Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Özet

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Özet

Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücre düzeyinde birçok biyolojik süreçlerin çalışmada güçlü bir araç haline gelmiştir. Özellikle, gen ifadesinin zamansal bağımlılığı gösteren film kendi düzenleme dinamikleri ilişkin bilgi sağlar, ancak tek hücre floresan film elde ve analiz için birçok teknik zorluklar vardır. Biz burada bu tür veri oluşturmak için ticari olarak satılan mikroakışkan kültür cihaz kullanarak basit bir protokol ve bir MATLAB tabanlı, grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı yazılım paketi floresan görüntüleri ölçmek için açıklar. Yazılım bölümleri ve parça hücreleri kullanıcı görsel veri hataları barındırmalarına sağlar, ve otomatik olarak soy ve bölme kez atar. GUI daha bütün bir hücre izleri yanı sıra birinci ve ikinci zaman türevleri üretmek için zaman serisi analiz eder. Yazılım S. tasarlanmış iken cerevisiae, modülerlik ve çok yönlü t izin vermelidirbirkaç değişiklik ile diğer hücre tipleri eğitim için bir platform olarak hizmet o.

Giriş

Gen Tek hücre analizi gen regülasyonu birçok açıdan bizim anlaşılmasını kolaylaştırdı. Akım sitometri veya mikroskopi kullanılarak floresan muhabiri ifade statik anlık tek hücreli ifade dağılımı hakkında yararlı bilgiler sağlar, ancak tarih ve doğrudan gen dinamikleri bilgilendirmek için gerekli zaman serisi verileri evrimi eksikliği. Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücreli ölçümleri ve tarih hem de elde etmek için bir araç sunar. Çeşitli deneysel ve analitik teknikler böylece, hücre-hücre varyasyon ^2,3, bakteriyel persister oluşumu ^4, transkripsiyon gibi gen regülasyonu özellikleri içine anlayışlar (bir yorum için ¹⁾ aktarmanın, floresan muhabiri ifade film elde etmek ve ölçmek için geliştirilmiştir başlatılması ve uzama ^{5, 6,7} patlama transkripsiyonel, hücre döngüsü bağımlılık ^8,9, ve kalıtım ^10. Bununla birlikte, OBT'ninAining kaliteli tek hücreli floresan zaman serisi kültür önemli teknik sorunlar kontrol edilebilir bir ortam ve elde edilen floresan filmleri yüksek verimli miktarının bir hücre tek tabaka içerir. Burada, S. floresan film elde etmek ve analiz etmek için bir prosedür tarif hücre kültürü cihaz üretiminde veya yazılım geliştirme hiç gerekli deneyimi (Şekil 1) ile cerevisiae.

İlk olarak, ayrıntılı bir örnek protokolü bir veya daha fazla floresan gazetecilere ifade tomurcuklanan maya için floresan zaman serisi film oluşturmak için. Özel mikroakışkan kültür odaları inşa edilmiş ve başarılı bir şekilde daha önce ^11-13 istihdam edilmiştir rağmen, biz CellAsic (Hayward, CA) bir ticari mikroakışkan cihazı kullanın. Sistem, tek tabaka sınırları büyüme hücreleri ve perfüzyon ortamının sürekli olarak kontrol edilmesini sağlar. Biz mevcut mikroskopi protokolü fluoresc elde etmek için basit bir araçtırence tomurcuklanan maya film, ancak herhangi bir değişiklik deney protokolünde (özelleştirilmiş bir kültür cihaz, alternatif medya koşulları, vb.) tek maya hücrelerinin benzer floresan film veri verimli ikame edilebilir.

Sonra, zaman serisi veri ayıklamak için bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı MATLAB yazılım paketi (Mathworks, Natick, MA), Floresans Zaman Serisi Hızlı Analizi (GREFTLERİ) için GUI adlandırılan, kullanarak filmlerin analizi anahat tek hücreler için. GREFTLERİ hücreleri segmentlere ve izleme ve floresan ve geometrik bilgileri ayıklamak en çok yönlü, açık kaynak yazılım paketi Hücre-ID ¹⁴ benzer özelliklere sahiptir. Ancak, GREFTLERİ önemli ek özellikler sağlar. İlk olarak, segmentasyon ve veri doğruluğunu, yerine analizden sonra aykırı bölge izleri sadece istatistiksel yolluk doğrulamak için izleme sonuçlarının kolay interaktif düzenleme sunmaktadır. Ayrıca, automaticall için analizi uzanıry adayı soy ve tomurcuklanan maya ilgi hücre döngüsü noktaları. Anne ve kızı iki bağımsız hücre bölge oluşturmak için bölmek zamanını belirleme tüm hücre (herhangi bir bağlı tomurcuk gibi anne) hücre döngüsü ⁸ boyunca ölçümleri belirlemek için çok önemlidir. Suite bu görevleri yerine getirmek için üç modülden oluşmaktadır. Odaklı ve odaklanmamış parlak bir alan görüntüler arasında kontrast dayanan ve ilk bölümleri hücre bölgeleri kullanıcı segmentasyonu parametrelerini tanımlamak ve görsel olarak test etmenizi sağlar. İkinci (. Mevcut Blair ve Crocker ve ark IDL rutin Dufresne'nin MATLAB uygulaması kullanarak,: parça http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ve zaman içinde hücre bölgelerde önlemler; otomatik soy atar ve görsel denetim sağlar ve hata düzeltme. Basit bir komplo GUI sorgu tek hücreli özelliklerine dahildir. Üçüncü modül tomurcuk ortaya çıkması ve bölme ti bağlıyormes, ve tüm hücre zaman serisi verilerin yanı sıra ilk ve ikinci kez türevleri (as ⁹ ele) verir. Analiz modülü tercih istatistiksel yazılım sonraki çalışma için bir boşluk ayrılmış metin dosyası olarak veri verir. Böylece paketi kullanıcı bir grafik arayüz üzerinden yüksek kaliteli zaman serisi veri ayıklamak sağlar. Biz hücre döngüsü ⁹ bir fonksiyonu olarak tek tomurcuklanan maya hücreleri gerçek zamanlı transkripsiyon oranları tahmin etmek için bu yöntemi kullandık. Modüllerin tomurcuklanma maya, parametreleri veya için optimize edilmiş olsa da, gerekirse, serbestçe kullanılabilir kod diğer organizmalar ve resim tipleri için adapte edilebilir. Segmentasyon, izleme, ve soy atama algoritmaları atanan görüntüleme ve söz konusu organizmanın türlerine özgü olabilir. Mevcut algoritmaları yerine, ama yine de kullanıcı dostu görsel denetim ve segmentasyon düzeltme ve her zaman istediğimiz an izleme hataları sağlar GUI arayüzü korumak olabilirherhangi bir algoritma ile r.

Protokol

1. Bir mikroakışkan Odası büyüyen Tek Maya Hücre Floresan Mikroskopi Filmler edinin

1. Bir taze büyüyen hücreler plakadan 1 ml SC ortamı (% 2 glukoz ve amino asitlerin tam tamamlayıcı sentetik tanımlı medya) aşılamak ve 30 ° C de bir silindir tambur üzerinde ~ 16 saat kültürü bir gece inkübe Son OD _600Nm erken log faz büyüme için ~ 0,1 olduğu kültür gibi hazırlayın.
2. OD _600Nm = 0.1 için marş gerektiği gibi kültür ve yeni bir test tüpünde regrow 1 ml ilave 6-8 saat sulandırmak. Bu mikroakışkan cihaz anında yüklenmeye uygun bir yoğunlukta bir besin açısından zengin kararlı büyüyor hücreleri sağlar. (Alternatif olarak, deneme için gerekli olan hücreleri hazırlamak için gerekli olan işlem adımları ile 1.1-1.2 değiştirin.)
3. CellAsic bir Y04C mikroakışkan kültür plaka hazırlayın: nakliye çözüm kaldırmak; steril su ile kuyu durulayın ve ONIX perfüzyon sistem akış kullanarakkanalları temizlemek için 5 dakika boyunca 6 psi kuyu 1-6 yoluyla su. Daha sonra, 10 saniye (yükleme kanal çok daha yüksek akış oranları ve ayrı ayrı yıkanmalıdır) için 6 psi de yükleme 8 akışı.
4. Tüm kaynaklardan gelen suyu çıkarmak ve de 8 yükleme hücreye girişi 250 ul SC kuyu 1-6 ve adım 1.2 'den 50 ul kültür ile değiştirin. (Alternatif olarak, farklı koşullar arasında geçiş gerektiren deneyler için giriş kuyu 1-6 istenen ortam yerleştirin.)
5. Plakasına ONIX manifoldu Seal ve iyi için başlangıç ​​ortam tutan yalnızca giriş 6 psi 'de en azından 5 dakika, ardından 2 dakika boyunca 6 psi giriş kuyu 1-6 akan astar kanalları ve kültür odası başlar deney. Adım 1.7 kadar sürekli bu Akış.
6. Deney için mikroskop hazırlayın. Biz bir Cascade II arka aydınlatmalı EMCCD kamera (Fotometrik, Tuscon, AZ) ile bir Zeiss Axio Observer.z1 Geniş açılı, mikroskop kullanımı ve Lümen 200 metal halide arkphotobleaching önlemek için% 10 zayıflatılmış floresan uyarma için lamba (ÖNCE Bilimsel, Rockland, MA). Birden fazla floresan kanallarda elde etmek için gerekli geçiş süresini en aza indirmek için, çift CFP, YFP ve RFP için uygun uyarma / emisyon filtreleri tek, üç-bant geçiren çift renkli filtre küp (Değeri 89006 Chroma Technology Corp, Falls, VT Bellows) dış, hızlı geçiş filtresi jantlar (Ludl Elektronik Ürünler, Novato, CA) ayarlayın.
7. Objektif (gerekirse, biz bir Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Yağ DIC kullanın) daldırma sıvı birkaç damla koyun ve ters mikroskop aşamasında güvenli mikroakışkan cihaz monte edin. Plaka deney boyunca aşamasında hiç kaymamasını sağlamak veri analizi sırasında cep izleme artırır. Biz sadece kendi değişen önlemek için sahne montaj için plaka kayda alıyoruz.
8. Gömülü pozisyonuna birini kullanarak ilk kültür odası en soldaki üçüncü (odası yüksekliği küçük olduğu) odaklanıntion işaretleri. De medya girişinden akış kapatın ve hücreden akış 5 saniye patlamaları 6 psi iyi 8 yükleme. Hücreleri için kültür odası etrafına bakmak için hareket ettirin. Istenilen hücre yoğunluğu elde edilene kadar akış süresi ve basınç yükleme artırın, ama aşırı ve taze medya odasına girer soldaki bariyer tıkanmasını önlemek.
9. De 6 psi başlangıç ​​medya içeren medya giriş akan başlayın.
10. MetaMorph (Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA) veya diğer mikroskopi otomasyon ve kontrol yazılımı, zaman içinde birden fazla aşamada pozisyonlarda birden fazla görüntü çekmek için çok boyutlu bir satın alma kurulum. Sayısı ve zaman noktaları arasındaki aralığı ayarlar. ~ 10 hücre her birkaç aşamada pozisyon seçin (daha hızlı kalabalık olacaktır). Biz genellikle her her zaman noktasında elde edilmesi için ~ 11 saniye gerektiren, en fazla 16 pozisyon için 5 dakika aralıklarla ve görüntü kullanın.
11. Böylece her aşamada pozisyonda her zaman noktasında inci elde etme Kure programı olacak:; elde BF iletilen ışık parlak bir alan (BF) MetaMorph en yerleşik otofokus yöntemi (odak netliği üzerinde daha fazla kontrol sağlayan her aşamasında pozisyonun başlangıcında bir özel yazılı dergi olarak otofokus uygulama) kullanarak resim odaklanmak odak düzlemi (fp) için +1 mikron görüntü, fp (görüntüler arasında gerektiği gibi odağı değiştirmek için özel yazılmış dergi kullanın) -4 mikron odak dışında bir BF (BFOOF) görüntü elde ve bir gri tonlama elde az photobleaching ile hızlı bir satın alma için optimize ayarları kullanarak fp her floresan muhabiri için görüntü.
12. Eğer gerekli ise, herhangi bir hücre ile kültür odasının bir bölgesinde, her bir flüoresan raportör için arka plan ve gölgelendirme düzeltme görüntüler elde.
13. ONIX kontrol yazılımı içinde deney için akış programı hazırlayın. Aynı zamanda MetaMorph olarak satın alma programı ve ONIX kontrol yazılımı olarak akış programı başlar.
14. Deney sonunda, un düzeltmekfloresan görüntüler (gerekirse) ve isteğe bağlı olarak bir. stk film dosyası (konum 1 örneğin oluşturmak BF, BFOOF, CFP, YFP ve TTT film içine her aşamasında pozisyonda her resim kanal için. tif dosyaları birleştirmek bile arka plan ve gölgeleme .)

2. MATLAB FormatData GUI kullanarak Takip için biçimi ve Segment Veri (Şekil 2)

1. Veri girişi GUI açmak için MATLAB FormatData.m dosyasını çalıştırın. Üst kısmında, belirtmek veya veri dizini ayarlamak için görüntü dosyalarını içeren klasörü bulun ve sonra denemede kaydedilen veri türleri ve görüntü dosyaları belirtmek için GUI kullanın.
2. Sağ tarafta, gerçekleştirmek için hangi analiz türünü belirtmek için "Time-lapse" yanındaki radyo düğmesini seçin. "Time-lapse" bir zaman serisi (örneğin mikroakışkan odasında büyüyen hücrelerin bir film) olarak resim serisi tedavi edecek. "Statik" nüfusu (örneğin birden fazla görüntü farkl alınan alınan anlık bir dizi olarak her resim serisi tedavi edecektek bir slayt örnek üzerinde ferent pozisyonları). Bu GREFTLERİ sürümünde, birden fazla pozisyon için zaman atlamalı veri ancak her pozisyon için ayrı bir dosya (adım 2.14) olarak işlenebilir.
3. Çerçevesinde belirgin hücre hareketi en aza indirmek için filmlerde her görüntüyü kaydırarak kesin olmayan sahne hareketleri düzeltmek için görüntü kayıt için kutuyu işaretleyin. Önemle büyük ölçüde (daha sonra manuel parça küratörlüğü azaltarak) izleme geliştirir olarak tavsiye, ama görüntüler sınırda kaymıştır olmuştur nerede doldurmak için rastgele, "beyaz gürültü" piksel değerleri katacak. Ayrıca adım 2.7 bölümlenmiş BF görüntüleri gördükten sonra veya adım 2.13 kadar herhangi bir noktada seçilebilir.
4. "Veri Kanalları" panelinde "Parlak Alan" kutusunu işaretleyin. BF görüntüleri yüklemek için sağa "Seç" butonuna tıklayınız. *. TIF dosyaları için, seçerken Shift tuşuna basılı tutarak tek bir film için gelen tüm BF görüntü seçin, ardından "Aç" butonuna tıklayınız. *. STK dosyaları için, sadece ilgi BF yığını seçin. Görüntüleri başarı isetam tanınan, dosya adları "Tanınan Veri" panelinde sağındaki açılır menüde listelenir. . * TIF dosyaları için, dosya adları (- BF_t001, vb satın alma sırasında sıralı isimleri ile dosyaları kaydetmek) doğru sırayla görünür emin olun.
5. "Parlak Alan (odak dışında)" onay kutusunu işaretleyin ve sağa açılan yer alacaktır BFOOF dosyaları yüklemek için adım 2.4 olarak "Seç" düğmesini kullanın. (BFOOF de 63X kesimleri de fp göre BF -4 mikron olarak elde.)
6. "Hücre Maskesi" kutusunu işaretleyin. "Maske Kaynak" panelinde, "Segment BF" yanındaki radyo düğmesini seçin. Segmentasyon GUI açmak için "Parametreler" düğmesine basınız. (Alternatif olarak, bu durumda, bir BFOOF film gerekli değildir. Ikincisi basarak ve adım 2.4 olarak film seçerek, "Select Maske Dosya" düğmesinin yanındaki radyo düğmesini seçerek ön parçalı maske film seçin ve 2.8 adıma atlayabilirsiniz.)
7. Farklı segmentasyon parametreleri (her açıklamalarını görüntülemek olabilir ayarlayın"Parametre tanımları") basarak ve "Test" (Şekil 3) tıklayıp bu segmentasyon kalitesini test tarafından ed. Başarıyla bölütlenen kırmızı sınırları ile yeşil olacaktır. Filmde birden fazla zaman noktaları kontrol için kaydırıcıyı kullandığınızdan emin olun. Segmentasyon tatmin edici olduğunda, FormatData GUI için segmentasyon parametreleri dönmek için "Bitti" seçeneğini seçin.
8. "Renkli Görüntüler" kutusunu işaretleyin. Metin kutusuna ilk floresan görüntü kanal için renk adını girin ve tuşuna basın "Ekle seçin ve" adım 2.4 olarak renk dosyalarını yüklemek için. Renk adı soldaki liste kutusuna eklenir ve dosya adları sağdaki tabloya eklenecektir. Bir hata renk dosyaları yükleme yapılır ise, soldaki liste kutusunda renk adını seçin ve dosyaları kaldırmak için "Kaldır Renk" butonuna tıklayınız. Her renk kanalı için tekrarlayın.
9. Ek alt bölge maskeleri floresan renklerden biri (örneğin floresan etiketli çekirdeği → Nucl dayalı isekulak bölgesine maske) istenen, "Renk Maskesi" onay kutusunu. Aksi takdirde, 2.12 adıma geçin. "Renk Maskesi Kaynak" panelinde, metin kutusuna alt bölge maske adını girin. "Renk Maskesi Kaynak" paneli (renk 6. adımda eklenmiştir gerektirir) olarak açılan menüden bir renk seçin ve GUI test bir eşik açmak için "Parametreler" itin.
10. Otomatik olarak Otsu yöntemi ¹⁵ kullanarak eşiği belirlemek için, ve görüntü eşik (Şekil 4) Yukarıdaki korunmuş alanları vurgular "Otomatik eşik" düğmesine basınız. Eşik elle düzenleme kutusu kullanılarak ayarlanabilir. Eşik her zaman noktaları için uygun onaylamak için kaydırma çubuğunu kullanın. Memnun zaman, FormatData GUI için eşik dönmek için "Bitti" itme.
11. Itin seçilen renk görüntülere uygulanan eşik modülü kullanılarak alt bölge maske oluşturmak için "Ekle ve Segment". Renk maskesini adı ve kaynak ilgili r, sola tabloda görüntülenirSağdaki tabloda görünen ecognized dosya adları. (Alternatif olarak, itme "Ekle seçin ve" önceden yapılmış alt bölge maske dosyalarını yüklemek için.)
12. En altta, belirtmek veya kaydetme dizini olarak kullanılacak istediğiniz klasöre göz atın.
13. : Görüntü (mevcut Francois Nédelec tarafından geliştirilen tiffread2.m kodu kullanarak, dosyalarını okumak için "Format Veri" basın http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 , işlem verileri, ve oluşturmak *) belirtilen klasörde. mat dosyası. Bu dosya ProcessTimeSeries GUI için giriş olarak görev yapacak.
14. Her aşamasında pozisyon için film seti için adım 2,4-2,13 tekrarlayın.

3. ProcessTimeSeries GUI ve Papaz'ın kimliği ve Lineage Ödevler (Şekil 5) ile Zaman ile parça Hücreler ve soy

1. Izleme GUI açmak için MATLAB ProcessTimeSeries.m dosyasını çalıştırın. Açtıktan sonra aşağıdaki parametreleri ayarlayınGUI:
   • "Odası yükseklik" ("Dosya I / O" paneli, sol üst) - Bu hücreleri sıkışıp edildiği odasının yüksekliğini gösterir. Bu ^8'deki gibi hücre bölgenin majör ve minör ekseni esas olarak elipsoid bir 3D hücre hacmi yaklaşan bir kısıtlama olarak kullanılır.
   • "Mm / piksel" (paneli "I / O Dosya") - kesit alanı ve hacmi sırasıyla, mikron ² ve mikron ³ hesaplanabilir böylece görüntülerde mikron mesafe piksel kalibre etmek için dönüşüm faktörü.
   • "Filtreler paneli" (aşağıdaki "Dosya I / O" paneli) - ayarlanmış olan minimum ve maske önemsiz bölgelere filtrelemek için maksimum parametreleri: "Alanı" - piksel bölge alanı; "Ecc" - tuhaflığı faktörü, → 0 olarak daha yuvarlak , "SF" - şekil faktörü, → 1 olarak daha yuvarlak.
2. "Dosya I / O" panelinde "Resimleri Yükle" tıklayın ve FormatData GUI faiz çıkış *. Mat veri dosyasını seçin. Bölgede maskesi (ve herhangi bir alt-bölge maskeler) her renk kanalı için uygulanırVe farklı ölçümlerin bir sayısı (Tablo 1) yapılır. Veri dosyası daha sonra kaydedilir. Bir önceki oturumdan ProcessTimeSeries içine bir dosya yükleme Eğer analiz baştan yeniden başlatılması gerekiyorsa (bu soracaktır DİKKAT:.. Bu zaten tamamlanmış herhangi bir parça küratörlüğü silmek ve FormatData GUI taze sanki veri kabul ederiz yanlışlıkla hızla üzerine gelen daha önce küratörlüğünü *. mat dosyası önlemek için MATLAB komut penceresinde Ctrl + C vurdu, yeniden.)
3. Daha sonra, hücreleri izleyebilirsiniz. "Parça Hücreler" paneli ("Filtreler" paneli yanında), aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
   • "Max Deplasman" - Bir hücrenin farklı hücre olarak etiketlenmiş önce komşu görüntüler arasında seyahat edebilirsiniz piksel olarak maksimum mesafe. Yüksek yer değiştirme algoritması daha hareketli hücreler için hesap anlamına gelir, ama aynı zamanda kalabalık hücre bölgeleri eşleşen karmaşıklığını artırır. Biz (adım 3 12 'da başlayacak ve bir hata izleme oluşursa azalma.4).
   • "Minimum Uzunluk" - geçerli bir veri serisi dikkate alınması gereken bir hücre iz için olaylar az sayıda. Biz gerçek bir iz kaldırılmasını önlemek için 1 kullanabilirsiniz, ancak bu kısa ömürlü, sahte bölgede izleri segmentasyon sonuçları ise arttırılabilir.
   • "Çerçeve Bellek" - ardışık kare sayısı bir hücre bölge yok olabilir ve döndüğünde aynı kimlik verilecek. Bu "Çerçeve Bellek" daha uzun süre kaybolur, bu döndükten sonra yeni bir kimlik verilecek. Biz bölge dönmeden önce 2 kare için segmentasyon tarafından kaçırılmaması için izin vermek için 2 kullanın.
4. Bölgede geometrik (: Blair ve Crocker Dufresne MATLAB uygulaması, Grier ve Hafta IDL rutin, mevcut kullanarak sonraki bir çerçeveden bölgelere izlemek için "Parça Hücreler" tıklayın http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , yeni görünen tomurcukları için soy atamak ve verileri kaydetmek. Soy otomatik min atanırher çerçeve içinde varsayılan tomurcukları ve potansiyel anneleri arasındaki mesafeler imizing. (Bir hata "zor kombinatorik" nedeniyle MATLAB komut penceresinde görünüyorsa, "Max Deplasman" azaltmak ve izleme tekrarlayın.) Değişim parametreleri veri için gerektiği gibi pop-up pencereler içinde.
5. Çeşitli GUI araçları veya kısayol tuşları ("Seçili Hücrenin Bilgi" paneli üzerindeki düğmeye basarak bir pop-up pencerede gösterildiği gibi) kullanarak kötü bölütlenen ve kimlik veya soy atamaları hatalar papaz.
   • Slider, "Önceki Resim", "Sonraki Resim" (Ctrl + sol / sağ) - görüntülemek ve resim serisi çerçeveler arasında hareket etmek için kullanın.
   • "Image #" - sol ve sağ eksen mevcut görüntünün kare sayısını gösterir. "# Resim" düzenleme kutusu sağ sayısını yazarak belirli bir çerçeveye taşıyın.
   • "Delta çerçeve" - ​​(- sol Δ = sağ) sağ ve sol eksen arasındaki kare sayısı arasındaki fark gösterir.
   • (Ctrl + T) "Metin gizle" - hücreyi kimlikleri görüntüleme arasında geçiş yaparDoğru eksen ya da değil.
   • "Hide Etiketler" (Ctrl + L) - sol eksen ya da değil hücre kimlikleri görüntüleme arasında geçiş yapar.
   • "Maske" pop-up menü - hiçbir maske, hücresel maskesini veya sol paneldeki ekran için herhangi bir kullanıcı tanımlı alt maskeleri görüntüleme arasında seçim.
   • "Kaplama" tıklıyorsunuz (Ctrl 1-9) - sol çerçeve içinde BF ve renk katmanları görüntülemek için seçin. Göster BF her iki eksende BF tabakası açık veya kapalı geçiş yapar sadece biri. Tekrar menüsünde bindirme adı ("*" kaplama görüntülenir gösterir) seçerek ekran arasında ya da değiştirir. 2-9 amacıyla renk bindirmeleri geçiş ile Ctrl +1 geçiş BF kaplaması,.
   • "Set Renkler" - bindirme görüntü için renk belirlemek için kullanın. Bir açılır pencere ayarlamak için hangi floresan kanal sorgular ve daha sonra renk paleti kullanıcı tanımı için görünür.
   • Paneli "Bölgeler ve Parçalar Değiştir" - bu hücre bölgede maske ve izleme bilgileri tarihinde yürürlüğe değişiklikleri kontrol eder:
     • "Güncelleme parça" (Ctrl + U) - yeniden kullanımıhücre kimlikleri atayın. Hiçbir hücre sağ eksende seçilirse bir hücre kimliği değiştirmek için, GUI isteyecektir. ID X Y değiştirildiğinde, X gelecekteki tüm örneklerini Y değişecektir, ve mevcut Y gelecekte örneklerini, (X geçecektir Bazen bir hücre tekrar tekrar, 2 kimlikleri arasında ileri geri geçiş yapar. Bu yerine güncelleme ID fonksiyonu bir hata daha bir oversegmented bölgede birden fazla kimlik karşılamak için çalışıyor izleme kaynaklanmaktadır.) Çoklu hücreler seçilir ve kimlikleri aynı anda değişti, ancak her bir benzersiz bir kimlik vermek emin olun olabilir. Geçerli dosya bulunmayan bir kimlik için bir bölge atamak için, "0" girin ve bir oluşturulur. Iki vurgulanan hücrelerin kimliklerini takas Ctrl + W kullanın.
     • "Seçilen Tracks Sil" (Ctrl + D) - Geçerli sağ eksen çerçevesinde Seçili hücre veya birden fazla cep bölgeleri silmek için kullanın. (Herhangi bir hücre seçilirse, ID isteyecektir.) Kalıcı bir kimlik iz tüm örneklerini silmek için, De yanındaki onay kutusunulete Seçilen Parçalar düğmesine (metin "TÜM Sil" olarak değişecektir). Bu kalıcı önemsiz bölgelerde kurtulmak için yararlıdır, ama önce kimlik geçerli bir hücre veya tomurcuk bölgeye geçiş olmadığından emin olmak için gelecek çerçeveleri kontrol edin.
     • "Birleştirme Bölgeler" (Ctrl + A veya M) - hücre bölgeleri düzgünleştirir ve birleştirir. Seçmek için sağ eksende bir hücre veya hücreleri (seçtiyseniz bölge kırmızı olur) tıklayın. Bir bölgeye birleştirme morfolojik bir disk şeklinde elemanı kullanılarak çatlak veya küçük kayıp parçalar halinde doldurmak için kapanacak. Iki veya daha fazla yakın bölgelerde birleştirme bir bölgede bunları birleştirmek ve yeni bölgeye en düşük ID verecektir. Bu aşırı bölütlenen (hücreler büyük boşlukları sahip çoğu zaman) için kullanışlıdır.
     • "Bölge çizin" - İstenilen doğru eksende bir bölge çizmek ve çift bitirmek için tıklayın için fareyi kullanın. Veri seti (1 ve 65535 arasında) mevcut olmayan benzersiz bir kimlik sağlar. Klavyede silme tuşuna basarak iptal edin.
   • "Lineage İzleme" paneli - izleme sonra,soy atamaları otomatik olarak oluşturulur. Yeni kimlik bölge göründüğünde, yeni hücre kimliği pembe görünür ve bir kırmızı çizgi anne bölgeye çekilir. Çok büyük yeni bölgeler tomurcukları olabilir ya da çok uzakta potansiyel anneden yeşil görünür ve "NaN" ("sayı değil", Tablo 2) bir anne ID atanır için. Ilk kez noktada mevcut Bölgeleri "0" bir anne kimliği var. Bireysel ödevler düzeltmek için, metin düzenleme alanlarında anne ve tomurcuk kimlikleri girin ve "Fix" butonuna tıklayınız. Bir hücrenin anne silmek için, onun anne olarak "0" girin. Daha hızlı bir yöntem sağ görüntüde iki bölge seçin ve Ctrl + F basmaktır Yavru hücre için daha önce var olan anne atamaları silerken Bu otomatik olarak, kızı olarak anne ve yeni bölge olarak eski bölge atar. DİKKAT: Herhangi bir zamanda "soy Hesapla" tıklanması de dahil olmak üzere yeniden hesaplamak tüm soy atamaları, kullanıcının daha önce küratörlüğünü yaptı olacaktır.
   • "Seçili Hücrenin Bilgi" paneli - "I Getnfo "sağ eksen seçilen bölgelerin bazı ölçümler gösterecektir." Ölçümler ... "(İhracat Verileri" kullanıcı hangi ölçümleri yanı sıra diğer işlemler için varsayılan liste tanımlamak) görüntülenir belirlemenize olanak sağlar ". kullanılabilir Doğru kimlikleri ve soy (örneğin cep X t zamanında bir tomurcuk varsa, büyük olasılıkla t zamanında bir tomurcuk bulunmamış + 5 dk) belirlemek için.
   • Güncellemeler * mat dosyası kullanıcı değişiklikleri yansıtacak şekilde -. (Ctrl + S) "Değişiklikleri Kaydet". SIK KULLANIM (hiçbir işlevi geri yoktur)!
   • "Arsalar Oluştur" - GeneratePlots GUI açar. Hızla ProcessTimeSeries GUI, onların ortalama, ya da her bir çerçeve içinde tüm bölgelerin ortalama hakkı eksenlerinde vurgulanan tek hücreli bölgeleri için seçilen değişken bilgi ve basit hesaplamalar çizmek için kullanılır. Bu GUI kaba ilk türevleri hesaplamak, ama sol üst doğru zaman aralığını belirtmek için emin olabilirsiniz. Arsalar "Şekil Oluştur" tuşuna basarak kaydetmek için bir rakam çıktı olabilir.
6. Veriyi düzgün bir şekilde papaz için: Herhangi bir oversegmented bölgeleri birleştirmek, tüm hücre yakalama herhangi bölgeleri silin, anne-bud ilişkileri düzgün (bir kırmızı çizgi tomurcuk ortaya çıkması sırasında aralarında görünür atanır emin olun, tomurcuk ID pembe olduğunda, görmek Tablo 2) ve, bölgenin bir anne atama, kimliği tespit hiçbir anne ("0"), atama veya bölge silerek herhangi bir yeşil kimlikleri ortadan kaldırmak. Onun annesi için bir tomurcuk bölgesi (bu yanlış hacmi tahmini yol açacaktır) birleştirme kalmamak Bud veri son tahlilde sırasında annenin bu eklenecektir.
7. Görme kadar ilgi son kez her kare için veri kontrol, ancak daha sonra çerçeve kullanmıyorsanız eğer tüm zaman serisi gerekli değildir.
8. Değişiklikleri kaydetmek için emin olun.
9. Tekrar her aşamasında pozisyon için *. Mat dosyası için 3.1-3.7 adımları.

4. Analiz için veri verme

1. Sadece tim ile her hücre için ham bölge ölçümleri vermek içine, "İhracat Verileri" itin. Ilgi ölçümleri açılır GUI seçilebilir, ve bir boşlukla ayrılmış çıkış olacaktır *. Txt sütun başlıkları olarak değişken isimleri ile dosya.
2. Zaman içinde bütün hücreler için zaman serisi analiz etmek, hücre döngüsü bilgileri hesaplamak, ve türevleri almak, "Zaman Serisi Analizi" itin. Bir pencere çıkar ve analiz parametrelerin girişi (Şekil 6) ölçümleri arasından seçim yapmak açılacaktır.
3. GUI (sonraki tüm kareleri yok sayılır) olarak küratörlüğünü son kez noktasını girin. Varsayılan yumuşatma ve hücre döngüsü atama parametreleri bizim haploid ve 5 dakika aralıklarla görüntülendi diploid suşları için iyi çalışır, ancak bu iyi sonuç için çeşitli gerekebilir. (Parametre değerleri manuel bir test veri seti için tomurcuklanan ve bölünme zamanı belirleyen ve otomatik algoritmanın performansına karşılaştırarak uygun olup olmadığını kontrol edin.)
4. Tüm parametreler girildikten sonra, için "Analiz" itme:
   1. EksileriHer ham ölçüm için diziler truct ve arka plan (her floresan film ilk çerçevenin olmayan hücre alanının ortalama yoğunluğu olarak ölçülür, ya da cep piksel başına ortalama otofloresans için hesap belirtilebilir) çıkarın.
   2. Yüksek frekanslı ölçüm gürültü (gibi ⁹ ele) ortadan kaldırmak için Seçilen ölçümler için bir düzeltme eğri takın.
   3. Otomatik olarak ⁹ anlatıldığı gibi ses zaman serisi yamacında değişikliklere göre her hücre için tomurcuk ortaya çıkması ve hücre bölünmesi kez belirler. Tomurcuk ölçümler daha sonra bitişik tüm hücre zaman serisi için ortaya çıkması ve bölünme her çevrim arasındaki annenin ölçümleri eklenecektir. Normalleştirilmiş hücre döngüsünün ilerlemesi da bölünme bölümü 0 ile 2 arasında hesaplanır.
   4. Istikrarlı ^1. ve seçilen ölçümlerin ^2. türevleri almak için bir düzeltme eğri takın. (Iyi tanımlanmış türevleri, zaman serisi amaçla, önceki döngü için son nokta karşılamak için aşağıdaki hücre döngüsü için veri kaydırılarak bölümü boyunca sürekli yapılır.)
   5. Çıkış Her bir ölçüm için bir dizi olarak ham ve düzeltti zaman serisi tüm bölgeler için, ve tüm hücre düzeltti, sürekli ve farklı zaman serisi. İlk öğe arka plan çıkarma için bir renk endeksi, ilk satırın geri kalanı, hücre kimlikleri tutan ilk sütunun geri kalanı çerçeve numarası ve kalan elemanları her satır ile bir sütundaki her bir hücre için zaman serisi tutun ilk sütunda çerçeveye karşılık gelen. Hücre döngüsü ilerleme zaman serisi ve soy bilgilerin benzer bir dizi de çıkış olacaktır. Dizi "LineageArray" anne kimliği, tomurcuk ID, ilk tomurcuk bölgenin çerçeve, tahmin tomurcuklanan çerçeve ve tahmini bölünme çerçeve olan beşinci sütun ile bir anne-tomurcuk ilişki ve ilk temsil eden her satır bir tablo içerir. Veriler *. Mat dosyası (MATLAB veri dosyası) ihraç edilmektedir.

Sonuçlar

Bir başarılı bir performans ve analiz deney gerçekçi atanan tomurcuk ortaya çıkması ve bölme kez tek bir bütün hücreler için daha çok sürekli zaman serisi verecektir. Örnek olarak, büyüme ve genel ifadesi tek bir hücre içinde süresi (Tablo 4, Y47 içinde değişebilir nasıl gözlemlemek için yapısal ADH1 promoteri tarafından tahrik Shibuya floresan protein bütünleşmiş bir kopyası (CFP) ifade eden bir maya suşu ile haploid Yukarıdaki protokol gerçekleşt...

Tartışmalar

Yukarıdaki protokol Mikroakiskan veya yazılım geliştirme sınırlı deneyimi olan floresan zaman serisi verileri elde etmek ve analiz etmek için basit bir yöntem açıklanır. Bu tek bir maya hücrelerinin zaman sukut floresan film elde etmesini sağlar, papaz izleme ve soy atamaları,, ilgili hücre boyutu ve ifade ölçümleri ayıklamak ve bir ticari mikroakışkan kültür cihaz kullanarak zaman ve çok yönlü bir grafik kullanıcı üzerinde bütün hücrelerin davranışını analiz arayüzü (GUI). Deneyse...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit