות אחת מהחיובי המוטבעסמני tion. כבה את הזרימה ממפרצון התקשורת טובה, וזרימה מתא הטעינה גם 8 ב6 PSI בפרצי 5 שניות. הזז את הבמה כדי להסתכל סביב חדר התרבות לתאים. הגדל את זמן טעינה ולחץ זרימה עד צפיפות תאים רצויה מושגת, אך להימנע מעומס יתר וסותם את המחסום השמאלי ביותר שבו תקשורת טריות נכנסה לחדר.
9. מתחיל לזרום ממפרצון התקשורת המכיל גם את כלי התקשורת מתחילה ב 6 PSI.
10. בMetaMorph (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA) או אוטומציה מיקרוסקופית אחרת ותוכנת שליטה, ההתקנה רכישה רב ממדית לקחת מספר רב של תמונות בעמדות בשלב מרובות לאורך זמן. הגדר את מספר ומרווח הזמן בין נקודות זמן. בחר מספר תפקידי הבמה עם ~ 10 תאים כל אחד (יהיה יותר לגדוש במהירות). אנחנו בדרך כלל להשתמש בעד 16 עמדות 5 דקות במרווחים ותמונה, שבה כל דורשים ~ 11 שניות לרכישה בכל נקודת זמן.
11. התקנת הרכישה, כך שעל כל עמדה בכל שלב ה נקודת זמןתהיה תכנית דואר: להתמקד בתחום הבהיר האור המועבר (BF) תמונה באמצעות של MetaMorph מובנה בשיטת פוקוס אוטומטי (יישום פוקוס אוטומטי כיומן אישית בכתב בתחילת כל עמדת במה מספקת שליטה רבה יותר על דיוק פוקוס); לרכוש BF תמונה ב1 מיקרומטר למישור המוקד (FP); לרכוש BF מחוץ לפוקוס (BFOOF) תמונה במיקרומטר -4 לFP (שימוש אישית בכתב עת לשנות את המיקוד בין תמונות כנדרש), ולרכוש אחד בגווני אפור תמונה לכל כתב ניאון בFP באמצעות הגדרות מותאמות לרכישה מהירה עם photobleaching מינימאלי.
12. במידת צורך, להשיג תמונות רקע תיקון והצללה לכל כתב ניאון בשטח של חדר התרבות ללא תאים.
13. הכן תכנית הזרימה לניסוי בתוכנת בקרת ONIX. במקביל תחל בתכנית רכישת MetaMorph וזרימת תכנית בתוכנות שליטת ONIX.
14. בסופו של הניסוי, לתקן האו"םאפילו רקע והצללה בתמונות הניאון (במידת צורך), ולחלופין לשלב את קבצי tif. לכל ערוץ תמונה בכל עמדה בשלב לתוך קובץ סרט stk. (למשל ליצור BF, BFOOF, CFP, YFP וסרטי RFP לעמדה 1 ).

2. פורמט וקטע הנתונים למעקב באמצעות GUI FormatData בMATLAB (איור 2)

1. הפעל את קובץ FormatData.m בMATLAB כדי לפתוח את ממשק קלט נתונים. בחלק העליון, ציין או לגלוש אל התיקייה המכילה את קבצי תמונה כדי להגדיר את ספריית הנתונים, ולאחר מכן להשתמש בממשק הגרפי כדי לציין את סוגי הנתונים וקבצי תמונה שנרשמו בניסוי.
2. בצד ימין, בחר בכפתור הרדיו שליד "זמן לשגות" כדי לציין איזה סוג הניתוח לבצע. "זמן לשגות" יתייחס אל הסדרה את התמונה כסדרת זמן (למשל סרט של תאים הגדלים בתא microfluidic). "סטטי" יתייחס לכל סדרת תמונה כסדרה של תמונות שנלקחו מאוכלוסייה (לדוגמה: מספר תמונות שצולמו באונטערשיידעמדות שונות שממפים על מדגם שקופית אחת). בגרסה שתלי זו, ניתן לעבד נתוני זמן לשגות למספר רב של עמדות, אלא כקובץ נפרד לכל עמדה (ראה שלב 2.14).
3. סמנו את התיבה לרישום תמונה כדי לתקן תנועות לא מדויקות בשלב על ידי העברת כל תמונה בסרטים כדי למזער את תנועת תא נראית לעין בתוך המסגרת. אנו ממליצים בחום זה כמו שזה משפר באופן משמעותי מעקב (הפחתת אוצרות מסלול ידנית מאוחר יותר), אבל נוסיף, ערכי הפיקסלים "רעש לבן" אקראיים כדי למלא בו תמונות כבר עברו בגבול. זה יכול להיות גם נבחר לאחר צפייה בתמונות BF מפולחות בשלב 2.7 או בכל נקודה עד שלב 2.13.
4. סמנו את התיבה "ברייט פילד" בפנל "נתונים ערוצים". לחץ על "בחר" לימני כדי לטעון את תמונות BF. ל*. TIF קבצים, בחר את כל תמונות BF המתאימות לסרט אחד על ידי החזקת מקש Shift לחוץ בעת בחירה, ולאחר מכן לחץ על "פתח". עבור קבצי STK *., פשוט בחר את ערימת BF של עניין. אם התמונות הן הצלחההכיר באופן מלא, את שמות הקבצים יוצגו בתפריט הקופץ בצד ימין בפנל "נתונים המוכרים". *. לקבצים TIF, כדי להיות בטוח את שמות הקבצים מופיעים בבסדר הנכון (לשמור קבצים עם שמות רציפים במהלך רכישה - BF_t001, וכו ').
5. בדקו את "השדה הבהיר (מחוץ לפוקוס)" התיבה ולהשתמש בלחצן "בחר" כמו בשלב 2.4 לטעון את קבצי BFOOF, אשר יהיה רשום בקופץ לצד ימין. (BFOOF מתקבל כBF מיקרומטר -4 ביחס ל FP ב63x מגזרים כן.)
6. סמנו את התיבה "תא המסכה". בפנל "מסכת המקור", בחר בכפתור הרדיו שליד "BF המגזר". לחץ על כפתור "הפרמטרים" כדי לפתוח את GUI הפילוח. (לחלופין, בחר בסרט מסיכה מראש מפולח על ידי בחירה בלחצן האפשרויות שליד כפתור "בחר מסכת הקובץ", לחיצה על האפשרות השנייה, ובחירה בסרט כמו בשלב 2.4. במקרה זה, סרט BFOOF אין צורך, ו יכול לדלג על שלב 2.8).
7. הגדר את הפרמטרים פילוח השונים (תיאורים של כל ניתן להציגאד על ידי לחיצה על "תיאורי פרמטר"), ולבדוק את איכות הפילוח על ידי לחיצה על "מבחן" (איור 3). בהצלחה אזורים מפולחים יהיו ירוקים עם גבולות אדומים. הקפד להשתמש במחוון כדי לבדוק את נקודות זמן רבות בסרט. כאשר הפילוח הוא משביעת רצון, בחר "בוצע" כדי להחזיר את הפרמטרים לפילוח GUI FormatData.
8. סמנו את התיבה "צבע תמונות". הזן את שם הצבע לתמונת ניאון הערוץ הראשון בתיבת עריכת הטקסט, ולאחר מכן לחץ על "הוסף ובחר" כדי לטעון את קבצי צבע כמו בשלב 2.4. השם של הצבע יתווסף לתיבת הרשימה בצד השמאל, ואת שמות הקבצים יתווספו לשולחן בצד ימין. אם זו טעות הוא עשה בטעינת קבצי הצבע, בחר את השם של הצבע בתיבת הרשימה בצד השמאל ולחץ על "צבע הסר" כדי להסיר את הקבצים. חזור על פעולה עבור כל אחד מערוצי צבע.
9. אם מסכות אזור משנה נוספות המבוססות על אחד מצבעי הניאון (למשל כותרתו fluorescently גרעין → nuclאוזן מסיכת אזור) הן רצויה, סמן את התיבה "צבע המסכה". אם לא, דלג לשלב 2.12. בפנל "מקור מסכת הצבע", הזן את שם מסיכת אזור משנה בתיבת עריכת הטקסט. לבחור צבע מתפריט הקופץ בפנל "צבע מסיכת המקור" (דורש את הצבע שלנוסף בשלב 6) ולדחוף "פרמטרים" כדי לפתוח סף בדיקת GUI.
10. לחץ על הכפתור "Auto-הסף" כדי לקבוע באופן אוטומטי את סף שימוש בשיטה של Otsu ^15, ואת התמונה תדגיש את האזורים שהשתמרו מעל הסף (איור 4). הסף יכול להיות מותאם באופן ידני באמצעות תיבת העריכה. השתמש בפס הגלילה כדי לאשר את הסף מתאים לכל הנקודות הזמן. כשמרוצה, לדחוף "סיום" כדי לחזור לסף GUI FormatData.
11. לדחוף "הוסף ומגזר" כדי ליצור את המסיכה תת האזור באמצעות מודול הסף מוחל על תמונות הצבע שנבחרו. שם מסיכת הצבע והמקור יוצגו בטבלה משמאל, עם r הרלוונטישמות קבצי ecognized המופיעים בטבלה בצד ימין. (לחלופין, לחץ על "הוסף ובחר באפשרות" לטעון קבצי מסכה תת אזור שהוכן מראש.)
12. בתחתית, ציין או לגלוש לתיקייה הרצויה כדי לשמש כספריית השמירה.
13. לחץ "נתוני פורמט" כדי לקרוא את קבצי התמונה (באמצעות קוד tiffread2.m שפותח על ידי פרנסואה Nedelec, זמינים בכתובת: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298), מעבד את הנתונים, וליצור * קובץ. מחצלת בתיקייה שצוינה. קובץ זה ישמש כקלט לGUI ProcessTimeSeries.
14. חזור על שלב 2.4-2.13 לסט של סרטים לכל תפקיד במה.

3. תאי מסלול ושושלות לאורך זמן עם ProcessTimeSeries GUI, ומזהה סגן כומר ולתפקידי Lineage (איור 5)

1. הפעל את קובץ ProcessTimeSeries.m בMATLAB כדי לפתוח את GUI המעקב. להגדיר את הפרמטרים הבאים לאחר הפתיחהGUI:
   • "גובה קאמרי" ("קובץ I / O" פנל, שמאלי עליון) - זה מציין את הגובה של החדר שבו התאים לכודים. הוא משמש כאילוץ בקירוב נפח תא כמבוסס על הציר הראשי ומשניות של אזור התא כמו ^ב8 אליפסואיד 3D.
   • "מיקרומטר / פיקסל" ("קובץ I / O" פנל) - מקדם ההמרה לכייל פיקסל למרחק מיקרומטר בתמונות ששטח ונפח חתך ניתן לחשב במיקרומטר ^ו2 מיקרומטר ^3, בהתאמה.
   • "מסנני פנל" (להלן "קובץ I / O" פנל) - מינימום שנקבע ופרמטרים לסינון מרביים אזורי זבל במסכה: "שטח" - שטח האזור בפיקסלים; "ECC" - הגורם האקסצנטרית, עגול יותר כ→ 0 , "מדע בדיוני" - גורם צורה, עגול יותר כמו 1 →.
2. לחץ על "עומס" בתמונות "קובץ קלט / פלט" פנל, ובחר את קובץ הנתונים *. מחצלת תפוקת ריבית על ידי GUI FormatData. מסיכת האזור (וכל מסכות אזור משנה) מוחלת על כל ערוץ צבע, ומספר המדידות שונות נעשים (טבלת 1). קובץ הנתונים ואז ניצלו. (אם טעינת קובץ לתוך ProcessTimeSeries ממפגש קודם, זה ישאל אם הניתוח יש להפעיל מחדש מההתחלה זהירות:.. זו תמחק את כל אוצרות מסלול כבר הושלמו ותטפל בנתונים כאילו היו טריים מGUI FormatData אם ההפעלה מחדש בטעות, פגע Ctrl + C במהירות בחלון פקודת MATLAB כדי למנוע * אצר בעבר הקובץ. מחצלת מפני החלפה.)
3. בשלב הבא, לעקוב אחר התאים. בפנל "תאי מסלול" (בסמוך ללוח "המסננים"), להגדיר את הפרמטרים הבאים:
   • "עקירת מקס" - המרחק המרבי בפיקסלים תא יכול לנוע בין תמונות סמוכות לפני להיות מתויג כתא אחר. עקירה גבוהה יותר פירושו האלגוריתם יכול להסביר תאים נעים יותר, אבל זה גם מגביר את המורכבות של התאמת אזורים סלולריים בהמונים. אנחנו מתחילים בגיל 12 ולהקטין אם מתרחשת שגיאה במעקב (ראה שלב 30.4).
   • "זמן מזערי" - מספר המזערי של מופעים לזכר תא כדי להיחשב סדרת נתונים חוקית. אנו משתמשים ב1 כדי למנוע הסרת כל עקבות של ממש, אבל זה יכול להיות מוגבר אם תוצאות בפילוח עקבות אזור קצרות מועד, מזויפות.
   • "זיכרון פריים" - מספר מרבי של מסגרות רצופות אזור תא יכול להיעלם ולתת את אותו זיהוי כשהוא חוזר. אם זה נעלם לזמן רב יותר מאשר "זכרון מסגרת", זה יינתן תעודה חדשה עם חזרה. אנו משתמשים ב2 כדי לאפשר לאזורים שאסור להחמיץ בפילוח ל2 מסגרות לפני ההחזרה.
4. לחץ על "תאי מסלול" כדי לעקוב אחר אזורים מפריים אחד למשנהו באמצעות centroids האזור (בלייר ויישום Dufresne MATLAB של קרוקר, גריר, ושגרת IDL שבועות, זמין בכתובת: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/) , כדי להקצות שושלות לניצנים חדשים מופיעים, וכדי לשמור את הנתונים. שושלות מוקצות באופן אוטומטי על ידי דקותimizing מרחקים בין ניצנים המשוערת ואמהות פוטנציאליות בכל מסגרת. (אם שגיאה מופיעה בחלון פקודת MATLAB בשל "קומבינטוריקה הקשה", להקטין "עקירת מקס" ולחזור על מעקב.) פרמטרים שינוי בחלונות קופצים, כנחוץ לנתונים שלך.
5. לאצור אזורים גרועים מפולחים וטעויות בזיהוי או מטלות שושלת באמצעות הכלים גרפיים השונים או מקשי קיצור (שמוצג בחלון קופץ על ידי לחיצה על הכפתור מעל פנל "מידע תא הנבחר").
   • מחוון, "תמונה קודמת", "התמונה הבאה" (Ctrl + שמאל / ימין) - להשתמש כדי להציג ולעבור בין מסגרות בסדרה את התמונה.
   • "# תמונה" - מציג את מספר המסגרת של התמונה הנוכחית בצירים השמאליים וימניים. מעבר למסגרת שנקבעה על ידי הקלדת המספר שלה בצד הימין "התמונה #" תיבת עריכה.
   • "מסגרת דלתא" - מראה את ההבדל במספר מסגרת בין צירי ימין ושמאל (Δ = ימין - שמאל).
   • "הסתר טקסט" (Ctrl + T) - עובר בין הצגת תעודות הזהות בתאהצירים הנכונים או לא.
   • "תוויות הסתר" (Ctrl + L) - עובר בין הצגת תעודות הזהות של התא בצירי השמאל או לא.
   • תפריט "מסכה" קופץ - לבחור בין הצגה לא מסכה, המסכה הסלולרית, או כל משתמש שהוגדר תת מסיכות לתצוגה בלוח השמאלי.
   • תפריט קופץ "כיסוי" (Ctrl 1-9) - לבחור להציג BF ושכבות צבע במסגרת השמאלית. הצג BF הוא היחיד שמחליף את שכבת BF או לבטל בשני הצירים. לעבור בין תצוגה או לא על ידי בחירת שם השכבה בתפריט שוב ​​("*" מציין שכבה מוצגת). Ctrl +1 מחליף BF כיסוי, עם החלפת 2-9 את שכבות הצבע במטרה.
   • "צבעי סט" - להשתמש בו כדי לקבוע צבע לתצוגת שכבה. חלון קופץ יהיה השאילתה שערוץ הקרינה להגדיר, ולאחר מכן את לוח הצבעים יופיעו להגדרת משתמש.
   • "שינוי אזורים ומסלולים" לוח - אלה שולט השפעת שינויים על מסכת אזור התא ומידע עקבות:
     • "מסלולים עדכן" (Ctrl + U) - שימוש מחדשלהקצות מזהים סלולריים. אם אין תאים שנבחרו בצירים הנכונים, GUI ינחה לתא מזהה לשנות. כאשר מזהה משתנה X ל-Y, כל המופעים העתידיים של X ישתנו ל-Y, וכל מופעים עתידיים של Y הנוכחי, יועברו לX. (לעתים תא אחד יהיה לעבור קדימה ואחורה בין 2 תעודות, שוב ושוב. זה בשל המעקב מנסה להכיל את תעודות זהות מרובות באזור oversegmented ולא טעות בזיהוי פונקצית העדכון.) ניתן לבחור תאים מרובים ותעודות הזהות שלהם השתנו בו זמנית, אך הקפידו לתת לכל מזהה ייחודי. כדי להקצות אזור לזהות שאינו קיימות בקובץ הנוכחי, הזן "0" ואחד יופק. השתמש ב-Ctrl + W כדי להחליף את תעודות זהות של שני תאים מודגשים.
     • "מחק את השירים נבחרים" (Ctrl + D) - להשתמש בו כדי למחוק את התאים שנבחרו או אזורי תאים מרובים במסגרת הצירים הימנית הנוכחית. (אם אין תאים שנבחרו, ינחה את תעודת זהות.) כדי למחוק לצמיתות את כל המופעים של עקבות מזהה, סמן את התיבה לצד דהכפתור רצועות שנבחר lete (טקסט ישתנה כדי "למחוק את כל"). זה שימושי עבור להיפטר אזורי זבל מתמשכים, אבל קודם לבדוק מסגרות עתידיות לוודא זיהוי אינו עובר לתא תקף או באזור ניצן.
     • "אזורי מיזוג" (Ctrl + או M) - מחליק ומשלבים אזורים סלולריים. לחץ על תא או תאים בצירים הנכונים כדי לבחור (באזור יהפוך לאדום אם נבחר). מיזוג באזור אחד ייסגר מורפולוגית למלא סדקים או נתחים חסרים קטנים באמצעות אלמנט בצורת דיסק. מיזוג שני או יותר אזורים סמוכים ישלב אותם לאזור אחד ולתת לי מזהה הנמוך ביותר לאזור החדש. זה שימושי לאזורים מעל מפולחים (לעתים קרובות כאשר יש לי התאים vacuoles גדול).
     • "צייר האזור" - להשתמש בעכבר כדי לצייר באזור הצירים הנכונים שבו רצויים ולחץ פעמיים כדי לסיים. לספק מזהה ייחודי לא נמצא בערכת נתונים (בין 1 ל 65535). ביטול על ידי לחיצה על Delete במקלדת.
   • "מעקב אחר שושלת יוחסין" פנל - לאחר מעקב,הקצאות שושלת נוצרות באופן אוטומטי. כאשר אזורי זהות חדשים מופיעים, מזהה התא החדש מופיע בצבע ורוד וקו אדום נמשך לאזור האמא. אזורים חדשים גדולים מכדי להיות ניצנים או רחוקה מדי מאמהות פוטנציאליות מופיעים בירוק ומוקצים לאם תעודת זהות של "נאן" ("לא מספר", ראה טבלה 2). האזורים הקיימים בנקודת הזמן הראשונה שיש לי אם תעודת זהות של "0". כדי לפתור משימות בודדות, הזן את אמו ומזהי ניצן בתחומי עריכת הטקסט ולחץ על "תקן". כדי למחוק אמא של תא, הזן "0" בתור האמא שלו. שיטה מהירה יותר היא לבחור שני אזורים בתמונה הימנית ולחץ על Ctrl + F. זה יהיה באופן אוטומטי להקצות אזור המבוגר כאם ואזור החדש יותר כמו הבת, תוך מחיקה כל מטלות קיימות בעבר לאם בתו התא. זהירות: לחיצה על "חישוב שושלות" בכל עת תהיה לחשב מחדש את כל מטלות שושלת, כולל אלה שהמשתמש אצרה בעבר.
   • פנל "מידע תא הנבחר" - "קבל אניNFO "יציג כמה מדידות של האזורים הנבחרים בצירים הנכונים." מידות ... "מאפשר למשתמש לקבוע אילו מדידות מוצגים (כמו גם להגדיר את רשימת ברירת המחדל לפעולות אחרות כגון" נתוני יצוא "). ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את תעודות ושושלות (למשל, אם התא X יש ניצן בזמן t, סביר להניח שאין לה ניצן אחר בזמן t + 5 דקות) נכונות.
   • "שמור שינויים" (Ctrl + S) - עדכוני קבצים * המחצלת כדי לשקף שינויי משתמש.. משתמש לעתים קרובות (אין לבטל את הפונקציה)!
   • "צור מגרשים" - פותח את GUI GeneratePlots. נהג להתוות מידע משתנה נבחר וחישובים פשוטים לאזורי תא בודד המסומנים בצירים של GUI ProcessTimeSeries, הממוצע שלהם, או ממוצע של כל האזורים בכל מסגרת הנכונים במהירות. זה GUI יכול לחשב נגזרים ראשון מחוספס, אך הקפד לציין את מרווח הזמן הנכון בפינה השמאלית העליונה. חלקות יכולה להיות פלט נתון לשמירה על ידי לחיצה על "צור איור".
6. לאצור כראוי נתונים: למזג כל אזורי oversegmented; למחוק את כל אזורים לא לכידת התא כולו; להיות בטוח יחסי אמא ניצן מוקצים כראוי (קו אדום מופיע ביניהם בזמן הופעת ניצן, כאשר מזהה הניצן הוא ורוד, ראה טבלת 2), ולחסל את כל תעודות זהות ירוקות על ידי קביעת הזהות, הקצאת אזור אמא, לא אמא של הקצאה ("0"), או מחיקה של האזור. נתוני ניצן יתווספו לזה של האם במהלך הניתוח הסופי ולכן לא למזג אזור ניצן לאמא שלה (זה יוביל להערכת נפח לא מדויקת).
7. ראייה לבדוק נתונים עבור כל מסגרת עד למועד האחרון של עניין, אבל זה לא נדרש הזמן של הסדרה כולה, אם לא באמצעות מסגרות המאוחרות יותר.
8. הקפד לשמור את השינויים.
9. חזור על שלבי 3.1-3.7 לקובץ *. מחצלת לכל תפקיד במה.

4. יצוא נתונים לניתוח

1. פשוט לייצא למדידות אזור גלם עבור כל תא דרך טיםדואר, לדחוף "נתוני יצוא". את המדידות של עניין ניתן לבחור בממשק שנפתח, והם יהיו פלט במופרדי רווחים *. קובץ txt עם שמות משתנים כמו כותרות של עמודות.
2. כדי לנתח את סדרת הזמן עבור תאים שלמים לאורך זמן, לחשב מידע מחזור התא, ולקחת את הנגזרים, לדחוף "ניתוח סדרת זמן". יפתח חלון המאפשר בחירה של המדידות של עניין וקלט של פרמטרים ניתוח (איור 6).
3. הזן את נקודת הזמן האחרונה שאצרה בGUI (כל המסגרות הבאות תהיה להתעלם ממנה). פרמטרי הקצאת ההחלקה ומחזור תא ברירת המחדל המתאים לההפלואידים וזנים דיפלואידים צלמו ב 5 דקות במרווחים, אך אלה ייתכן שיהיו צורך להיות מגוונים לתוצאות הטובות ביותר. (בדקו שערכי הפרמטרים מתאימים באופן ידני על ידי קביעת זמן נביטה וחטיבה לערכת נתוני בדיקה והשוואה לביצועים של האלגוריתם האוטומטי.)
4. כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, לדחוף "נתח" ל:
   1. חסרונותtruct מערכים לכל מדידת גלם ולחסר רקע (כפי שנמדד בעוצמה הממוצעת של האזור שאינו התא של הפריים הראשון בכל סרט ניאון, או יכול להיות מוגדר לחשבון לautofluorescence הממוצע לפיקסל תא).
   2. Fit שגם מחליק למידות שנבחרו למדידה למנוע רעש בתדר גבוה (כפי שנדון ^ב9).
   3. באופן אוטומטי לקבוע הופעת ניצן וזמני חלוקת תא לכל תא המבוסס על שינויים בשיפוע של סדרת הזמן כאמור בנפח ^9. מדידות הניצן לאחר מכן תתווסף למדידות של האמא בין הופעתה והחלוקה כל מחזור לסדרה כל זמן תא רציף. התקדמות מחזור התא מנורמלת גם תחושב החל 0-2 מחטיבה לחטיבה.
   4. Fit שגם החלקה לקחת ^-1 יציב ו2 ^nd נגזרים של מדידות שנבחרו. (לצורך הנגזרים מוגדרים היטב, הסדרות עתיותנעשים רציף על פני החלוקה על ידי העברת נתונים עבור מחזור התא הבא כדי לפגוש את נקודת הסיום למחזור הקודם.)
   5. תפוקת גלם וסדרה מוחלקת זמן לכל האזורים, וכל תא מוחלקת, רציפה, וסדרת זמן מובחנת כמערך לכל מדידה. המרכיב הראשון הוא מדד לצבע רקע חיסור, שאר השורה הראשונה מחזיק תעודות סלולריים, שאר הטור הראשון הוא מספר המסגרת, ואת האלמנטים שנותרו להחזיק את סדרת הזמן עבור כל תא בודד בעמודה עם כל שורה מקביל למסגרת בעמודה הראשונה. מערך דומה של מידע שושלת סדרת זמן התקדמות מחזור התא וגם יהיה פלט. המערך "LineageArray" מכיל טבלה עם כל שורה מייצגת את מערכת יחסים אמא וניצן הראשון דרך העמודות חמישי הם האם מזהה, הניצן מזהה, מסגרת של אזור הניצן הראשון, מסגרת ניצנים מוערכת, ומסגרת החלוקה המשוערת. הנתונים מיוצאים לקובץ *. מחצלת (קובץ נתוני MATLAB).

תוצאות

ניסוי בוצע בהצלחה וניתח יניבו סדרת זמן מתמשכת בעיקר לתאים שלמים יחידים עם הופעת ניצן שהוקצה מציאותי ופעמי חטיבה. כדוגמה, ביצענו פרוטוקול לעיל עם זן שמרי הפלואידים להביע עותק משולב של חלבון פלואורסצנטי Cerulean (CFP) מונע על ידי האמרגן המכונן ADH1 כדי לבחון כיצד צמי...

Discussion

הפרוטוקול לעיל מתאר שיטה פשוטה לקבל ולנתח את נתוני סדרת זמן הקרינה עם ניסיון מוגבל במיקרופלואידיקה או בפיתוח תוכנה. זה מאפשר לאדם להשיג סרטי הקרינה זמן לשגות של תאי שמרים בודדים; לחלץ גודל תא רלוונטי ומדידות ביטוי; מעקב כומר ומטלות שושלת, ולנתח את ההתנהגות של תאים של?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit