Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Resumo

Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

Resumo

Microscopia de lapso de tempo de fluorescência tornou-se uma ferramenta poderosa no estudo de muitos processos biológicos ao nível de uma única célula. Em particular, os filmes que descrevem a dependência temporal da expressão gênica fornecer insights sobre a dinâmica de sua regulamentação, no entanto, existem muitos desafios técnicos para a obtenção e análise de filmes de fluorescência de células individuais. Descrevemos aqui um protocolo simples, usando um dispositivo de cultura microfluídicos disponível comercialmente para gerar esses dados e uma interface baseada em MATLAB gráfica do usuário (GUI) baseada em software para quantificar as imagens de fluorescência. Os segmentos de software e células pistas, permite ao usuário curadoria visualmente erros nos dados e automaticamente atribui linhagem e os tempos de divisão. A GUI analisa a série mais tempo para produzir vestígios de células inteiras, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo. Enquanto o software foi concebido para S. cerevisiae, a sua modularidade e versatilidade deve permitir que ele tó servir como uma plataforma para o estudo de outros tipos de células, com poucas modificações.

Introdução

Análise de uma única célula da expressão gênica tem promovido a nossa compreensão de muitos aspectos da regulação gênica. Instantâneos estáticos de expressão repórter fluorescente utilizando citometria de fluxo ou microscopia de fornecer informações úteis sobre a distribuição de expressão de uma única célula, mas falta a história ea evolução dos dados de séries temporais obrigados a informar diretamente a dinâmica de expressão gênica. Microscopia de lapso de tempo de fluorescência apresenta um meio para obter ambas as medições de uma única célula e sua história. As várias técnicas experimentais e analíticas foram desenvolvidos para a obtenção de filmes e quantificar a expressão de repórter fluorescente, comunicando assim insights características de regulação de genes (ver ¹ para uma revisão), tais como variação de célula para célula de ^2,3, a formação bacteriana persistidor ^4, transcrição iniciação e alongamento ^5, transcricional estourando ^6,7, a dependência do ciclo celular ^8,9 e herdabilidade ^10. Contudo, obtaining qualidade séries cronológicas de fluorescência de uma única célula envolve desafios técnicos significativos, em cultura de uma monocamada de células em um ambiente controlado e quantificação de elevada capacidade de os filmes de fluorescência adquiridos. Aqui, descrevemos um procedimento para obter e analisar filmes de fluorescência de S. cerevisiae sem experiência requerida na fabricação do dispositivo de cultura de células ou no desenvolvimento de software (Figura 1).

Primeiro, vamos detalhar um protocolo de exemplo para gerar filmes de séries temporais de fluorescência para a levedura de brotamento expressar um ou mais repórteres fluorescentes. Embora câmaras cultura microfluídicos personalizados foram construídas e empregada com sucesso anteriormente ^11-13, usamos um dispositivo micro disponível comercialmente a partir de CellAsic (Hayward, CA). As células do sistema limita-se a crescimento em monocamada e permite o controle permanente do meio ambiente de perfusão. O protocolo de microscopia que apresentamos é uma forma simples de se obter fluoresfilmes cia de levedura de brotamento, mas qualquer protocolo modificado experimental (um dispositivo de cultura personalizada, condições de mídias alternativas, etc.) produzindo dados do filme de fluorescência semelhantes de células de levedura único pode ser substituído.

A seguir, destacamos a análise dos filmes com uma interface gráfica de usuário (GUI) baseada em software em MATLAB (Mathworks, Natick, MA), apelidado de GUI para rápida análise de séries temporais de fluorescência (ENXERTOS), para extrair dados de séries temporais para células individuais. ENXERTOS tem características semelhantes ao versátil, open-source software pacote Cell-ID ¹⁴ na segmentação e rastreamento de células e na extração de intensidade de fluorescência e de informação geométrica. No entanto, os enxertos fornece recursos adicionais importantes. Primeiro, ela oferece edição interativa fácil de segmentação e acompanhamento dos resultados a fim de verificar a exatidão dos dados, ao invés de apenas gating estatística de traços região outlier após análise. Além disso, estende-se a análise para automatically designado linhagem e pontos de interesse da levedura de brotamento do ciclo celular. Determinar quando mãe e filha dividem para formar duas regiões de células independentes é crucial para determinar células inteiras (mãe incluindo qualquer broto conectado) medições ao longo do ciclo celular ^8. A suite é composta por três módulos para realizar essas tarefas. As primeiras regiões celulares segmentos baseados no contraste entre as imagens de campo claro foco e fora de foco, e permite ao usuário definir e testar visualmente parâmetros de segmentação. O segundo faixas (. Usando Blair e implementação de Dufresne MATLAB do Crocker et al rotina IDL, disponível em: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) e medidas de regiões celulares através do tempo; atribui automaticamente linhagens, e permite a inspeção visual e correção de erros. A GUI plotagem simples é incluído para propriedades de uma única célula de consulta. O terceiro módulo atribui bud surgimento e divisão times, células inteiras e gera dados de séries de tempo, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo (como discutido em ^9). O módulo de análise gera os dados como um arquivo de texto delimitado por espaço para o estudo subsequente no software estatístico de escolha. Assim, o pacote permite ao usuário extrair dados de alta qualidade da série de tempo através de uma interface gráfica. Nós temos utilizado este método para estimar as taxas de transcrição em tempo real em células individuais de levedura de brotamento como uma função do ciclo da célula ^9. Embora os módulos foram optimizados para a levedura de brotamento, os parâmetros, ou, se necessário, o código livremente disponíveis podem ser adaptados para outros organismos e tipos de imagem. Segmentação, Seguimento e linhagem algoritmos de atribuição pode ser específica para tipos de imagem atribuída eo organismo em questão. Os algoritmos existentes poderia ser substituído, mas ainda mantêm a interface gráfica que permite inspeção user-friendly visual e correção de erros de segmentação e rastreamento que invariavelmente ocur com qualquer algoritmo.

Protocolo

1. Obter Filmes microscopia de fluorescência de células de levedura simples que crescem em uma Câmara Microfluidic

1. Inocular 1 ml de meio SC (meio sintético definido, com 2% de glucose e complemento completo de aminoácidos) com células de uma placa recentemente crescente, e incubar a cultura durante a noite ~ 16 horas sobre um tambor de rolo a 30 ° C. Preparar a cultura de tal modo que o último é OD _600nm ~ 0,1 para um crescimento de fase log precoce.
2. Dilui-se a cultura iniciadora, conforme necessário e crescerem de 1 ml num tubo de ensaio fresco um adicional de 6-8 horas a OD _{600 nm} = 0,1. Isto proporciona células que crescem em um nutriente rico em estado estacionário, com uma densidade adequada para carregar no dispositivo de microfluidos. (Alternativamente, substitua os passos 1,1-1,2 com o procedimento necessário para preparar as células conforme necessário para o experimento.)
3. Prepare uma placa de cultura de microfluídica Y04C de CellAsic: remover a solução do transporte; lavar os poços com água estéril, e usando o fluxo do sistema de perfusão ONIXágua através de poços 1-6 em 6 psi por 5 min para liberar os canais. Em seguida, o fluxo do poço de carregamento de 8 a 6 psi durante 10 segundos (o canal de carregamento tem caudais muito mais elevados e devem ser lavados em separado).
4. Remover a água de todos os poços e substituir com 250 ul SC na entrada poços 1-6 e 50 ul da cultura do passo 1.2 em células carregamento bem 8. (Alternativamente, coloque a mídia desejada nos poços de entrada 1-6 para experimentos que necessitam de troca entre diferentes condições.)
5. Selar o colector ONIX para a placa, e começam priming dos canais e da câmara de cultura fazendo fluir entre a entrada de 6 poços 1-6 psi durante 2 min seguida por, pelo menos, 5 min a 6 psi a partir apenas da entrada bem que prendem os meios de comunicação a partir de experimento. Fluir isso continuamente até que o passo 1.7.
6. Prepare o microscópio para o experimento. Nós usamos uma Zeiss Axio Observer.Z1 widefield microscópio com uma câmera II EMCCD retro-iluminado Cascade (Photometrics, Tucson, AZ) e um 200 arco de metal-halide Lumenlâmpada (científica prévia, Rockland, MA) para a excitação de fluorescência atenuada para 10% para evitar a fotodegradação. Para minimizar o tempo necessário para a aquisição de comutação de canais múltiplos fluorescentes, que par um único cubo de filtro de passagem de banda tripla dicróico de excitação / emissão de filtros adequados para PCP, YFP e RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; conjunto 89006) , em conjunto, a comutação rápida rodas de filtros externos (Produtos eletrônicos Ludl, Novato, CA).
7. Coloque algumas gotas de fluido de imersão no objectivo (se necessário, usamos um microscópio Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 DIC óleo), e montar o dispositivo de microfluidos de forma segura na fase do microscópio invertido. Garantir a placa não muda nada no palco durante todo o experimento melhora o rastreamento de células durante a análise de dados. Nós simplesmente Tape o prato para a montagem de palco para impedir o seu deslocamento.
8. Concentre-se na terceira da esquerda da primeira câmara de cultura (em que a altura da câmara é menor) com uma posição do embutidomarcadores ção. Desligue o fluxo de entrada de mídia também, e fluxo de célula de carga bem 8 a 6 psi em 5 seg rajadas. Mova o palco para olhar ao redor da câmara de cultura de células. Aumente o tempo de carregamento e pressão de fluxo até a densidade de células desejado seja alcançado, mas evitar sobrecarregar e entupindo a barreira mais à esquerda, onde novas mídias entra na câmara.
9. Começará a fluir a partir da entrada de meios bem contendo os meios de comunicação a partir de 6 psi.
10. Em MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ou outro software de automação de microscopia e controle, configurar uma aquisição multi-dimensional para tirar várias imagens em várias posições estágio ao longo do tempo. Defina o número de e intervalo entre os períodos. Selecione várias posições palco com ~ 10 células cada (mais irá sobrecarregar rapidamente). Normalmente usamos intervalos de 5 min e imagem até 16 posições, que exigem cada ~ 11 segundos para que a aquisição em cada momento.
11. Configurar a aquisição de modo que em cada posição de fase em cada ponto ª vezprograma e vai: foco no campo brilhante luz transmitida (BF) imagem usando de MetaMorph método interno de focagem automática (que aplica o autofocus como um diário personalizado escrito no início de cada posição estágio proporciona maior controle sobre a precisão de foco); adquirir o BF imagem em um mM ao plano focal (fp); adquirir uma BF fora de foco (BFOOF) imagem em mM -4 ao fp (use revistas custom-escritas para mudar o foco, conforme exigido entre as imagens), e adquirir uma em tons de cinza imagem para cada repórter fluorescente no fp usando configurações otimizadas para a aquisição rápida de fotodegradação mínimo.
12. Se necessário, obter as imagens de fundo e de sombreamento de correcção para cada repórter fluorescente em uma área de câmara de cultura sem células.
13. Preparar o programa de fluxo para o experimento no software de controle ONIX. Simultaneamente iniciar o programa de aquisição de MetaMorph e o programa de fluxo no software de controlo ONIX.
14. No fim do experimento, corrigir unmesmo fundo e sombreamento nas imagens fluorescentes (se necessário), e, opcionalmente, combinam as. tif para cada canal de imagem em cada posição de palco para um arquivo de filme. stk (por exemplo, criar BF, BFOOF, CFP, YFP e filmes de RFP para a posição 1 ).

2. Formato e Segmento de dados para rastrear Usando o FormatData GUI em MATLAB (Figura 2)

1. Execute o arquivo FormatData.m em MATLAB para abrir a interface de entrada de dados. No topo, especificar ou navegue até a pasta que contém os arquivos de imagem para definir o diretório de dados, e então usar a interface gráfica para especificar os tipos de dados e arquivos de imagem gravados no experimento.
2. À direita, selecione o botão de rádio ao lado de "Time-lapse" para indicar que tipo de análise para executar. "Time-lapse" vai tratar a série de imagens como uma série de tempo (por exemplo, um filme de células que crescem em uma câmara microfluídicos). "Static" vai tratar cada série de imagens como um conjunto de fotografias tiradas a partir de uma população (por exemplo, várias imagens tomadas em difdiferentes posições em uma única amostra de slides). Nesta versão enxertos dados de lapso de tempo para várias posições podem ser trabalhadas, mas como um arquivo separado para cada posição (veja o passo 2.14).
3. Marque a caixa para registro de imagens para corrigir os movimentos de palco imprecisas, deslocando cada imagem nos filmes para minimizar o movimento aparente de células dentro do quadro. Recomendamos fortemente que isso, pois melhora de rastreamento (reduzindo o manual curadoria pista mais tarde), mas irá adicionar aleatórios, "ruído branco" valores de pixel para preencher onde as imagens foram transferidas na fronteira. Também poderia ser selecionado depois de visualização de imagens BF segmentadas no passo 2.7 ou em qualquer ponto até que o passo 2.13.
4. Marque a caixa "brilhante Field" no painel "Data Channels". Clique em "Select" para a direita para carregar as imagens BF. Para *. TIF, selecione todas as imagens BF correspondentes a um único filme segurando a tecla Shift enquanto seleciona e clique em "Abrir". Para *. STK arquivos, basta selecionar a pilha BF de interesse. Se as imagens são sucessoplenamente reconhecidos, os nomes de arquivos serão listados no menu pop-up à direita no "dados reconhecidos" painel. Para *. TIF, certifique-se os nomes de arquivo aparecem na ordem correta (salvar arquivos com nomes sequenciais durante a aquisição - BF_t001, etc.)
5. Marque a opção "Campo Bright (fora de foco)" caixa e use o botão "Select" como no passo 2.4 para carregar os arquivos BFOOF, que serão listados no pop-up para a direita. (BFOOF obtido como BF -4 mM em relação ao fp em 63X segmentos assim.)
6. Marque a caixa "celular Mask". No painel "Mask Source", selecione o botão de opção ao lado de "Segmento BF". Pressione o botão "Parâmetros" para abrir a GUI segmentação. (Se preferir, selecione um filme de máscara pré-segmentado, selecionando o botão de opção ao lado do botão "Select Máscara File", pressionando o último, e selecionando o filme como no passo 2.4. Neste caso, um filme BFOOF não é necessário, e pode pular para o passo 2.8.)
7. Definir os diferentes parâmetros de segmentação (descrições de cada um pode ser vistaed pressionando "As descrições dos parâmetros"), e testar a qualidade da segmentação, clicando em "Test" (Figura 3). Com sucesso regiões segmentadas será verde com magenta fronteiras. Certifique-se de usar o controle deslizante para verificar vários momentos do filme. Quando a segmentação é satisfatória, selecione "OK" para retornar os parâmetros de segmentação para o GUI FormatData.
8. Verifique o "Color Images" caixa. Digite o nome da cor para o primeiro canal de imagem fluorescente na caixa de edição de texto e, em seguida, clique em "Adicionar e selecione" para carregar os arquivos de cores como no passo 2.4. O nome da cor será adicionado à caixa de lista à esquerda, e os nomes de arquivos serão adicionados à tabela à direita. Se for cometido um erro ao carregar os arquivos de cores, selecione o nome da cor na caixa de lista à esquerda e clique em "Remover Color" para remover os arquivos. Repita para cada canal de cor.
9. Se mascara sub-região adicionais com base em uma das cores fluorescentes (por exemplo, marcado por fluorescência núcleo → nuclouvido máscara região) são desejados, marque a caixa "Color Mask". Se não, pule para o passo 2.12. No painel "Color Máscara Fonte", digite o nome máscara sub-região na caixa de edição de texto. Escolha uma cor no menu pop-up no painel "Color Máscara Fonte" (requer a cor ter sido adicionada no passo 6) e empurre "Parâmetros" para abrir um limiar testar GUI.
10. Pressione o botão "Auto-limite" para determinar automaticamente o limiar utilizando o método de Otsu ^15, ea imagem vai destacar as áreas preservadas acima do limiar (Figura 4). O limite pode ser ajustado manualmente usando a caixa de edição. Use a barra de rolagem para confirmar o limite é apropriado para todos os momentos. Quando estiver satisfeito, pressione "OK" para voltar o limite para o GUI FormatData.
11. Empurre "Adicionar e Segmento" para gerar a máscara de sub-região usando o módulo limiar aplicado às imagens de cores selecionados. O nome da máscara de cor e fonte será exibido na tabela à esquerda, com o r relevantenomes de arquivos ecognized que aparecem na tabela à direita. (Alternativamente, aperte "Adicionar e selecione" para carregar arquivos de máscara de sub-região pré-fabricados).
12. Na parte inferior, especificar ou navegue até a pasta desejada para ser usado como o diretório de salvamento.
13. Pressione "Dados Format" para ler os arquivos de imagem (usando o código tiffread2.m desenvolvido por François Nedelec, disponível em: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), processar os dados e criar um * arquivo. mat na pasta especificada. Este arquivo servirá de entrada para o GUI ProcessTimeSeries.
14. Repita o passo 2,4-2,13 para o conjunto de filmes para cada posição palco.

3. Células pista e linhagens através do tempo com ProcessTimeSeries GUI e Cura ID e Atribuições Lineage (Figura 5)

1. Execute o arquivo ProcessTimeSeries.m em MATLAB para abrir a GUI de rastreamento. Defina os seguintes parâmetros após a abertura daGUI:
   • "Altura Secção" ("File I / O" painel superior esquerdo) - que indica a altura da câmara em que as células estão presos. É usado como um constrangimento na aproximação volume da célula como um elipsóide 3D ​​com base no eixo principal e secundária da região de célula como no ponto ^8.
   • "MM / pixel" ("File I / O" painel) - o factor de conversão para calibrar a distância de pixel mM nas imagens de modo que a área de secção transversal e o volume pode ser calculada de ² mM e ³ mM, respectivamente.
   • "Painel Filters" (abaixo de "Arquivo I / O" painel) - conjunto mínimo e parâmetros máximos para filtrar regiões lixo na máscara: "Area" - Área de região em pixels; "Eclesiastes" - fator de excentricidade, mais circular como → 0 , "SF" - fator de forma, mais circular como → 1.
2. Clique em "Carregar imagens" no "File I / O" painel, e selecione o arquivo de saída interesse pela GUI FormatData dados *. Mat. A máscara região (e quaisquer máscaras sub-região) é aplicada a cada canal de cor, E um certo número de diferentes medidas são feitas (Tabela 1). O arquivo de dados é então guardada. (Se estiver carregando um arquivo em ProcessTimeSeries de uma sessão anterior, ele vai perguntar se a análise deve ser reiniciado desde o início CUIDADO:.. Isto irá apagar qualquer curadoria pista já concluída e tratar os dados como se fosse fresco do GUI FormatData Se acidentalmente reiniciado, rapidamente pressione Ctrl + C na janela de comando do MATLAB para evitar o * anteriormente com curadoria de arquivo. mat de ser substituído.)
3. Em seguida, rastrear as células. No painel "Pista Cells" (ao lado do painel "Filters"), defina os seguintes parâmetros:
   • "Max Deslocamento" - a distância máxima em pixels de uma célula podem viajar entre as imagens adjacentes antes de ser rotulado como uma célula diferente. Deslocamento maior significa que o algoritmo pode ser responsável por células que se deslocam mais, mas também aumenta a complexidade do correspondente regiões celulares em multidões. Começamos com 12 e diminuir se ocorrer um erro no rastreamento (consulte a etapa 30,4).
   • "Comprimento mínimo" - número mínimo de ocorrências para um traço de célula a ser considerada uma série de dados válido. Nós usamos uma para impedir a remoção de quaisquer vestígios reais, mas isso pode ser aumentada se os resultados de segmentação em breves traços, região espúrias.
   • "Memória Frame" - número máximo de quadros consecutivos de uma região celular pode desaparecer e ser dado o mesmo ID, quando ele retorna. Se ele desaparecer por mais de "Memória Frame", será dado um novo ID ao retornar. Usamos dois para permitir que as regiões para ser desperdiçada por segmentação por 2 quadros antes de retornar.
4. Clique em "Células Track" para controlar regiões de um quadro para a próxima usando a região centroids (Blair e Dufresne implementação MATLAB de Crocker, Grier e semanas rotina IDL, disponível em: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , para atribuir linhagens para recém aparecem botões, e para guardar os dados. Linhagens são atribuídos automaticamente por minimizing distâncias entre as papilas putativos e mães em potencial em cada quadro. (Se aparecer um erro na janela de comando do MATLAB devido a "combinatória difíceis", diminuir "Max Deslocamento" e repita rastreamento.) Alterar parâmetros nas janelas pop-up, conforme necessário para seus dados.
5. Curador regiões mal segmentadas e erros no ID ou atribuições linhagem utilizando as diversas ferramentas GUI ou teclas de atalho (mostrado em uma janela pop-up pressionando o botão acima do painel "Informações sobre a célula selecionada").
   • Slider, "Prev Imagem", "Next Imagem" (Ctrl + esquerda / direita) - usado para exibir e mover-se entre os quadros da série de imagem.
   • "Imagem #" - mostra o número do quadro da imagem atual nos eixos direito e esquerdo. Mover-se para um quadro especificado, digitando seu número na direita "Imagem #" caixa de edição.
   • "Delta frame" - mostra a diferença no número de quadros entre os eixos direito e esquerdo (Δ = direita - esquerda).
   • "Ocultar texto" (Ctrl + T) - alterna entre exibir os IDs de células emos eixos certo ou não.
   • "Ocultar rótulos" (Ctrl + L) - alterna entre exibir os IDs de celulares nos eixos da esquerda ou não.
   • "Mask" no menu pop-up - escolher entre exibir nenhuma máscara, a máscara de celular, ou qualquer sub-máscaras definidas pelo usuário para exibição no painel esquerdo.
   • Menu "Overlay" popup (Ctrl 1-9) - escolher exibir BF e camadas de cor no quadro à esquerda. Mostrar BF é o único que alterna a camada BF ligado ou desligado em ambos os eixos. Alternar entre a exibição ou não, selecionando o nome da sobreposição no menu novamente ("*" denota sobreposição é exibida). Ctrl +1 alterna BF sobreposição, com 2-9 alternando as camadas de cor em ordem.
   • "Definir Cores" - usado para determinar a cor para a exibição de sobreposição. Uma janela pop-up irá consultar qual o canal de fluorescência para definir e, em seguida, a paleta de cores aparecerá para definição do usuário.
   • "Modificar Regiões e Tracks" do painel - estes controla as alterações do efeito sobre a máscara região celular e informações de rastreamento:
     • "Update faixas" (Ctrl + U) - usar para reatribuir IDs de células. Se não houver células são selecionadas em certos eixos, o GUI vai solicitar uma ID de célula a mudar. Quando ID X é alterado para Y, todas as ocorrências futuras de X será alterado para Y, e todas as instâncias futuras do Y atual, vai ser transferido para X. (ocasionalmente uma célula irá alternar entre dois IDs, repetidamente. Este é devido ao rastreamento tentando acomodar vários IDs em uma região oversegmented ao invés de um erro na função ID atualização.) Múltiplas células podem ser selecionadas e seus IDs mudou ao mesmo tempo, mas não se esqueça de dar a cada um ID único. Para atribuir uma região com um ID que não existe no arquivo atual, digite "0" e será gerada. Use Ctrl + W para trocar os IDs de duas células em destaque.
     • "Delete Tracks Selecionados" (Ctrl + D) - usado para eliminar a célula selecionada ou várias regiões celulares no atual quadro eixos direita. (Se não houver células são selecionadas, pedirá ID.) Para apagar permanentemente todas as instâncias de um traço de identificação, marque a caixa ao lado do Delete botão faixas selecionadas (texto mudará para "Delete ALL"). Isso é útil para se livrar das regiões lixo persistentes, mas verifique primeiro futuros quadros para garantir que o ID não muda para uma célula válida ou região raiz.
     • "Mesclar Regiões" (Ctrl + A ou M) - suaviza e combina regiões celulares. Clique em uma célula ou células nos eixos a direita para seleccionar (região ficará vermelho, quando selecionado). Mesclando em uma região morfologicamente fechar para preencher rachaduras ou pequenos pedaços faltantes, usando um elemento em forma de disco. A fusão de duas ou mais regiões próximas irá combiná-los em uma região e dar o menor ID para a nova região. Isso é útil para regiões mais segmentados (muitas vezes quando as células têm grandes vacúolos).
     • "Draw região" - use o mouse para desenhar uma região nos eixos a direita onde desejadas e clique duas vezes para terminar. Fornecer um ID único não presente no conjunto de dados (entre 1 e 65535). Cancelar pressionando Delete no teclado.
   • "Lineage Rastreamento" painel - depois de rastreamento,atribuições linhagem são gerados automaticamente. Quando novas regiões ID aparecer, a nova ID de célula aparece na cor rosa e uma linha vermelha é atraída para a região da mãe. Novas regiões muito grandes para serem botões ou muito longe de potenciais mães aparecem em verde e é atribuído um ID mãe de "NaN" ("não é um número", ver Tabela 2). Regiões existentes no primeiro momento ter um ID mãe de "0". Para corrigir trabalhos individuais, entre a mãe e IDs broto nos campos de edição de texto e clique em "Fix". Para apagar a mãe de uma célula, insira "0" como sua mãe. Um método mais rápido é selecionar duas regiões na imagem da direita e pressione Ctrl + F. Isso irá atribuir automaticamente a região mais velho como a mãe ea região como a filha mais nova, ao apagar quaisquer atribuições de mãe previamente existentes para a célula filha. ATENÇÃO: Quando você clica em "Calcular Linhagens" a qualquer momento vai recalcular todas as atribuições de linhagem, incluindo aqueles que o usuário tenha previamente curadoria.
   • Painel "informações selecionadas celular" - "Get Info "irá mostrar algumas medições das regiões selecionadas nos eixos certos." Medidas ... "permite ao usuário determinar quais as medidas serão exibidas (bem como definir a lista padrão para outras operações, como" Exportar Dados "). Pode ser usado para determinar IDs e linhagens (por exemplo, se a célula X tem um botão no tempo t, é muito provável que não tem outro botão no tempo t + 5 min) corretos.
   • "Salvar alterações" (Ctrl + S) - atualiza o arquivo * mat para refletir as alterações do usuário.. Utiliza frequentemente (não há nenhuma função desfazer)!
   • "Gerar gráficos" - abre a GUI GeneratePlots. Usado para traçar rapidamente a informação variável selecionada e cálculos simples para regiões unicelulares destacados nos eixos direita do ProcessTimeSeries GUI, sua média, ou a média de todas as regiões em cada quadro. Esta GUI pode calcular derivadas primeiras difíceis, mas não se esqueça de especificar o intervalo de tempo correto, na parte superior esquerda. Parcelas pode ser a saída para uma figura para salvar pressionando "Gerar Figure".
6. Para curadoria dados corretamente: fundir quaisquer regiões oversegmented; excluir quaisquer regiões não captura toda a célula, não se esqueça relações mãe-broto estão devidamente atribuído (a linha vermelha aparece entre eles no momento da gema de emergência, quando o ID do botão é rosa, ver Tabela 2), e eliminar todos os IDs verdes fixando o ID, atribuindo a região a mãe, atribuindo nenhuma mãe ("0"), ou apagar a região. Dados Bud será adicionado ao da mãe durante a análise final, então não fundir a região bud a sua mãe (que vai levar a uma estimativa de volume imprecisa).
7. Inspecione visualmente os dados de cada quadro até o último momento de interesse, mas não é exigido de toda a série se não estiver usando os quadros posteriores.
8. Não se esqueça de salvar as alterações.
9. Repita os passos de 3,1-3,7 para o arquivo *. Mat para cada posição palco.

4. Exportação de dados para Análise

1. Para simplesmente exportar medições região matérias para cada célula através time, empurre "Exportar Dados". As medidas de interesse pode ser selecionado na GUI que se abre, e eles vão ser produzidos em um espaço delimitado *. Txt com nomes de variáveis ​​como cabeçalhos de coluna.
2. Para analisar a série histórica para células inteiras ao longo do tempo, calcular as informações do ciclo celular, e tomar derivados, empurre "Análise de Séries Temporais". Uma janela será aberta permitindo a seleção das medidas de interesse e de entrada dos parâmetros da análise (Figura 6).
3. Digite o último ponto de curadoria no GUI (todos os quadros subseqüentes serão ignorados). Os parâmetros de atribuição de alisamento e do ciclo celular padrão funcionam bem para a estirpes diplóides e haplóides fotografada em intervalos de 5 min, mas estes podem necessitar de ser variado para obter os melhores resultados. (Verificar que os valores dos parâmetros são apropriados por meio da determinação do tempo de brotamento manualmente e para a divisão de um conjunto de dados de teste e comparando o desempenho do algoritmo automatizado.)
4. Quando todos os parâmetros são definidos, empurre "Analisar" para:
   1. Contrastruct matrizes para cada medição bruta e subtrair o fundo (medido como a intensidade média da zona sem células da primeira moldura em cada filme fluorescente, ou pode ser especificada para contabilizar autofluorescência média por célula de pixel).
   2. Montar uma spline alisando com as medidas selecionadas para eliminar o ruído de medição de alta freqüência (como discutido no ^9).
   3. Determinar automaticamente surgimento gemas e os tempos de divisão celular para cada célula com base em mudanças na inclinação da série temporal de volume como discutido em ^9. As medições bud será então adicionado às medições da matriz entre a emergência e cada ciclo de divisão para uma série temporal de células inteiras contíguo. A progressão do ciclo celular normalizado também será calculada variando de 0 a 2 de divisão para divisão.
   4. Montar um alisamento spline para tomar estável 1 ^ª e 2 ^ª derivados das medições selecionados. (Para efeitos de derivados bem definidas, séries temporaissão feitos através da divisão contínua, deslocando os dados para o seguinte ciclo celular para cumprir o terminal para o ciclo anterior).
   5. Saída de séries temporais diferenciada série temporal suavizada em bruto e para todas as regiões, e suavização da célula inteira, contínuo, e como uma matriz para cada medição. O primeiro elemento é um índice de cor para subtracção de fundo, o resto da primeira linha de células mantém identificações, o resto da primeira coluna é o número de quadros, e os restantes elementos segurar a série tempo para cada célula em uma coluna com cada linha correspondente à armação na primeira coluna. Um conjunto similar de ciclo celular série tempo de evolução e as informações de linhagem também estará de saída. A matriz "LineageArray" contém uma tabela com cada linha representando uma relação mãe-bud e do primeiro ao quinto colunas são ID mãe, broto ID, quadro da região primeiro botão, quadro de brotamento estima, e um quadro divisão estimado. Os dados são exportados para um arquivo *. Mat (arquivo de dados do MATLAB).

Resultados

Uma experiência realizada com sucesso e analisados ​​trará séries temporais principalmente contínuo para células inteiras individuais com surgimento bud realisticamente atribuído e os tempos de divisão. Como exemplo, foi realizado o protocolo anteriormente referido, com uma estirpe haplóide de levedura expressando uma cópia integrada de proteína fluorescente Cerúlea (PCP), impulsionada pela constitutivo promotor ADH1 observar como o crescimento e expressão global pode variar ao longo do...

Discussão

O protocolo acima descreve um método simples de se obter e analisar fluorescência dados de séries temporais com experiência limitada em microfluídica ou no desenvolvimento de software. Ele permite a obtenção de time-lapse filmes de fluorescência das células de levedura de solteiro; extrair o tamanho da célula relevante e medições de expressão; rastreamento cura e atribuições da linhagem, e analisar o comportamento de células inteiras ao longo do tempo usando um dispositivo cultura microfluídicos comerci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit