L'acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Riepilogo

Vi presentiamo un semplice protocollo per ottenere filmati di microscopia a fluorescenza di crescita cellule di lievito, e un pacchetto software basato su GUI per estrarre i dati cella singola serie storica. L'analisi include lignaggio automatico e l'assegnazione a divisione di tempo integrato con ispezione visiva e curation manuale dei dati rilevati.

Abstract

Fluorescenza time-lapse microscopia è diventato un potente strumento per lo studio di molti processi biologici a livello di singola cellula. In particolare, i film che descrivono la dipendenza temporale di espressione genica fornire una conoscenza delle dinamiche della sua regolazione, tuttavia, ci sono molte sfide tecniche per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di singole cellule. Descriviamo qui un semplice protocollo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibile in commercio per produrre tali dati, e una, interfaccia MATLAB basata utente grafica (GUI) basata su software per quantificare le immagini di fluorescenza. I segmenti software e cellule tracce, consente all'utente di curare visivamente errori nei dati, e assegna automaticamente lignaggio e tempi di divisione. La GUI analizza ulteriormente la serie temporale di produrre tracce cellule intere e le loro derivate prime e seconde tempo. Mentre il software è stato progettato per S. cerevisiae, la sua modularità e versatilità dovrebbero permettere tØ fungere da piattaforma per lo studio di altri tipi di cellule con poche modifiche.

Introduzione

Analisi di singole cellule di espressione genica ha favorito la nostra comprensione di molti aspetti della regolazione genica. Istantanee statiche di espressione reporter fluorescente mediante citometria di flusso o microscopia forniscono utili informazioni sulla distribuzione di espressione singola cellula, ma non hanno la storia e l'evoluzione dei dati di serie storiche necessarie per informare direttamente le dinamiche di espressione genica. Fluorescenza time-lapse microscopia presenta un mezzo per ottenere entrambe le misure monocellulari e la loro storia. Varie tecniche sperimentali e analitiche sono state sviluppate per ottenere e quantificare i film d'espressione reporter fluorescente, conferendo così intuizioni funzioni di regolazione genica (vedi ¹ per una rassegna) come variazione cella-a-cella ^2,3, formazione persister batterica ^4, trascrizione iniziazione e di allungamento ^5, trascrizionale scoppio ^6,7, ciclo cellulare dipendenza da ^8,9, e ereditabilità ^10. Tuttavia, OBTaining cella singola serie temporale fluorescenza di qualità comporta notevoli difficoltà tecniche coltura un monostrato di cellule in un ambiente controllabile e quantificazione in high-throughput dei film fluorescenza acquisiti. Qui, descriviamo una procedura per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di S. cerevisiae con nessuna esperienza richiesta nella produzione di dispositivi di coltura cellulare o in fase di sviluppo del software (Figura 1).

In primo luogo, abbiamo dettagliatamente un protocollo di esempio per generare in tempo fluorescenza i film di serie per il lievito in erba esprimere uno o più giornalisti fluorescenti. Sebbene camere di coltura microfluidica personalizzati sono stati costruiti e impiegati con successo in precedenza ^11-13, utilizziamo un dispositivo microfluidica disponibile in commercio da CellAsic (Hayward, CA). Le cellule del sistema limita a crescita monostrato e permette il controllo continuo dell'ambiente di perfusione. Il protocollo di microscopia che presentiamo è un semplice mezzo per ottenere flfilm senza di lievito in erba, ma qualsiasi protocollo modificato sperimentale (un dispositivo cultura personalizzata, condizioni di media alternativi, ecc.) che producono dati di filmati fluorescenza simili di cellule di lievito singoli possono essere sostituiti.

Successivamente, abbiamo delineare l'analisi dei filmati utilizzando una interfaccia grafica utente (GUI) basata su software in MATLAB (Mathworks, Natick, MA), soprannominata la GUI per analisi rapide del Tempo fluorescenza Series (INNESTI), per estrarre i dati di serie temporali per singole cellule. INNESTI ha caratteristiche simili al versatile, software open-source pacchetto Cell-ID ¹⁴ in segmentazione e monitoraggio delle cellule e nell'estrazione intensità di fluorescenza e di informazioni geometriche. Tuttavia, innesti fornisce importanti funzionalità aggiuntive. In primo luogo, offre un facile editing interattivo di segmentazione e monitoraggio dei risultati per verificare l'accuratezza dei dati, piuttosto che solo gating statistica dei valori anomali regione tracce dopo l'analisi. Inoltre, si estende l'analisi ai automatically designato lignaggio e punti del ciclo cellulare di interesse di lievito in erba. Determinare quando madre e figlia si dividono per formare due regioni di cellule indipendenti, è fondamentale per la determinazione delle cellule insieme (madre compresa qualsiasi gemma collegato) misurazioni durante tutto il ciclo cellulare ^8. La suite si compone di tre moduli per eseguire queste operazioni. I primi segmenti regioni cellulari basati sul contrasto tra le immagini in campo chiaro mirate e vago, e permette all'utente di definire e verificare visivamente i parametri di segmentazione. Le seconde tracce (. Utilizzando Blair e MATLAB implementazione di Dufresne della Crocker et al IDL di routine, disponibili presso: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) e le misure regioni cellulari attraverso il tempo; assegna automaticamente lignaggi, e consente l'ispezione visiva e correzione di errori. Una semplice interfaccia grafica complotto è incluso per le proprietà cella singola query. Il terzo modulo attribuisce gemma emergere e divisione TImes, ed emette dati cellula intera serie temporali nonché le loro derivate prime e seconde tempo (come discusso in ^9). Il modulo di analisi emette i dati come file di testo delimitato da spazi per studio successivo nel software statistico di scelta. Così, il pacchetto consente all'utente di estrarre dati di serie temporali di elevata qualità mediante un'interfaccia grafica. Abbiamo usato questo metodo per stimare i tassi di trascrizione in tempo reale in singole cellule di lievito in erba in funzione del ciclo cellulare ^9. Mentre i moduli sono stati ottimizzati per il lievito in erba, i parametri o, se necessario, il codice liberamente disponibile può essere adattato per altri organismi e tipi di immagine. Segmentazione, tracking, e lignaggio algoritmi di assegnazione possono essere specifiche per i tipi di immagini assegnato e l'organismo in questione. Gli algoritmi esistenti potrebbero essere sostituiti, ma conservano ancora l'interfaccia grafica che permette l'ispezione di facile visiva e la correzione degli errori di segmentazione e monitoraggio che invariabilmente occupantir con qualsiasi algoritmo.

Protocollo

1. Ottenere fluorescenti Film Microscopia di cellule di lievito singole Crescere in una Camera Microfluidic

1. Inoculare 1 ml SC supporti (supporti definiti sintetici con 2% di glucosio e completo complemento di aminoacidi) con celle da una piastra di fresco in crescita, e incubare la coltura durante la notte ~ 16 ore su un tamburo rullo a 30 ° C. Preparare la cultura in modo che il finale OD _600nm è ~ 0.1 per la fase di crescita logaritmica presto.
2. Diluire la coltura starter come necessario e ricrescere 1 ml in una provetta fresco ulteriori 6-8 ore di OD _{600 nm} = 0,1. Questo fornisce le cellule che crescono in un nutriente stato stazionario ad una densità adatta per il caricamento nel dispositivo microfluidica. (In alternativa, sostituire i passaggi 1,1-1,2 con la procedura necessaria per preparare cellule come richiesto per l'esperimento.)
3. Preparare una piastra di coltura microfluidica Y04C da CellAsic: rimuovere la soluzione di navigazione; lavare i pozzetti con acqua sterile, e con il flusso del sistema di perfusione ONIXacqua attraverso pozzi 1-6 a 6 psi per 5 minuti per lavare i canali. Quindi, il flusso dal carico ben 8 a 6 psi per 10 sec (il canale di carico ha portate molto elevate e deve essere lavata separatamente).
4. Togliere l'acqua da tutti i pozzetti e sostituirlo con 250 ml SC nell'insenatura pozzi 1-6 e 50 microlitri della cultura dal punto 1.2 a cella di carico ben 8. (In alternativa, inserire il supporto desiderato nei pozzi di aspirazione 1-6 per esperimenti che richiedono la commutazione tra diverse condizioni.)
5. Sigillare il collettore ONIX alla piastra, e cominciare adescamento i canali e da camera di coltura fluisce da ingresso a 6 pozzetti 1-6 psi per 2 min seguita da almeno 5 min a 6 psi da solo il bocchettone contenente il supporto di partenza per la esperimento. Fluire questo continuamente fino alla fase 1.7.
6. Preparare il microscopio per l'esperimento. Usiamo un Zeiss Axio Observer.Z1 widefield microscopio con una II retroilluminato fotocamera EMCCD Cascade (fotometrici, Tucson, AZ) e di un arco di 200 a ioduri metallici LumenLampada (PRIMA scientifico, Rockland, MA) per eccitazione di fluorescenza attenuato al 10% per evitare photobleaching. Per ridurre al minimo il tempo di commutazione necessario per acquisire in canali fluorescenti più, abbiamo una sola coppia, cubo filtro a tripla banda dicroica ad adeguate eccitazione / emissione filtri per CFP, YFP, e RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; serie 89006) impostare in, fast-switching ruote filtro esterno (Ludl prodotti elettronici, Novato, CA).
7. Versare qualche goccia di liquido immersione sull'obiettivo (se necessario, si usa una Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC), e montare il dispositivo microfluidica saldamente nella fase del microscopio invertito. Assicurare la piastra non sposta affatto in fase di tutto l'esperimento migliora il tracciamento delle cellule durante l'analisi dei dati. Abbiamo semplicemente nastro la piastra al supporto stadio per evitare il suo spostamento.
8. Concentrarsi sul terzo più a sinistra della prima camera di coltura (dove l'altezza della camera è più piccola) utilizzando uno embedded posizionezione marcatori. Spegnere il flusso dalla bocca dei media bene, e il flusso di celle di carico ben 8 a 6 psi in 5 secondi scoppia. Spostare lo stadio di guardarsi intorno alla camera di coltura per cellule. Aumentare il tempo di caricamento e pressione fino a densità cellulare desiderato è raggiunto, ma evitare il sovraccarico e intasamento della barriera più a sinistra, dove mezzi freschi entra nella camera.
9. Iniziare fluisce dall'ingresso supporti pozzetto contenente il supporto a partire da 6 psi.
10. In MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) o altri automazione microscopia e software di controllo, impostare una acquisizione multi-dimensionale di una serie di immagini per più posizioni di stage nel corso del tempo. Impostare il numero di e l'intervallo tra i punti di tempo. Seleziona più posizioni di stage con ~ 10 celle ciascuno (più sarà sovraffollamento rapidamente). Usiamo tipicamente intervalli di 5 min e l'immagine fino a 16 posizioni, che richiedono ciascuna ~ 11 secondi per l'acquisizione ad ogni tempo.
11. Impostare l'acquisizione in modo che ad ogni posizione fase in ogni punto ª voltaprogramma di e sarà: concentrarsi sul campo chiaro a luce trasmessa (BF) immagine usando di MetaMorph metodo incorporato autofocus (in attuazione della messa a fuoco automatica, come un diario personalizzato scritto all'inizio di ogni posizione di fase fornisce un maggiore controllo sulla precisione di fuoco); acquisire la BF immagine a 1 micron al piano focale (fp); acquisire una BF fuori fuoco (BFOOF) immagine a -4 micron alla fp (utilizzare riviste personalizzate scritte per modificare la messa a fuoco, come richiesto tra le immagini), e acquisire una scala di grigi immagine per ogni reporter fluorescente alla fp utilizzando le impostazioni ottimizzate per una rapida acquisizione con il minimo photobleaching.
12. Se necessario, ottenere immagini di sfondo e ombreggiatura di correzione per ogni reporter fluorescente in una zona della camera di coltura privo di celle.
13. Preparare il programma di flusso per l'esperimento nel software di controllo ONIX. Iniziare contemporaneamente il programma di acquisizione nel MetaMorph e il programma di flusso nel software di controllo ONIX.
14. Alla fine dell'esperimento, correggere ONUanche background e ombreggiatura nelle immagini fluorescenti (se necessario) e, facoltativamente, unire i file. tif per ogni canale dell'immagine in ciascuna posizione stadio in un file di filmato. stk (ad esempio creare BF, BFOOF, CFP, YFP e film RFP per la posizione 1 ).

2. Formato e segmento dati per puntare Utilizzando la FormatData GUI in MATLAB (figura 2)

1. Eseguire il file FormatData.m in MATLAB per aprire l'interfaccia grafica di input di dati. Nella parte superiore, specificare o individuare la cartella che contiene i file di immagine per impostare la directory di dati, e quindi utilizzare l'interfaccia grafica per specificare i tipi di dati e file di immagini registrati nell'esperimento.
2. A destra, selezionare il pulsante di opzione accanto a "time-lapse" per indicare che tipo di analisi da eseguire. "Time-lapse" tratterà la serie di immagini come una serie temporale (ad esempio, un film di cellule che crescono in una camera microfluidica). "Static" tratterà ogni serie di immagini come una serie di istantanee scattate da una popolazione (ad esempio, le immagini più prese a difrenti posizioni su un campione unico scivolo). In questa versione innesti, dati time-lapse per più posizioni possono essere trattati, ma in un file separato per ogni posizione (vedi punto 2.14).
3. Selezionare la casella per la registrazione dell'immagine per correggere la fase dei movimenti imprecisi spostando ogni immagine nei film di ridurre al minimo il movimento delle cellule apparente all'interno della cornice. Consigliamo vivamente questo in quanto migliora notevolmente il monitoraggio (riduzione manuale curation pista dopo), ma aggiungerà, "rumore bianco" valori di pixel casuali a compilare in cui le immagini sono state spostate alla frontiera. Potrebbe anche essere selezionato dopo aver visto le immagini BF segmentate in fase 2.7 o in qualsiasi punto fino al passo 2.13.
4. Selezionare la casella "brillante campo" nel pannello "Dati Canali". Fare clic su "Seleziona" per il diritto di caricare le immagini BF. Per i file *. TIF, selezionare tutte le immagini BF corrispondenti ad un unico filmato tenendo premuto il tasto Maiusc durante la selezione, quindi fare clic su "Apri". Per i file *. STK, basta selezionare lo stack BF di interesse. Se le immagini sono successopienamente riconosciuto, saranno elencati i nomi dei file nel menu a comparsa a destra nella "dati riconosciuti" pannello. . * Per i file TIF, accertarsi che i nomi dei file vengono visualizzati nell'ordine corretto (salvare i file con nomi sequenziali durante l'acquisizione - BF_t001, ecc.)
5. Controllare il "Campo Luminoso (fuori fuoco)" dialogo e utilizzare il pulsante "Select" come al punto 2.4 per caricare i file BFOOF, che verranno elencati nella popup a destra. (BFOOF ottenuto come BF -4 micron rispetto alla fp a 63X segmenti pure.)
6. Selezionare la casella "Maschera di cella". Nel pannello "Maschera Source", selezionare il pulsante di opzione accanto a "Segmento BF". Premere il pulsante "Parametri" per aprire la GUI di segmentazione. (In alternativa, selezionare un filmato maschera pre-segmentato selezionando il pulsante di opzione accanto al pulsante "Select File Mask", premendo quest'ultimo, e selezionando il film come al punto 2.4. In questo caso, un film BFOOF non è necessario, e può passare al punto 2.8.)
7. Impostare i vari parametri di segmentazione (descrizioni di ogni possibile visualizzarendr premendo "Descrizione dei parametri"), e testare la qualità di segmentazione facendo clic su "Test" (Figura 3). Successo regioni segmentate saranno verdi con bordi magenta. Accertarsi di utilizzare il dispositivo di scorrimento per controllare più punti di tempo nel film. Quando la segmentazione è soddisfacente, selezionare "Fatto" per riportare i parametri di segmentazione per la FormatData GUI.
8. Selezionare la casella "Color Images". Immettere il nome del colore per il primo canale immagine fluorescente nella casella di modifica di testo, quindi premere "Aggiungi e selezionare" per caricare i file a colori come al punto 2.4. Il nome del colore viene aggiunto alla casella di riepilogo a sinistra, e sarà aggiunto i nomi dei file per la tabella a destra. Se viene commesso un errore nel caricare i file a colori, selezionare il nome del colore nella casella di riepilogo a sinistra e fare clic su "Rimuovi colore" per rimuovere i file. Ripetere l'operazione per ogni canale di colore.
9. Se ulteriori maschere sub-regione basata su uno dei colori fluorescenti (ad esempio fluorescente nucleo → Nuclorecchio regione maschera) sono desiderati, selezionare la casella "Maschera di colore". In caso contrario, passare al punto 2.12. Nel pannello "Color Mask Source", inserire il nome della maschera sub-regione nella casella di modifica di testo. Scegliete un colore dal menu a comparsa nel pannello "Color Mask Source" (richiede il colore sono stati aggiunti al punto 6) e spingere "Parametri" per aprire una soglia di test GUI.
10. Premere il pulsante "Auto-soglia" per determinare automaticamente la soglia usando il metodo di Otsu ^15, e l'immagine sarà evidenziare le aree protette al di sopra della soglia (Figura 4). La soglia può essere regolata manualmente utilizzando la casella di modifica. Utilizzare la barra di scorrimento per confermare la soglia è appropriato per tutti i punti di tempo. Quando si è soddisfatti, Push "Done" per tornare alla soglia al FormatData GUI.
11. Premere "Aggiungi e di settore" per generare la sub-regione maschera utilizzando il modulo di soglia applicata alle immagini a colori selezionate. Il nome maschera colore e sorgente saranno visualizzati nella tabella a sinistra, con la relativa ri nomi dei file ecognized che appaiono nella tabella a destra. (In alternativa, premere il tasto "Aggiungi e selezionare" per caricare i file di pre-fatti maschera sub-regione.)
12. In fondo, specificare o individuare la cartella desiderata da utilizzare come directory di salvataggio.
13. Premere "Data Format" per leggere i file di immagine (utilizzando il codice tiffread2.m sviluppato da Francois Nedelec, disponibile all'indirizzo: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), i dati di processo, e di creare un * file. mat nella cartella specificata. Questo file servirà da input per il ProcessTimeSeries GUI.
14. Ripetere il passaggio 2,4-2,13 per il set di film per ogni posizione palcoscenico.

3. Cellule della pista e lignaggi nel Tempo con ProcessTimeSeries GUI, e Curato ID e Assegnazioni Lineage (Figura 5)

1. Eseguire il file ProcessTimeSeries.m in MATLAB per aprire la GUI di monitoraggio. Impostare i seguenti parametri dopo l'apertura delGUI:
   • "Altezza camera" ("File I / O" pannello superiore sinistro) - indica l'altezza della camera in cui le cellule sono intrappolati. È usato come un vincolo nel approssimare volume cellulare come un ellissoide 3D ​​basato sull'asse maggiore e minore della regione cella come in ^8.
   • "Micron / pixel" (pannello "I / O File") - il fattore di conversione per calibrare pixel a distanza micron nelle immagini così sezione trasversale ed il volume può essere calcolato in micron ² e ³ micron, rispettivamente.
   • "Pannello Filtri" (di seguito "File I / O" del pannello) - set minimo e parametri massimi per filtrare le regioni spazzatura nella maschera: "Area" - zona in pixel, "Ecc." - fattore di eccentricità, più circolare come → 0 , "SF" - fattore di forma, più circolare come → 1.
2. Fare clic su "Carica immagini" nel pannello "I / O File" e selezionare il file di dati *. Tappeto di uscita interesse dal FormatData GUI. La regione maschera (e eventuali maschere sottoregione) viene applicato a ciascun canale di colore, E una serie di misure diverse sono realizzate (Tabella 1). Il file di dati viene quindi salvato. (Se si carica un file in ProcessTimeSeries da una sessione precedente, verrà richiesto se l'analisi deve essere ripetuto dall'inizio. ATTENZIONE:. Questa operazione cancellerà qualsiasi curation traccia già completata e trattare i dati come se fosse fresco dal FormatData GUI Se riavviato accidentalmente, rapidamente premere Ctrl + C nella finestra di comando di MATLAB per evitare che il file. tappetino * precedentemente curata da sovrascrittura.)
3. Avanti, monitorare le cellule. Nel pannello "Cells Traccia" (accanto al pannello "Filtri"), impostare i seguenti parametri:
   • "Spostamento Max" - la distanza massima in pixel di una cella può viaggiare tra immagini adiacenti prima di essere etichettato come una cella diversa. Cilindrata più elevata significa l'algoritmo può rappresentare le cellule si muovono di più, ma aumenta anche la complessità del confronto regioni cellulari in folle. Si parte alle 12 e diminuire se si verifica un errore nel monitoraggio (vedere il punto 3.4).
   • "Lunghezza minima" - minimo numero di occorrenze di una traccia cella da considerare una serie di dati validi. Usiamo 1 per impedire la rimozione di tutte le tracce reali, ma questo può essere aumentato se i risultati di segmentazione a breve durata, regione tracce spurie.
   • "Memory Frame" - numero massimo di fotogrammi consecutivi una regione cella può scomparire ed essere dato lo stesso ID quando ritorna. Se scompare per più di "Memory Frame", vi sarà dato un nuovo ID al ritorno. Usiamo 2 per consentire alle regioni da non perdere per segmentazione per 2 telai prima di tornare.
4. Fare clic su "Cellule Traccia" per monitorare le regioni da un fotogramma al successivo usando la regione centroidi (Blair e Dufresne MATLAB attuazione Crocker, Grier e Settimane di routine IDL, disponibile all'indirizzo: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , per assegnare lignaggi per i germogli appena appaiono, e per salvare i dati. Lignaggi vengono assegnati automaticamente dal minimizing distanze tra germogli putativi e potenziali madri in ogni fotogramma. (Se viene visualizzato un errore nella finestra di comando di MATLAB a causa di "combinatoria difficili", diminuiscono "Spostamento Max" e ripetere il monitoraggio.) Modificare i parametri nelle finestre popup come necessario per i vostri dati.
5. Curate le regioni scarsamente segmentato ed errori in ID o assegnazioni lignaggio utilizzando i vari strumenti grafici o tasti di scelta rapida (mostrati in una finestra popup, premendo il pulsante sopra il pannello "Selected Informazioni cella").
   • Slider, "Immagine precedente", "Immagine successiva" (Ctrl + sinistra / destra) - utilizzare per visualizzare e spostarsi tra i fotogrammi della serie dell'immagine.
   • "Immagine #" - visualizza il numero di fotogramma corrente negli assi destro e sinistro. Spostarsi in una cornice specificata digitando il suo numero nel giusto "Immagine #" casella di modifica.
   • "Cornice Delta" - mostra la differenza di numero di telaio tra gli assi destro e sinistro (Δ = destra - sinistra).
   • "Hide Text" (Ctrl + T) - commuta tra la visualizzazione degli ID delle celle agli assi giusto o no.
   • "Nascondi etichette" (Ctrl + L) - passare dalla visualizzazione del ID di cella negli assi di sinistra o meno.
   • Menu "Mask" popup - scegliere tra la visualizzazione di alcuna maschera, la maschera di cellulare, o qualsiasi definiti dall'utente sub-maschera per la visualizzazione nel riquadro di sinistra.
   • Menu a comparsa "Overlay" (Ctrl 1-9) - scegliere di visualizzare BF e strati di colore nel frame di sinistra. Spettacolo BF è l'unico che alterna lo strato BF o disattivare in entrambi gli assi. Passare dalla visualizzazione o meno selezionando il nome di sovrapposizione nel menu di nuovo ("*" indica appare overlay). Ctrl +1 alterna BF sovrapposizione, con 2-9 commutando le sovrapposizioni di colore in ordine.
   • "Set Colori" - utilizzano per determinare il colore per la visualizzazione di sovrapposizione. Una finestra popup interrogherà quale canale di fluorescenza per impostare, e quindi la tavolozza dei colori appare per definizione utente.
   • "Modificare le Regioni e le tracce" panel - questi controlli i cambiamenti effetto sulla regione maschera cellulare e le informazioni di traccia:
     • "Aggiornamento brani" (Ctrl + U) - Utilizzo di riassegnare ID di cella. Se non ci sono le celle sono selezionate in assi giusti, la GUI chiederà un ID cella per cambiare. Quando ID X è cambiato in Y, tutte le future istanze di X saranno cambiate a Y, e le eventuali future istanze della Y attuale, saranno passati a X. (Ogni tanto una cella passa avanti e indietro tra due ID, più volte. Questa è dovuto al monitoraggio che deve adattarsi a più ID in una regione oversegmented piuttosto che un errore nella funzione ID di aggiornamento.) Più celle possono essere selezionate e loro ID cambiati contemporaneamente, ma essere sicuri di dare a ciascuno un ID univoco. Per assegnare una regione ad un ID che non esiste nel file corrente, digitare "0" e ne verrà generato. Usare Ctrl + W per scambiare gli ID dei due celle evidenziate.
     • "Delete Selected Tracks" (Ctrl + D) - utilizzare per eliminare la cella selezionata o regioni cellulari più nella corrente giusta cornice assi. (Se non sono selezionate le celle, chiederà ID.) Per eliminare definitivamente tutte le istanze di una traccia ID, selezionare la casella accanto al DeLete pulsante brani selezionati (testo cambierà in "Delete All"). Questo è utile per sbarazzarsi di regioni spazzatura persistenti, ma prima controllate fotogrammi futuri per assicurarsi che l'ID non passa in una cella valido o regione nascere.
     • "Unisci Regioni" (Ctrl + A o M) - leviga e combina regioni cellulari. Fare clic su una cella o le celle negli assi giusti per selezionare (regione diventerà rosso se selezionato). Unire in una regione morfologicamente vicino per riempire fessure o piccoli pezzi mancanti utilizzando un elemento a forma di disco. Unione di due o più regioni vicine li unirà in una regione e dare l'ID più basso per la nuova regione. Questo è utile per le regioni sopra-segmentati (spesso quando le cellule hanno grandi vacuoli).
     • "Disegna regione" - utilizzare il mouse per disegnare una regione negli assi giusti dove desiderato e fare doppio clic per finire. Fornire un ID univoco non presente nel set di dati (compreso tra 1 e 65535). Annullare premendo Canc sulla tastiera.
   • "Monitoraggio Lineage" pannello - dopo il rilevamento,assegnazioni lignaggio sono generati automaticamente. Quando compaiono nuove regioni ID, il nuovo ID cella appare in rosa e una linea rossa è attirata sulla regione madre. Nuove regioni troppo grande per essere gemme o troppo lontano da potenziali madri appaiono in verde e vengono assegnati un ID madre di "NaN" ("non un numero", vedi tabella 2). Regioni esistenti al primo punto temporale hanno un ID madre di "0". Per risolvere incarichi individuali, immettere la madre e gli ID gemma nel modificare campi di testo e fare clic su "Fix". Per cancellare la madre di una cella, immettere "0", come la sua mamma. Un metodo più veloce è quello di selezionare due regioni la giusta immagine e premere CTRL + F. Questo assegnerà automaticamente la regione più anziani come la madre e la regione più recente come la figlia, mentre la cancellazione di eventuali incarichi madre precedentemente esistenti per la cellula figlia. ATTENZIONE: Cliccando "Calcola Lignaggi" in qualsiasi momento sarà ricalcolare tutte le assegnazioni lignaggio, compresi quelli che l'utente ha precedentemente curato.
   • Pannello "Selected Informazioni cella" - "Get INFO "mostrerà alcune misurazioni delle regioni selezionate negli assi giusti." Misure ... "permette all'utente di determinare quali misure sono visualizzate (così come definire la lista di default per le altre operazioni come" Esporta dati "). Può essere utilizzato per determinare gli ID e lignaggi (ad esempio, se la cella X ha una gemma al tempo t, è molto probabile che non hanno un'altra gemma al tempo t + 5 min) corrette.
   • "Salva modifiche" (Ctrl + S) - aggiornare il file * tappetino per riflettere le modifiche apportate dall'utente.. Usano più di frequente (non esiste una funzione undo)!
   • "Genera Parcelle" - apre la GeneratePlots GUI. Usato per tracciare rapidamente selezionata informazioni variabili e calcoli semplici per le regioni monocellulari evidenziati nelle giuste assi del ProcessTimeSeries interfaccia grafica, la loro media o la media di tutte le regioni in ogni fotogramma. Questa GUI può calcolare derivate prime grezze, ma essere sicuri di specificare l'intervallo di tempo corretto in alto a sinistra. I grafici possono essere inviati a una cifra per il salvataggio premendo il tasto "Generate Figura".
6. Per curare correttamente i dati: unire le regioni oversegmented; eliminare eventuali regioni non catturare l'intera cellula; assicurati rapporti madre-gemma sono assegnati correttamente (una linea rossa tra loro al momento di nascere nascita, quando l'ID bocciolo è rosa, vedere Tabella 2), ed eliminare eventuali ID verdi fissando l'ID, l'assegnazione alla regione una madre, assegnando nessuna madre ("0"), o cancellando la regione. Bud dati verranno aggiunti a quello della madre durante l'ultima analisi quindi non unire una regione gemma alla sua madre (che porterà a imprecisa stima del volume).
7. Controllare visivamente dati per ogni fotogramma fino all'ultimo tempo di interesse, ma non è richiesto di tutta la serie tempo se non utilizzando i frame successivi.
8. Assicurarsi di salvare le modifiche.
9. Ripetere i passaggi 3,1-3,7 per il file *. Tappetino per ogni posizione di fase.

4. Esportazione dei dati per l'analisi

1. Per esportare semplicemente misurazioni regione prime per ogni cella tramite time, spingere "Esporta dati". Le misure di interesse possono essere selezionati nella GUI che si apre, e saranno di uscita in uno spazio delimitato da *. Txt con i nomi delle variabili come intestazioni di colonna.
2. Per analizzare le serie per le cellule intere nel tempo, calcolare le informazioni del ciclo cellulare, e prendere derivati, premere "Time Series Analysis". Si aprirà una finestra che permette la selezione delle misure di interesse e l'input dei parametri di analisi (Figura 6).
3. Inserisci il momento dell'ultimo curata nella GUI (tutti i fotogrammi successivi vengono ignorati). I parametri di assegnazione leviganti e del ciclo cellulare di default funzionano bene per la nostra aploidi e ceppi diploidi impressi in intervalli di 5 min, ma questi possono dover essere variato per i migliori risultati. (Verificare che i valori dei parametri sono appropriati determinando manualmente il tempo in erba e la divisione per un set di dati di test e confronto per le prestazioni dell'algoritmo automatico.)
4. Quando tutti i parametri sono impostati, spingere "analizzare" a:
   1. Controtruct array per ogni misurazione crudo e sottrarre il fondo (misurata come l'intensità media della zona non-cella del primo frame in ogni film fluorescente, o può essere specificato per tenere conto di autofluorescenza media per pixel cella).
   2. Montare una spline smoothing per le misure selezionate per eliminare il rumore di misura ad alta frequenza (come discusso in ^9).
   3. Determinare automaticamente gemma emergere e tempi di divisione cellulare per ogni cella in base alle variazioni della pendenza della serie storica del volume come discusso in ^9. Le misure bud saranno poi aggiunti alle misurazioni della madre tra emersione e la divisione di ogni ciclo per tutta una serie temporale delle cellule contigue. Una progressione del ciclo cellulare normalizzato venga calcolato che varia da 0 a 2 da divisione a divisione.
   4. Montare un smoothing spline di prendere stabile 1 ^° e 2 ^nd derivati ​​delle misure selezionate. (Ai fini di derivati ​​ben definiti, serie temporalisono realizzati continuo attraverso divisione spostando dati per il seguente ciclo cellulare per soddisfare l'endpoint per il ciclo precedente.)
   5. Uscita crudo e serie storiche lisciato per tutte le regioni, e tutta levigata cella, continua, e serie storiche differenziata come un array per ogni misurazione. Il primo elemento è un indice di colore per sottrazione del background, il resto della prima fila è in ID di cella, il resto della prima colonna rappresenta il numero del fotogramma, ed i restanti elementi tenere le serie per ogni singola cella di una colonna con ciascuna riga corrispondente al telaio nella prima colonna. Una simile serie di ciclo cellulare serie temporali progressione e informazioni di derivazione viene anche emesso. L'array "LineageArray" contiene una tabella con ogni riga rappresenta un rapporto madre-bocciolo e il primo al quinto colonne sono ID madre, bud ID, telaio di prima regione gemma, stimato telaio in erba, e la trama a divisione di stima. I dati vengono esportati in un file *. Mat (file di dati MATLAB).

Risultati

Un esperimento condotto con successo e analizzato produrrà serie temporali per lo più continua di cellule intere singole con realisticamente assegnato emergere bocciolo e tempi di divisione. Come esempio, abbiamo eseguito il protocollo di cui sopra con un ceppo di lievito aploidi esprimendo una copia integrata della proteina fluorescente Cerulean (PCP) guidato dal promotore costitutivo ADH1 osservare come la crescita e l'espressione globale può variare nel tempo in cellule singole (Tabel...

Discussione

Il protocollo di cui sopra descrive un metodo semplice per ottenere e analizzare i dati di fluorescenza di serie storiche con limitata esperienza in microfluidica o nello sviluppo di software. Esso permette di ottenere in time-lapse film di fluorescenza di cellule di lievito singoli; estrarre dimensioni delle cellule pertinenti e misure di espressione; monitoraggio curato e assegnazioni lignaggio, e analizzare il comportamento delle cellule intere nel tempo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibili in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit