Приобретение флуоресценции интервальной съемки бутонизации дрожжей и анализ Одноклеточный динамики с использованием ПРОТЕЗОВ

Резюме

Мы представляем простой протокол для получения флуоресцентного микроскопа фильмы растущих клеток дрожжей и на основе графического интерфейса программного пакета для извлечения одноклеточные данных временных рядов. Анализ включает в себя автоматизированные линии и временного разделения назначения интегрирована с визуальным осмотром и ручным курирование гусеничном данных.

Аннотация

Флуоресценции покадровой микроскопии стал мощным инструментом в изучении многих биологических процессов на уровне одной клетки. В частности, фильмы изображающие временную зависимость экспрессии генов дают представление о динамике ее регулирования, однако, есть много технических проблем в получении и анализе фильмов флуоресценции одиночных клеток. Здесь описан простой протокол с использованием коммерчески доступной культуры микрожидкостных устройств для получения таких данных, и MATLAB основе, графический пользовательский интерфейс (GUI) на основе пакета программного обеспечения для количественного флуоресцентного изображений. Программное обеспечение сегментов и дорожек клетки, позволяет пользователю визуально отбора с ошибками в данных, и автоматически присваивает линии и разделения времени. GUI дальнейшем анализируются временные ряды для производства целого следы клеток, а также их первые и вторые производные по времени. В то время как программное обеспечение было разработано для S. CEREVISIAE, ее модульность и универсальность должна позволить его тØ служить в качестве платформы для изучения других типов клеток, с некоторыми изменениями.

Введение

Одноклеточные анализ экспрессии генов содействовало нашему пониманию многих аспектов регуляции генов. Статические снимки флуоресцентных выражения репортера использованием проточной цитометрии или микроскопии дать полезную информацию о распределении одноклеточные выражения, но не хватает истории и эволюции временных рядов данных, необходимых для непосредственно информировать динамики экспрессии генов. Флуоресценции покадровой микроскопии представляет собой средство для получения как одноклеточные измерений и их истории. Различные экспериментальные и аналитические методы были разработаны для получения и количественной флуоресцентной фильмы выражения репортером, передавая, таким образом взглянуть на особенности регуляции генов (см. ¹ для обзора), такие как клетки к клетке изменения ^2,3, бактериальной формирования стойкая бактерия ^4, транскрипция инициирование и удлинение ^5, транскрипционные разрыва ^6,7, клеточного цикла зависимость ^{8,9, 10} и наследуемости. Тем не менее, OBTAining качество одноклеточные флуоресценции временной ряд включает в себя значительные технические проблемы в культивирования монослой клеток в контролируемой окружающей среде и в высокой пропускной количественного приобретенных фильмов флуоресценции. Здесь мы описываем процедуру для получения и анализа флуоресценции фильмов С. CEREVISIAE, без необходимого опыта в клеточной культуре производства устройства или в разработке программного обеспечения (рис. 1).

Во-первых, мы подробно пример протокола для создания фильмов флуоресценции временных рядов для начинающих дрожжей, экспрессирующих один или более флуоресцентных журналистам. Хотя индивидуальные микрожидкостной камер культуры были построены и успешно использовались ранее ^11-13, мы используем имеющиеся в продаже устройства от микрожидкостной CellAsic (Hayward, Калифорния). Система пределы клетки монослоя роста и обеспечивает постоянный контроль перфузии среды. Микроскопии протокола мы представляем собой простой способ получить fluorescENCE фильмы бутонизации дрожжи, но любое изменение экспериментальный протокол (индивидуальные устройства культуры, альтернативные условия среды и т.д.). обеспечивая такую ​​же данных флуоресценции фильм одиночных клеток дрожжей может быть замещен.

Далее мы приводим анализ фильмов с помощью графического интерфейса пользователя (GUI) на основе пакета программного обеспечения в MATLAB (Mathworks, Натик, штат Массачусетс), получивший название графический интерфейс для быстрого анализа флуоресценции временных рядов (черенки) для извлечения данных временных рядов для отдельных клеток. ПРОТЕЗОВ имеет аналогичные характеристики с универсальным, открытым исходным кодом пакета Cell-ID ¹⁴ в сегментации и отслеживания клетки и в извлечении интенсивности флуоресценции и геометрическую информацию. Тем не менее, важно ПРОТЕЗОВ предоставляет дополнительные возможности. Во-первых, он предлагает легкий интерактивного редактирования сегментации и отслеживания результатов для проверки точности данных, а не только статистические стробирования выброс регионе следов после анализа. Более того, она расширяет анализ automaticallY назначают происхождение и клеточного цикла достопримечательности бутонизации дрожжей. Определение, когда мать и дочь делятся, для формирования двух независимых регионах ячейки имеет решающее значение для определения целой клетки (мать включая любые связанные BUD) измерений в течение всего клеточного цикла ^8. Номер состоит из трех модулей для выполнения этих задач. Первая ячейка сегменты регионов на основе контраста между целенаправленной и сфокусировано яркие образы поля, а также позволяет пользователю определить и визуально проверить параметры сегментации. Вторых путей (. Блэр и использованием MATLAB реализации Dufresne о Крокер и др. рутинных IDL, по адресу: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) и измеряет ячейку регионов во времени; автоматически назначает линий, а также дает возможность визуального контроля и коррекции ошибок. Простое построение GUI включен в запрос одноклеточные свойствами. Третий модуль приписывает появление бутон и деления Tiмес, и выводит целой клетки временные ряды данных, а также их первых и вторых производных по времени (как описано в ^9). Модуль анализа выводит данные в виде разделенных пробелами текстовый файл для последующего исследования статистическим программным обеспечением выбора. Таким образом, пакет позволяет пользователю извлекать данные высокого качества времени последовательно через графический интерфейс. Мы использовали этот метод оценки в реальном времени цены транскрипции в одном перспективных дрожжевых клеток в зависимости от клеточного цикла ^9. В то время как модуль оптимизирован для начинающих дрожжи, параметров или, при необходимости, свободно доступны код может быть адаптирован для других организмов и типов изображений. Алгоритмы сегментации, отслеживания и назначения линии могут быть специфическими для типов изображений и назначен рассматриваемого организма. Существующие алгоритмы можно было бы заменить, но все еще сохраняют GUI интерфейс, который позволяет удобный визуальный контроль и коррекция сегментации и отслеживания ошибок, которые неизменно OCCUR с любым алгоритмом.

протокол

1. Получить флуоресцентная микроскопия Фильмы одиночных клеток дрожжей, растущих в Микрофлюидных палата

1. Инокулируют 1 мл среды SC (синтетический средах определенного состава с 2% глюкозы и полное дополнение аминокислот) с клетками из только что растущий пластине и инкубировали в течение ночи культуры ~ 16 часов на каток при 30 ° С. Подготовка культуры так, чтобы конечная OD _{600 нм} ~ 0,1 для ранней фазе логарифмического роста.
2. Развести закваску по мере необходимости и вырастить в 1 мл свежей пробирку дополнительно 6-8 часов в OD _{600 нм} = 0,1. Это обеспечивает клеток, растущих на богатой питательными веществами стационарном состоянии при плотности подходит для загрузки в микрожидкостных устройств. (В качестве альтернативы, замените шаги 1.1-1.2 с процедурой, необходимо подготовить клетки, необходимые для эксперимента.)
3. Подготовить Y04C микрожидкостной пластины культуры от CellAsic: снимите транспортировочные решения; промыть лунки стерильной водой, а с помощью системы перфузии ONIX потокаводы через 1-6 скважин в 6 фунтов на квадратный дюйм в течение 5 мин, чтобы смыть каналов. Затем поток от загрузки и 8 на 6 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 сек (загрузка канал имеет гораздо более высокие скорости потока и следует промыть отдельно).
4. Удалить воду из всех лунок и заменить 250 мкл SC на входе скважины 1-6 и 50 мкл культуры с шага 1,2 в ячейке загрузки и 8. (Также можно разместить нужный носитель во входной 1-6 скважин для проведения экспериментов, требующих переключения между различными условиями.)
5. Уплотнение коллектор ONIX к плите, и начинают грунтовки каналов и культуры камере течет от входной скважины в 1-6 6 фунтов на квадратный дюйм в течение 2 мин, а затем по крайней мере 5 мин при 6 фунтов на квадратный дюйм только из впускных и проведения исходной среды для эксперимента. Поток это не постоянно, пока шаг 1.7.
6. Подготовьте микроскоп для эксперимента. Мы используем Zeiss Axio Observer.Z1 широкопольных микроскоп с каскадом II задней подсветкой EMCCD камере (Фотометрия, Тусоне, штат Аризона) и 200 люмен металлогалогенных дугиЛампа (ПРИОР Научные, Rockland, MA) для возбуждения флуоресценции ослабленный до 10%, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. Чтобы свести к минимуму время переключения необходимых для приобретения в нескольких флуоресцентных каналов, мы пару одного, трех-полосовой дихроичным фильтром куба соответствующие возбуждения / испускания фильтров для CFP, YFP, и RFP (Chroma Technology Corp, сильфонные Falls, VT, набор 89006) установлен во внешнем, быстрой коммутации фильтра колесах (Ludl электронных продуктов, Новичок, CA).
7. Поместите несколько капель иммерсионной жидкости на объективные (в случае необходимости, мы используем Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 масла ДВС-синдром), и установите устройство надежно микрожидкостной в стадии инвертированного микроскопа. Обеспечение пластины не сдвигается вообще в сцене в течение всего эксперимента улучшает клеточный отслеживания в процессе анализа данных. Мы просто лента пластины к стадии монтажа с целью предотвращения его смещения.
8. Фокус на самой левой трети первой камере культуры (где высота камеры является самым маленьким) с помощью одного из встроенных положениешильдика. Отключите поток от входного СМИ Ну, а поток от нагрузки сотовой ячейки и в 8 в 6 фунтов на квадратный дюйм в 5 очередей сек. Переместить на сцену, чтобы осмотреться культуры камеру для клеток. Увеличение времени загрузки потока и давления до желаемой плотности клеток не будет достигнуто, но избегать перегрузок и засорения левый барьер, где свежие среды поступает в камеру.
9. Начать течет из впускного медиа лунку, содержащую исходное сред при 6 атм.
10. В MetaMorph (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния) или других автоматизации микроскопии и управляющее программное обеспечение, установить многомерные приобретением для съемки нескольких кадров на нескольких позициях этапе с течением времени. Установите количество и интервал между моментами времени. Выберите несколько позиций сцене с ~ 10 ячеек, каждая (больше будет переполнять быстро). Обычно мы используем 5-минутными интервалами и изображения до 16 положений, каждое из которых требуют ~ 11 секунд для приобретения в каждый момент времени.
11. Установка приобретения таким образом, чтобы на каждом этапе позиции на каждом й момент времениА Программа: сосредоточится на проходящем свете светлом поле (BF) изображения с помощью MetaMorph встроенный в автофокусом метод (осуществление автоматической фокусировки, а специально написанный журнал в начале каждого этапа положение обеспечивает больший контроль над точность фокусировки); приобрести BF Изображение на +1 мкм до фокальной плоскости (ФП); приобрести BF не в фокусе (BFOOF) изображения при -4 мкм до FP (используется специально написанный журналах менять фокусировку, между изображениями) и приобрести одну оттенках серого изображения для каждого флуоресцентного репортера на FP с использованием настроек, оптимизированный для быстрого приобретения с минимальными фотообесцвечиванию.
12. При необходимости получения изображений фона и коррекции паразитного сигнала для каждого флуоресцентного репортера в области культуры камере, без клеток.
13. Подготовка управляющих программ для эксперимента в программном обеспечении управления ONIX. Одновременно начать сбор данных в программу MetaMorph и управляющей программы в программное обеспечение управления ONIX.
14. В конце эксперимента, исправить ипдаже фон и тени в флуоресцентные изображения (при необходимости), и, возможно, объединить. TIF файлы для каждого канала изображения на каждом этапе положение в. STK видеофайла (например, создают BF, BFOOF, CFP, YFP и RFP фильмы для позиции 1 ).

2. Формат и сегмент данных для слежения с помощью FormatData GUI в MATLAB (рис. 2)

1. Запустите файл FormatData.m в MATLAB, чтобы открыть графический интерфейс ввода данных. В верхней, уточнять или перейдите в папку, содержащую файлы изображений для установки данных каталога, а затем использовать графический интерфейс для указывать типы данных и графических файлов, зарегистрированных в эксперименте.
2. Направо, установите переключатель рядом с "Покадровый", чтобы указать, какой тип анализа выполнить. "Покадровый" будет относиться к серии изображений в качестве временных рядов (например, фильм клеток, растущих в микрофлюидном камера). "Static" будут относиться друг к серии изображений в виде набора снимков, сделанных из популяции (например, несколько изображений, полученных при разferent позиции на одном образце слайдов). В этой версии трансплантатов, покадровой данных для нескольких позиций могут обрабатываться, но в виде отдельного файла для каждой позиции (см. шаг 2.14).
3. Установите флажок для регистрации изображения для коррекции неточных движений этапе путем сдвига каждого изображения в кино, чтобы минимизировать видимого движения клетки в кадре. Мы настоятельно рекомендуем это, поскольку это значительно улучшает отслеживание (снижение ручного курирование трек позже), но добавят случайных, «белый шум» значений пикселей для заполнения, где изображения были сдвинуты на границе. Это также может быть выбран после просмотра сегментированные изображения BF в пункте 2.7 или в любой момент до шага 2,13.
4. Проверьте "светлом поле" окно в "каналов передачи данных" панели. Нажмите кнопку "Выбрать", чтобы только заполнить BF изображений. Для *. TIF файлов, выбрать все BF изображения, соответствующие один фильм, удерживая клавишу Shift при выборе, то нажмите кнопку "Открыть". Для *. STK файлы, просто выберите стек BF интересов. Если изображения успехаполного признания, имена файлов будут перечислены во всплывающем меню справа в "Data опознано" панели. . * Для TIF файлов, убедитесь, что имена файлов отображаются в правильном порядке (за исключением файлов с последовательными именами во время сбора - BF_t001 и т.д.).
5. Проверьте "светлом поле (из фокус)" поле и используйте кнопку "Выбрать", как в пункте 2.4 для загрузки BFOOF файлов, которые будут перечислены во всплывающем вправо. (BFOOF получены как BF -4 мкм относительно р при 63X сегменты а.)
6. Проверьте "Сотовые Маска" коробка. В "Маска Источник" панели выберите переключатель рядом с "Сегмент БФ". Нажмите на кнопку "Параметры", чтобы открыть сегментации GUI. (В качестве альтернативы, выберите предварительно сегментированных маска фильм выбрав переключатель рядом с "Выбрать файл маски", нажатие последней, и выбор фильмов, как в пункте 2.4. В этом случае BFOOF фильм не нужен, и Можно перейти к шагу 2.8.)
7. Установить различные параметры сегментации (описания каждого можно посмотретьЭд, нажав кнопку "Описание параметров"), и проверить качество сегментации, нажав кнопку "Тест" (рис. 3). Успешно сегментированных регионов будет зеленым с пурпурным границ. Обязательно воспользуйтесь ползунком, чтобы проверить различные моменты времени в фильме. При сегментации удовлетворительное, выберите «Готово», чтобы восстановить параметры сегментации FormatData GUI.
8. Проверьте "цветных изображений" коробка. Введите название цвета первого канала флуоресцентного изображения в текстовое поле редактирования, а затем нажмите кнопку "Добавить и выберите пункт" для загрузки файлов цвета, как в пункте 2.4. Название цвета будет добавлена ​​в списке слева, и имена файлов будут добавлены в таблице справа. Если допущена ошибка при загрузке файлов цвета, выберите название цвета в списке слева и нажмите кнопку "Удалить цвет" для удаления файлов. Повторите эти действия для каждого цветового канала.
9. Если дополнительные суб-области маски на основе одного из флуоресцентных цветов (например, флуоресцентно меченных ядро → нуклухо маска региона) желательны, установите флажок "Цвет Маска" коробка. Если нет, перейдите к шагу 2,12. В "Color Mask Источник" панель, введите субрегиона маску имя в поле редактирования текста. Выберите цвет из всплывающего меню в "Color Mask Источник" панели (требуется цвета были добавлены в шаге 6) и нажмите кнопку "Параметры", чтобы открыть порог тестирования GUI.
10. Нажмите кнопку "Auto-порог" для автоматического определения порога методом Отсу ^15, и изображение будет четко определить районы сохранились выше порога (рис. 4). Порог может быть скорректирована вручную, используя поле редактирования. Используйте полосу прокрутки для подтверждения порога подходит для всех моментов времени. Когда удовлетворены, нажмите кнопку "Готово", чтобы вернуть порог FormatData GUI.
11. Нажмите кнопку «Добавить и сегмента" чтобы сгенерировать субрегиона маску, используя порог модуль применяется к выбранному цветные изображения. Название цвета маски и источника будет отображаться в таблице слева, с соответствующими Recognized имена файлов, представленных в таблице справа. (В качестве альтернативы, нажмите кнопку "Добавить и выберите", чтобы загрузить готовые субрегиона файлы маски.)
12. Внизу, укажите или выберите нужную папку для использования в качестве каталога сохранения.
13. Нажмите кнопку "Формат данных" читать файлы изображений (с использованием кода, разработанного tiffread2.m Франсуа Неделека, по адресу: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), обработка данных, а также создавать * . мат файла в указанную папку. Этот файл будет служить в качестве вклада в ProcessTimeSeries GUI.
14. Повторите шаг 2.4-2.13 для множества фильмов для каждого этапа положение.

3. Трек Клетки и линии передачи во времени с ProcessTimeSeries GUI, и хранения ID и Lineage Задания (рис. 5)

1. Запустите файл ProcessTimeSeries.m в MATLAB, чтобы открыть отслеживания GUI. Установить следующие параметры после открытияGUI:
   • "Высота камеры" ("Файл I / O" панели, вверху слева) - это свидетельствует о высоте камеры, в которой клетки в ловушке. Он используется в качестве ограничения при аппроксимации объем ячейки в качестве 3D эллипсоида на основе большой и малой оси клетки области, как и в ^8.
   • "Мкм / пиксель" ("файловый ввод / вывод" панель) - коэффициент калибровки пиксела мкм расстояние в изображениях таким образом площадь поперечного сечения и объем можно рассчитать в ² мкм и ³ мкм соответственно.
   • "Фильтры панели" (ниже "Файл I / O" панель) - минимальной и максимальной параметры, чтобы отфильтровать нежелательные регионов в маске: "Площадь" - площадь региона в пикселях; "ИКЦ" - эксцентриситет фактором, более круглым, как → 0 ; "SF" - коэффициент формы, более круглым, как → 1.
2. Нажмите кнопку "Загрузить изображения" в "File I / O" панели и выберите файл *. Мат файла данных интерес выходе FormatData GUI. Маска региона (и любой субрегион маски) наносится на каждый цветовой канал, А также ряд различных измерения производятся (табл. 1). Файл данных затем сохраняется. (При загрузке файла в ProcessTimeSeries от предыдущей сессии он будет просить, если анализ следует начать с начала. ОСТОРОЖНО:. Это удалит любой трек курирование уже завершен и рассматривать данные как если бы оно было только что из FormatData Если GUI от случайного запуска, быстро ударил Ctrl + C в окне MATLAB команду, чтобы предотвратить ранее Спонсор *. мат файл от перезаписи.)
3. Далее, отслеживать клеток. В "Track Клетки" панели (рядом с «Фильтры» панели), установите следующие параметры:
   • "Перемещения Макс" - максимальное расстояние в пикселях клетка может путешествовать между соседними изображениями, прежде чем помечены как другой ячейке. Высшее средства перемещения алгоритм может составлять клетки движется все дальше, но это также увеличивает сложность соответствующая ячейка регионов в толпу. Мы начинаем в 12 и уменьшаться в случае возникновения ошибки в отслеживании (см. шаг 30,4).
   • "Минимальная длина" - минимальное количество вхождений для ячейки след, чтобы считаться действительным рядов данных. Мы используем 1, чтобы предотвратить удаление любых реальных следов, но это может быть увеличена, если результаты сегментации в недолгим, ложные следы региона.
   • "Память кадров" - максимальное количество последовательных кадров ячейки региона может исчезнуть и иметь такой же ID, когда он возвращается. Если она исчезает дольше "в память рамки", то он будет дан новый ID по возвращении. Мы используем 2, чтобы позволить регионам будет хватать на сегментации 2 кадра, прежде чем вернуться.
4. Нажмите "Track Клетки", чтобы отслеживать регионов от одной системы отсчета к другой с помощью регионе центроидами (Блэр и Dufresne MATLAB реализации Крокер, Грир, и Недели IDL рутины, по адресу: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , назначить линий для вновь появляющиеся бутоны, и, чтобы сохранить данные. Lineages автоматически назначаются минimizing расстояния между предполагаемыми почки и потенциальных матерей в каждом кадре. (Если появляется сообщение об ошибке в окне MATLAB команду из-за "трудных комбинаторика" уменьшить "перемещения Макс" и повторить слежения.) Изменение параметров во всплывающем окне при необходимости для ваших данных.
5. Curate слабо сегментирован регионов и ошибки в линии ID или заданий с использованием различных инструментов с графическим интерфейсом или сочетания клавиш (показан в всплывающем окне, нажав на кнопку сверху "Выбранная информация Cell" панели).
   • Слайдер, "Prev Изображение", "Следующая" (Ctrl + влево / вправо) - используется для отображения и перемещения между кадрами в серии изображений.
   • "Изображение #" - показывает номер кадра текущего изображения в левом и правом направлениях. Переместить в указанный период, введите его номер в правом "Изображение #" окна редактирования.
   • "Дельта кадр" - показывает разницу в номер кадра между правой и левой осям (Δ = правый - левый).
   • "Скрыть текст" (Ctrl + T) - переключение между режимами отображения идентификаторов сот вправо осей или нет.
   • "Скрыть этикетки" (Ctrl + L) - переключает между отображением идентификаторов сот в левой оси или нет.
   • "Маска" всплывающее меню - выбор между не отображать никакой маски, клеточная маска, или любого пользовательского суб-маски для отображения в левой панели.
   • "Overlay" всплывающее меню (Ctrl +1-9) - Выберите для отображения BF и цвет слоя в левом фрейме. Показать BF является единственной, которая переключает слоя BF или выключить по обеим осям. Переключаться между выводом или нет, выбрав имя надпечатки в меню снова ("*" означает наложение отображается). Ctrl +1 переключает BF наложения, переключения с 2-9 цвета накладки в порядке.
   • "Set Colors" - использовать, чтобы определить цвет для наложения дисплее. Появится всплывающее окно будет запрашивать которые флуоресценции канал для настройки, а затем цветовой палитре появится для определения пользователя.
   • "Изменить регионов и треки" панели - эти элементы управления эффектом изменения на маске области соты и трассировки:
     • "Обновление треков" (Ctrl + U) - использовать повторноназначить идентификаторов сот. При отсутствии выделенных ячеек выбираются в правой оси, GUI запросит идентификатор соты изменить. Когда ID X изменяется на Y, все последующие экземпляры X будет изменен на Y, и все последующие экземпляры текущего Y, будет переключено на X. (Иногда одна ячейка будет переключаться между 2 идентификаторами, неоднократно. Это связано с отслеживанием пытающийся разместить несколько идентификаторов в oversegmented регионе, а не ошибка в функции ID обновления.) Несколько ячеек можно выбрать и их идентификаторы изменяются одновременно, но не забудьте, чтобы дать каждому уникальный идентификатор. Чтобы назначить региона ID, который не существует в текущем файле, введите "0" и будет сгенерирован. Используйте Ctrl + W, чтобы поменять идентификаторы двух выделенных клетках.
     • "Delete Selected Tracks" (Ctrl + D) - используется для удаления выбранной ячейки или нескольких регионах ячейку в текущей правого фрейма осей. (Если клетки не выбраны, запрашивает имя.) Для безвозвратного удаления всех экземпляров ID след, установите флажок рядом с DeLete выбранную кнопку дорожки (текст изменится на «Удалить»). Это полезно для того, чтобы избавиться от стойких регионах мусор, но сначала проверить будущих кадров, чтобы убедиться, ID не переходит в действительную ячейку или бутон региона.
     • "Объединить Регионы" (Ctrl + A или M) - разглаживает и сочетает в себе клетки регионах. Щелкните ячейку или ячейки в правой оси для выбора (регион становится красной, если выбрана). Слияние на одном регионе будет морфологически близка к заполнить трещины и небольшие отсутствующих частей помощью диска-образный элемент. Слияние двух или более близких регионах будет объединить их в одном регионе и дать наименьшим идентификатором в новом регионе. Это полезно для более сегментированных областей (часто, когда клетки имеют большие вакуоли).
     • "Нарисуй регионе", - использовать мышь, чтобы нарисовать область в правой оси при наличии желания и дважды щелкните, чтобы закончить. Введите уникальное ID нет в наборе данных (от 1 до 65535). Отменить, нажав Delete на клавиатуре.
   • "Lineage Tracking" панели - после слежения,линии заданий создаются автоматически. Когда новые регионы ID появляются, новый идентификатор соты появляется в розовые и красные линии обращается на мать региона. Новые регионы слишком велики, чтобы быть почки или слишком далеко от потенциальных матерей появляются в зеленых и присваивается идентификатор матери "NaN" ("не число", см. таблицу 2). Регионы существующих в первый момент времени есть мать ID "0". Чтобы исправить индивидуальные задания, введите мать и бутон идентификаторы в тексте поля редактирования и нажмите кнопку "Исправить". Чтобы стереть матери клетки, введите "0", как его мать. Быстрый метод заключается в выборе двух регионов на правом изображении и нажмите Ctrl + F. Это позволит автоматически назначать старших регионе, как матери, так и новые области, как дочь, в то время стирания все ранее мать поручениям в дочернюю клетку. ВНИМАНИЕ: нажав на кнопку "Рассчитать Lineages" в любое время будет пересчитывать все линии заданий, в том числе пользователь ранее куратор.
   • "Выбранный Сотовые информации" панели - "Get ЯБПО "будет отображать некоторые измерения областей выбранного в правой осей." Измерения ... "позволяет пользователю определить, какие измерения отображается (а также определить список по умолчанию для других операций, таких как« Экспорт данных »). Может быть использован определить правильные идентификаторы и линий (например, если в ячейке X имеет бутона в момент времени T, оно, скорее всего, не имеет другого бутона в момент времени T + 5 мин).
   • "Сохранить изменения" (Ctrl + S) - обновляет * мат файл, чтобы отразить изменения пользователем.. Используете чаще (нет функции отмены)!
   • "Создание участков" - открывает GeneratePlots GUI. Используется для быстрого участок выбранной переменной информации и простые расчеты для одноклеточных регионах, выделенных в правой оси ProcessTimeSeries GUI, их средний или среднее всех областей в каждом кадре. Это GUI можно вычислить грубую первых производных, но не забудьте указать правильный промежуток времени в левом верхнем углу. Земельные участки могут быть выведены на фигуру для сохранения, нажав кнопку «Создать рисунок».
6. Чтобы правильно курировать данные: объединить любой oversegmented регионов; удалять любые регионы не захватывая всю ячейку, будьте уверены, мать-буд отношений назначены должным образом (красная линия между ними возникает во время появления бутона, когда ID бутона розового см. Таблица 2), и устранить любые зеленый идентификаторов путем фиксации ID, назначение области мать, не назначение не матери ("0") или удаление регионе. Bud данные будут добавлены к этой матери во время конечном счете так не сливаются бутон региона к матери (это приведет к неточной оценке объема).
7. Осмотрите данных для каждого кадра до последнего времени интерес, но это не требуется для всего временного ряда, если не используется более поздних кадрах.
8. Будьте уверены, чтобы сохранить изменения.
9. Повторите шаги 3.1-3.7 для *. Мат файл для каждого этапа положение.

4. Экспорт данных для анализа

1. Чтобы просто экспортировать сырье измерений региона для каждой ячейки через Тимае, нажмите кнопку "Экспорт данных". Измерения интересов может быть выбран в графический интерфейс, который открывается, и они будут выводиться в разделенных пробелами *. TXT файлов с переменным имена, как заголовки столбцов.
2. Для анализа временных рядов для целых клеток с течением времени, расчета клеточного цикла информации и взять производные, нажмите кнопку "Анализ временных рядов". Откроется окно, позволяющее выбирать измерения интересов и входных параметров анализа (рис. 6).
3. Введите последней временной точки куратором в GUI (все последующие кадры будут проигнорированы). По умолчанию параметры сглаживания и клеточного цикла назначение хорошо работать для наших гаплоидных и диплоидных штаммов отображается в 5-минутными интервалами, но они, возможно, должны быть изменены для достижения наилучших результатов. (Убедитесь, что значения параметров вручную соответствующие определения бутонизации и временным разделением для набора тестовых данных и сравнение с выполнением автоматизированного алгоритма.)
4. Когда все параметры установлены, нажмите кнопку "Анализ", чтобы:
   1. Минусыtruct массивы для каждого измерения и сырые вычитания фона (измеряется как средняя интенсивность не-зоне соты первым кадром в каждой флуоресцентной кино, или может быть указана для учета средней флуоресценции на клетку пиксель).
   2. Установить сглаживание сплайна выбранных измерений устранить высокочастотный шум измерения (как описано в ^9).
   3. Автоматическое определение появления бутонов и раз деление клеток для каждой ячейки на основе изменения наклона временного ряда объему, как описано в пункте ^9. Бутон измерений будет добавлена ​​к измерениям матери между возникновением и деление каждого цикла для целого ряда смежных время клетки. Нормированные ход клеточного цикла рассчитываются также в диапазоне от 0 до 2 из деления до деления.
   4. Установить сглаживание сплайна принять стабильное ^1-й и ^2-й производных выбранных измерений. (Для целей хорошо определенных производных, временные рядывыполнены непрерывными на разделение путем сдвига данных для следующего клеточного цикла для удовлетворения конечную точку для предыдущего цикла.)
   5. Выводит в сырой и серии сглаженные временем для всех регионов и целых клетки сглаженный, непрерывной и дифференцированные временные ряды в качестве массива для каждого измерения. Первым элементом является показателем цвета для вычитания фона, остальная часть первой строки имеет идентификаторов сот, остальные первый столбец номер кадра, а остальные элементы проводить временного ряда для каждой отдельной ячейки в столбце с каждой строкой соответствующий кадр в первом столбце. Аналогичный массив клеточного цикла временных рядов и линии информация также будет выходом. Массив "LineageArray" содержит таблицу с каждой строке, представляющей мать-буд отношения и с первого по пятый столбцы матери ID, ID бутон, кадр первый регион, бутон, по оценкам, начинающий кадров, а также предполагаемая кадров дивизии. Данные экспортируются в *. Мат файла (MATLAB файл данных).

Результаты

Успешно проведен эксперимент проанализировал даст основном непрерывного времени для одно целых клеток с реально назначены появление бутонов и разделение раза. В качестве примера, мы провели выше протокол с гаплоидный штамм дрожжей, экспрессирующих интегрированную копию Серулин флу?...

Обсуждение

Выше протоколе описывается простой метод для получения и анализа данных флуоресценции временных рядов с ограниченным опытом в микрофлюидики или в разработке программного обеспечения. Это позволяет получить покадровой фильмы флуоресценции одиночных клеток дрожжей; извлечь соответс...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit