出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

要約

我々は、単一セルの時系列データを抽出するために蛍光成長酵母細胞の顕微鏡ムービー、GUIベースのソフトウェアパッケージを取得する単純なプロトコルを提示する。分析では、目視検査と追跡対象データの手動キュレーションと統合され自動化された系統と分裂時間の割り当てが含まれています。

要約

蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一細胞レベルでの多くの生物学的過程の研究の強力なツールとなっています。具体的には、遺伝子発現の時間依存性を示すムービーは、その規制のダイナミクスへの洞察を提供するが、単一細胞の蛍光ムービーを取得し、分析する多くの技術的課題がある。ここでは、そのようなデータを生成するために市販のマイクロ流体培養装置を用いた単純なプロトコル、およびMATLABベースのグラフィカル·ユーザー·インターフェース（GUI）系蛍光画像を定量化するためのソフトウェアパッケージを説明する。ソフトウェアセグメントとトラックセル、ユー​​ザが視覚的にデータのエラーをキュレーションすることができますし、自動的に系統と分裂時間を割り当てます。 GUIはさらに、全細胞トレースならびにそれら第一及び第二の時間導関数を生成するために時系列を解析する。ソフトウェアはS.のために設計されましたが出芽酵母は、そのモジュール性と多様性は、それトン許可する必要がありますいくつかの変更を他の細胞型を研究するためのプラットフォームとしての役割を果たす、Ø。

概要

遺伝子発現の単一細胞解析は遺伝子調節の多くの側面の我々の理解を進めたた。フローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて蛍光レポーター発現の静的なスナップショットは、単一セルの発現の分布に有用な情報を提供するが、直接遺伝子発現動態を通知するために必要な時系列データの履歴と進化を欠いている。蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一セルの測定とその歴史の両方を取得する手段を提供します。種々の実験および解析技術は、このような遺伝子調節機能洞察を付与する、蛍光レポーター発現の映画を取得し、定量化するために開発されている（概説^1を参照）は、セル間のばらつき^2,3、細菌persister形成^4、転写として開始と伸長^5、6,7を破裂転写、細胞周期依存性^8,9、および遺伝^10。しかし、OBTaining品質単一細胞蛍光時系列は、培養の重要な技術的課題に制御環境で、取得した蛍光映画のハイスループット定量化における細胞の単層を伴う。ここでは、Sの蛍光ムービーを取得し、分析するための手順を説明細胞培養装置の製造における、またはソフトウェア開発の経験のない必須（ 図1） セレビシエ 。

まず、我々は詳細例プロトコルを一つ以上の蛍光レポーターを表現する出芽酵母用蛍光時系列ムービーを生成する。カスタマイズされたマイクロ流体文化室が建設され、成功した以前に^11-13採用されてきたけれども、我々はCellAsic（ヘイワード、カリフォルニア州）から市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。システム閉じ込める単分子層の成長への細胞とは、灌流環境の継続的な制御が可能になります。我々は提示顕微鏡プロトコルはfluorescを取得するための簡単​​な手段です。単一の酵母細胞の蛍光類似動画データを得レンス出芽酵母の映画が、任意の修飾実験プロトコルは、（カスタマイズ培養装置、代替メディア条件等 ）置換されていてもよい。

次に、時系列データを抽出するためにグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）系蛍光時系列の迅速分析（移植片）のためのGUIと呼ばれるMATLABのソフトウェアパッケージ（Mathworks社、ナティック、MA）を使用して、映画の分析を概説単一細胞のために。移植片は、細胞をセグメント化し、追跡すると蛍光強度と幾何学的な情報を抽出することで汎用性の高い、オープンソースのソフトウェアパッケージセルID ¹⁴と同様の機能を備えています。しかし、移植片は重要な追加機能を提供します。まず、セ​​グメンテーションとデータの正確性ではなく、分析後の外れ値の領域のトレースだけ統計ゲーを確認するために追跡の結果を簡単にインタラクティブな編集を提供しています。また、分析にautomaticallに延びyは出芽酵母の関心系統および細胞周期の点を指定する。母と娘は、2つの独立したセル領域を形成するために分割したときに決定することは、セル全体（任意の接続つぼみ含む母）細胞周期⁸全体の測定値を決定する非常に重要です。スイートは、これらのタスクを達成するために3つのモジュールから構成されています。最初のセグメントはセル領域に焦点を当てたとやり場の明視野像との対比に基づいており、ユーザが定義し、視覚的にセグメントパラメータをテストすることができます。第二トラック（クロッカーら IDLルーチンのブレアとデュフレーヌのMATLAB実装を使用して、で入手可能：。 http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ）および時間を介して細胞領域を測定し、自動的に系統を割り当て、および目視検査を可能にする誤り訂正。シンプルなプロットのGUIは、クエリの単一セルのプロパティに含まれています。第三のモジュールは、つぼみ出現と分裂T​​Iを帰しMES、および全細胞時系列データならびにそれら第一及び第二の時間導関数を^（9などを参照）を出力する。解析モジュールは、選択した統計ソフトウェアでその後の研究のためのスペース区切りのテキストフ​​ァイルとしてデータを出力します。したがって、パッケージは、ユーザがグラフィカル·インターフェースを介して高品質の時系列データを抽出することができます。我々は、細胞周期⁹の関数として単一出芽酵母細胞内でリアルタイムの転写率を推定するためにこの方法を使用している。モジュールは出芽酵母のために最適化されているが、パラメータや、必要に応じて、自由に利用可能なコードは、他の生物やイメージタイプに適合させることができる。セグメンテーション、トラッキング、系統割り当てアルゴリズムは、割り当てられたイメージングおよび問題の生物の種類に特異的であり得る。既存のアルゴリズムが置き換えられますが、それでもユーザーフレンドリーな目視検査とセグメンテーションの補正と常にoccuトラッキングエラーを可能にするGUIインタフェースを保持することができます任意のアルゴリズムでR。

プロトコル

1。マイクロ流体商工会議所で成長シングル酵母細胞の蛍光顕微鏡のビデオを入手

1. 新たに成長しているプレートから細胞を1ミリリットルSC培地（2％グルコースとアミノ酸の完全な補完と合成定義されたメディア）を接種し、一晩培養をインキュベート〜30時ころドラム上16時間℃の最後のOD _600nmの初期_の対数増殖期のために〜0.1であるような文化を準備します。
2. OD _600nmの = 0.1にスターター、必要に応じて文化や新鮮な試験管で再生する1ミリリットル追加の6-8時間を希釈。これは、マイクロ流体デバイスへのロードに適し密度で栄養豊富な定常状態で成長して細胞を提供する。 （代わりに、実験に必要な細胞を調製するために必要な手続きと手順1.1から1.2を交換してください。）
3. CellAsicからY04Cマイクロ流体培養プレートを準備します。出荷ソリューションを削除;滅菌水で井戸をすすぎ、そしてONIX灌流システムフローを使用チャネルをフラッシュする5分間6 psiで井戸1-6を通る水。その後、10秒（ローディングチャンネルがはるかに高い流量を持っており、別々にフラッシュする必要があります）のために6 psiでうまくロード8からの流れ。
4. すべての井戸から水を取り出して、よく8ロードセ​​ル内の入口で250μlのSC井戸1-6とステップ1.2からの培養液50μlと交換してください。 （代わりに、異なる条件の切り替えを必要とする実験のための入口の井戸1-6に目的のメディアを配置します。）
5. プレートにONIXマニホールドをシールし、よくするための出発メディアを保持する唯一の入口から6 psiで少なくとも5分間、続いて2分間6 psiで入口井戸1-6から流してプライミングチャネルと文化室を開始実験。ステップ1.7になるまで継続的にこれを流す。
6. 実験のために顕微鏡を準備します。私たちは、カスケードII裏面照射型EMCCDカメラ（Photometrics、ツーソン、アリゾナ州）とツァイスアクシオObserver.Z1広視野顕微鏡を使用し、200ルーメンメタルハライドアーク退色を防ぐために10％に減衰蛍光励起用ランプ（PRIOR科学、ロックランド、マサチューセッツ州）。複数の蛍光チャネルで取得するために必要な切り替え時間を最小限に抑えるために、我々夫婦CFP、YFP、およびRFPのための適切な励起/発光フィルタにシングル、トリプルバンドパスダイクロイックフィルタキューブ（;セット89006クロマルネサステクノロジ、滝、VTベローズ）外部、高速スイッチングフィルターホイール（Ludl電子製品、ノヴァ、CA）に設定された。
7. 客観的な（必要に応じて、我々はツァイスプラン - アポクロマート63X/1.40オイルDICを使用）に浸漬液の数滴を置き、倒立顕微鏡のステージに確実にマイクロ流体デバイスをマウント。プレートを確保することが実験を通して段階で全くずれないデータ分析時にセルトラッキングを向上させます。我々は、単にそのシフトを防ぐために、ステージにマウントプレートをテープ。
8. 埋め込み位置のいずれかを使用して最初の培養室の左端の3分の1（室の高さは最も小さいです）に焦点を当てるるマーカー。よくメディア入口から流れを切り、5秒バーストで6 psiでセルの負荷だけでなく8からの流れ。細胞の培養室を見て回るためにステージを移動します。所望の細胞密度が達成されるまでロードフロー時間と圧力を増加しますが、新鮮な培地がチャンバに入る左端の障壁をオーバーロードし、目詰まりしないようにしてください。
9. よく6 psiで始まるメディアを含むメディアの入口から流れる始める。
10. 変形者（Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール）または他の顕微鏡検査の自動化と制御ソフトウェアでは、時間をかけて複数のステージ位置で複数の画像を取るために多次元買収をセットアップ。数および時間点の間隔を設定する。 〜10個の細胞それぞれにいくつかの段階のポジションを選択してください（より迅速に混雑されます）。我々は通常、それぞれが各時点で取得のため〜11秒を必要とする、最大16の位置に5分間隔と画像を使用しています。
11. そのため、各ステージ位置における各時点番目に取得を設定する電子プログラムがされます：;獲得BF透過光明視野（BF）変形者の内蔵オートフォーカス方式（フォーカス精度をより細かく制御を提供し、それぞれのステージ位置の開始時にカスタム記述ジャーナルとしてオートフォーカスを実装）を使用して、画像に焦点を当て焦点面（FP）〜+1程度の画像; FP（画像間で必要に応じてフォーカスを変更するためのカスタム書かれたジャーナルを使用）-4〜程度でフォーカスのBF（BFOOF）画像を取得し、1つはグレースケール獲得最小限の退色との迅速な取得のために最適化された設定を使用してFPに各蛍光レポーターのための画像。
12. 必要な場合は、無細胞と培養チャンバーの分野で各蛍光レポーターの背景とシェーディング補正画像を得る。
13. ONIX制御ソフトウェアでの実験のために流れのプログラムを準備します。同時に変形者で取得プログラムとONIX制御ソフトウェアのフロープログラムを開始します。
14. 実験の最後に、国連修正蛍光像（必要な場合）、および必要に応じて。STKムービーファイル（位置1用など作成BF、BFOOF、CFP、YFP及びRFP映画に各段階の位置で各画像チャネルについて。TIFファイルを結合であっても、背景とシェーディング）。

2。 MATLABでFormatData GUIを使用してトラッキングするための形式とセグメントデータ（図2）

1. データ入力GUIを開くには、MATLABでFormatData.mファイルを実行します。上部には、指定するか、データディレクトリを設定するには、画像ファイルを含むフォルダを参照し、その後の実験で記録されたデータ型とイメージファイルを指定するためにGUIを使用します。
2. 右側には、実行するためにどの解析タイプを示すために、 "タイムラプス"の隣にあるラジオボタンを選択します。 "タイムラプス"時系列（ 例えばマイクロ流体チャンバー内で増殖する細胞の動画）などの画像のシリーズを扱います。 "静的"母集団から取られたスナップショットのセット（DIFで撮影例えば複数の画像のように、それぞれの画像シリーズを扱いますシングルスライド標本上ferentポジション）。この移植片バージョンでは、複数の位置のための時間経過のデータを処理することができますが、それぞれの位置に別々のファイルとして（ステップ2.14を参照）。
3. フレーム内で見かけ細胞運動を最小限に抑えるために映画の中で、それぞれの画像をシフトすることによって不正確な段階の動きを補正するために画像レジストレーションのためのチェックボックスをオンにします。我々は強く、それが大幅に（後で手動トラックキュレーションを減らすこと）追跡向上としてこれをお勧めしますが、画像は国境でシフトされている場所を埋めるためにランダム、 "ホワイトノイズ"ピクセル値を追加します。また、ステップ2.7にセグメント化されたBFの画像を表示した後、またはステップ2.13まで、任意の時点で選択することができる。
4. "データチャンネル"パネルで "明るいフィールド"チェックボックスをオンにします。 BF·イメージをロードするため右に "選択"をクリックします。 * TIFファイルの場合、選択しながらShiftキーを押したままつのムービーに対応するすべてのBFのイメージを選択し、 "開く"をクリックしてください。 * STKファイルの場合は、単に関心のBFスタックを選択します。画像は、成功している場合完全に認識される、ファイル名は "データの認識"パネルの右側にあるポップアップメニューに表示されます。 * TIFファイルの場合、ファイル名が（ - BF_t001など取得時のシーケンシャル名前でファイルを保存する）が正しい順序で表示されることを確認してください。
5. "ブライトフィールド（焦点）"チェックボックスをオンにし、右側にポップアップで表示されますBFOOFファイルをロードするステップ2.4​​のように、 "選択"ボタンを使用します。 （BFOOFよく63XセグメントでFPに相対BF -4程度として得られる。）
6. "セルマスク"チェックボックスをオンにします。 "マスクソース"パネルで、 "セグメントBF"の横にあるラジオボタンを選択します。セグメンテーションGUIを開くには、 "パラメータ"ボタンを押してください。 （代わりに、後者を押すと、ステップ2.4​​のように映画を選択し、 "マスクファイルを選択"ボタンの横にあるラジオボタンを選択することにより、あらかじめセグメント化されたマスクのムービーを選択し、この場合は、BFOOFムービーが必要とされない、と2.8ステップにスキップすることができます。）
7. 異なるセグメントパラメータを設定します（それぞれの説明が表示することができます"パラメーターの説明"）を押すと"テスト"（ 図3）をクリックすることで、セグメンテーションの品質をテストすることによってED。成功裏に分割された領域は、マゼンタの境界線と緑になります。映画の中の複数の時点を確認するには、スライダを使用してください。セグメンテーションが良好である場合に、FormatData GUIにセグメントパラメータを返すように "完了"を選択します。
8. "カラー画像"ボックスをチェックします。テキストエディットボックスの最初の蛍光画像チャネルの色の名前を入力し、 "追加して選択し、"ステップ2.4​​のように、色のファイルをロードするために押します。色名は、左側のリストボックスに追加され、ファイル名が右側のテーブルに追加される。間違いがカラーファイルを読み込むで作られている場合は、左側のリストボックスで色の名前を選択し、ファイルを削除する "カラーを削除"をクリックしてください。各カラーチャンネルごとに繰り返します。
9. 蛍光色（ 例えば蛍光標識核→ヌクレイックアシッズリサーチのいずれかに基づいて、追加のサブ領域をマスクした場合耳領域マスク）が望まれている、 "カラーマスク"チェックボックスをオンにします。そうでない場合は、2.12に進みます。 "カラーマスクソース"パネルで、テキスト編集ボックスにサブ領域マスク名を入力します。 "カラーマスクソース"パネル（色は、ステップ6で追加されていることが必要）のポップアップメニューから色を選択し、しきい値のテストGUIを開くには、 "パラメータ"を押してください。
10. 自動的に大津の方法^15を使用してしきい値を決定するために、画像がしきい値（ 図4）の上に保存領域が強調表示されます"自動しきい値"ボタンを押してください。しきい値を手動で編集ボックスを使用して調整することができる。しきい値はすべての時点に適切であることを確認するには、スクロールバーを使用します。満足したら、FormatData GUIへのしきい値を返すように "Done"を押してください。
11. 選択されたカラー画像に適用し、しきい値モジュールを使用してサブ領域マスクを生成するために "追加およびセグメント"を押してください。カラーマスク名と関連するソースはrで、左側の表に表示され右表に現れるecognizedファイル名。 （代わりに、押し "を追加し、[選択]、"既製のサブ領域マスクファイルをロードします。）
12. 下部には、指定するか、保存ディレクトリとして使用する目的のフォルダを参照します。
13. ：画像（で入手フランソワNedelecによって開発tiffread2.mコードを使用して、ファイルを読み込むには、 "データの書式設定"を押しhttp://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 、プロセスデータ、および*を作成します）指定したフォルダにあります。マットはファイル。このファイルには、ProcessTimeSeries GUIへの入力として機能します。
14. 各ステージ位置のために映画のセットのためのステップ2.4​​から2.13までを繰り返します。

3。 ProcessTimeSeries GUI、およびバーテンIDとリネージュの割り当て（図5）との時間を通して、トラックセルと系統

1. 追跡GUIを開くには、MATLABでProcessTimeSeries.mファイルを実行します。開封後は、次のパラメータを設定するGUI：
   • "商工会議所の高さ"（パネル、左上の "ファイルI / O"） - これは、細胞が捕捉されている室の高さを示している。それは^、8とセル領域のメジャーとマイナーの軸に基づいて3次元楕円体として細胞容積を近似における制約として使用されています。
   • "ミクロン/ピクセル"（パネル"ファイルI / O"） -断面積および体積がそれぞれ^、2ミクロンと³ミクロンで算出することができるので、画像内程度の距離に画素を較正するための変換係数。
   • "フィルタパネル"（以下 "ファイルI / O"パネル） - セットの最小値とマスクのジャンク領域を除外するための最大のパラメータ： "エリア" - ピクセル領域面積、 "シズオカ" - 偏心率、→0として、より円形; "SF" - →1のようなより円形の形状係数、。
2. "ファイルI / O"のパネルで "ロード画像"をクリックして、FormatData GUIによって関心の出力*マットのデータファイルを選択します。領域マスク（および任意のサブ領域マスク）各カラーチャンネルに適用される、異なった測定値の数（ 表1）作られている。データファイルが保存されている。分析は最初から再開する必要がある場合（以前のセッションからProcessTimeSeriesにファイルをロードする場合、それは要求されます注意：それはFormatData GUIから新鮮あたかもこれは、既に完了した任意のトラックのキュレーションを消去し、データを扱います場合。誤ってすぐに上書きされる前にキュレーション*。マットファイルを防ぐために、MATLABコマンドウィンドウでCtrl + Cを押して、再起動した。）
3. 次に、細胞を追跡します。 "トラックセル"パネル（ "フィルタ"パネルの隣）で、次のパラメータを設定します。
   • "最大変位" - セルが別のセルとしてラベルされる前に、隣接する画像間を移動することができますピクセル単位で最大距離。より高い変位アルゴリズムが多くのセルを移動さを占めることを意味し、それはまた、群集のセル領域をマッチングの複雑さを増大させる。私たちは、（ステップ3を参照してください12で開始し、エラーがトラッキングで発生した場合減少.4）。
   • "最小長" - 有効なデータ系列考慮すべき細胞トレースのオカレンスの最小数。我々は、任意の本当の痕跡の除去を防ぐために1を使用しますが、これは短命、スプリアス領域のトレースに分割結果場合に増加させることができる。
   • "フレームメモリ" - 連続したフレームの最大数のセル領域が消えることができ、それが戻ったときに同じIDが与えられる。それは "フレームメモリ"よりも長い間消えている場合は、戻ったときに、新しいIDが与えられます。私たちは、領域が戻る前に2フレームのセグメンテーションでは見逃されることができるように2を使用します。
4. 地域の重心を（：ブレアとクロッカーのデュフレーヌMATLABの実装、グリア、および週IDLルーチンで利用可能な使用して、次への1フレームから領域を追跡する"トラック·セル"をクリックhttp://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ） 、新たに出現する芽のための系統の割り当て、およびデータを保存する。系統は自動的分によって割り当てられ推定芽、各フレーム内の潜在的な母親の間の距離をimizing。あなたのデータのための必要に応じてポップアップウィンドウに（エラーは "難しい組み合わせ論"によるMATLABコマンドウィンドウに表示された場合は、 "最大変位"を減少させると追跡を繰り返してください。）パラメータを変更。
5. さまざまなGUIツールまたはショートカットキー（ "選択されたセル情報"パネルの上にあるボタンを押すことによって、ポップアップウィンドウに表示されている）を使用して、不完全に分割された領域とIDまたは系統の割り当てで間違いをキュレーション。
   • スライダー、 "前の画像"、 "次の画像"（Ctrlキー+左/右） - 表示し、画像シリーズのフレーム間を移動するために使用する。
   • "画像＃は" - 左と右の軸の現在の画像のフレーム数が表示されます。 "＃画像"編集ボックス右側でその番号を入力して、指定されたフレームに移動します。
   • "デルタフレームは、" - （ - 左Δ=右）左右の軸間のフレーム数の差を示しています。
   • （Ctrlキー+ T） "テキストを隠す" - でセルIDを表示を交互右軸はどうか。
   • "非表示のラベル"の（Ctrl + L） - 左軸かどうかでセルIDを表示を切り替えます。
   • "マスク"ポップアップメニュー - 、マスク、携帯マスク、または左側のパネルに表示するための任意のユーザー定義のサブマスクを表示していないのどちらかを選択。
   • "オーバーレイ"ポップアップメニュー（Ctrlキー1から9）が - 左フレームのBFと色層を表示するように選択。ショーBFは、両方の軸にオンまたはオフBF層を切り替えるだけです。 （ "*"オーバーレイが表示されている意味）再びメニューのオーバレイ名を選択して表示かどうかを切り替えます。 2-9の順序でカラーオーバーレイをトグルするとCtrlキー+1トグルBFオーバーレイ、。
   • "設定した色は、" - オーバーレイ表示の色を決定するために使用します。ポップアップウィンドウを設定するためにどの蛍光チャネル照会した後、カラーパレットは、ユーザー定義のために表示されます。
   • パネル "地域とトラックを変更する" - これらは、セル領域マスクとトレース情報に与える影響の変化を制御します。
     • "更新トラック"（Ctrlキー+ U）は - 再使用セルIDを割り当てる。ない細胞は、右の軸で選択されていない場合は、セルIDを変更するために、GUIは、プロンプトが表示されます。 ID XはXの将来のすべてのインスタンスがYに変更し、現在のYの任意の将来のインスタンスは、時折一つのセルを繰り返し2 IDは、間を前後に切り替えますX.（に切り替えられますされ、Yに変更された場合、これはoversegmented地域ではなく、更新ID機能にエラーで複数のIDを収容しようとしてトラッキングに起因している。）複数のセルが選択され、それらのIDが同時に変更しましたが、 それぞれに一意のIDを与えることを確認することができます。現在のファイルに存在しないIDにリージョンを割り当てるには、 "0"を入力し、1が生成されます。 2ハイライトセルのIDを交換するには、Ctrl + Wを使用してください。
     • "選択したトラックを削除します"の（Ctrl + D） - 現在の右の軸枠で選択したセルまたは複数のセル領域を削除するために使用します。ない（セルが選択されていない場合、IDを求めるプロンプトが表示されます。）永久IDトレースのすべてのインスタンスを削除するには、デの横にあるチェックボックスをオン選択したトラックのボタンをクリックします（テキストは "すべて削除"に変更されます）LETE。これは永続的なジャンク領域を取り除くのに便利ですが、最初のIDが有効セルまたは芽領域に切り替えていないことを確認するために将来のフレームを確認してください。
     • （Ctrlキー+ AまたはM） "地域のマージ" - セル領域を滑らかにして組み合わせたものです。選択して、右の軸のセルまたはセル（選択した場合の領域が赤に変わります）をクリックします。つの領域にマージする形態学的に円盤状の要素を使用して亀裂や小さな欠けているチャンクを埋めるために閉じます。二つ以上の近くの領域をマージするつの領域にそれらを組み合わせて、新たな領域に最も低いIDを与える。これはオーバーセグメント化された領域（多くの場合、細胞が大きな液胞を持っているとき）に便利です。
     • "地域を描く" - 目的の右軸領域を描画し、ダブルフィニッシュにクリックしてマウスを使用しています。データセット（1〜65535）には存在しない固有のIDを提供します。キーボードのDeleteを押してキャンセルします。
   • "リネージュトラッキング"パネル - 追跡後、系統の割り当てが自動的に生成されます。新規IDの領域が表示されたら、新しいセルIDがピンク色で表示され、赤のラインはマザー領域に描画されます。芽であることが大きすぎるか遠すぎる可能性の母親からの新しい領域が緑色で表示され、 "NaNは"（ "しない番号"、 表2を参照）の母のIDが割り当てられます。第1の時点に存在する領域が "0"の母IDを持っている。個々の割り当てを修正するには、テキスト編集の分野で母親と芽のID​​を入力し、 "修正"をクリックしてください。セルの母親を消去するには、その母親として "0"を入力してください。高速な方法は、右の画像の2つの領域を選択し、Ctrlキー+ Fで押すことです娘細胞のための任意の既存の母の割り当てを消去しながら、これは自動的に、娘として母と新しい領域として古い地域を割り当てます。注意：いつでも "計算系統は"再計算ユーザーが以前にキュレーションしているものも含め、すべての系統の割り当てを、意志クリック。
   • "選択されたセル情報"パネル - "私を取得NFO "は右の軸で選択した領域の一部の測定値が表示されます。"測定は... "（"データのエクスポート、ユーザーだけでなく、のような他の操作のためのデフォルトのリストを定義します）が表示されている測定値を決定することができます "。使用することができます正しいIDと系統（ 例えば、セルXは、時刻tにおける芽を有する場合、それはおそらく時刻tにおける別の芽を持っていない+ 5分）を決定する。
   • アップデート*マットファイルのユーザの変更を反映するために - 。（Ctrl + S）を "変更を保存"。頻繁に使用する（元に戻す機能があるなし）！
   • "プロットの生成" - GeneratePlots GUIを開きます。迅速ProcessTimeSeries GUI、それらの平均、または各フレームのすべての地域の平均値の右側の軸で強調単一セル領域に対して選択した変数の情報や簡単な計算をプロットするために使用します。このGUIは、荒い最初の導関数を計算しますが、左上に正しい時間間隔を指定して確認することができます。プロットは "図を生成する"を押して保存するための図に出力することができる。
6. データを適切にキュレートするには、次のいずれかのoversegmented領域をマージ、セル全体をキャプチャしない任意の領域を削除し、母芽の関係が適切に割り当てられている（赤線は芽の出現時にはそれらの間に表示され、芽のIDがピンクであるとき、以下を参照してください確認してください表2）、および（ "0"）は母親を割り当てていない、または地域の削除、地域の母親を割り当て、IDを固定することにより、任意の緑色のIDを排除。その母親に芽領域（それが不正確なボリューム推定につながる）マージしないようにつぼみのデータが最終的な分析の間に母のそれに追加されます。
7. 視覚的に最大近隣の最後の時間に各フレームのデータを検査し、それ以降のフレームを使用しない場合には、全体の時系列が要求されない。
8. 変更内容を保存してください。
9. 繰り返して、各ステージ位置のために*。マットファイルの3.1から3.7を繰り返します。

4。分析のためのデータのエクスポート

1. 単にティムを通じて各セルの生の地域の測定をエクスポートするにはeは、 "データのエクスポート"を押してください。興味のある測定が開きGUIで選択することができ、それらはカラムヘッダーと変数名とスペースで区切られた*。txtのファイルに出力されます。
2. 時間の経過と共に全体の細胞のための時系列を分析し、細胞周期の情報を算出、およびその誘導体を取り、 "時系列解析"を押してください。ウィンドウは、関心および分析パラメータの入力（ 図6）の測定値の選択を可能にするオープンする。
3. GUI（以降のすべてのフレームが無視されます）にキュレート前回のポイントを入力します。デフォルトのスムージングと細胞周期割り当てパラメータは5分間隔で撮像当社の半数体と二倍体株のためにうまく動作しますが、これらは、最良の結果を得るために変化させる必要があるかもしれません。 （パラメータの値は手動でテストデータセットのために出芽と分裂時間を決定し、自動化されたアルゴリズムの性能を比較することにより、適切であることを確認してください。）
4. すべてのパラメータが設定されると、プッシュする "分析"
   1. コンズそれぞれの生の測定のための配列をtructと（各蛍光のムービーの最初のフレームの非セル面積の平均強度として測定、またはセルのピクセルあたりの平均自己蛍光を考慮して指定することができます）バックグラウンドを差し引く。
   2. 高周波測定ノイズます^（9章 ）を除去するために選択された測定値に平滑化スプラインをフィット。
   3. 自動的に⁹で説明したように音量時系列の傾きの変化に基づいて、各セルの芽の出現と細胞分裂の回数を決定します。つぼみの測定は、次に連続する全細胞の時系列のための出現と分裂、各サイクルの間に母親の測定値に追加されます。正規化された細胞周期の進行にも分割の分割は0〜2の範囲で計算される。
   4. 安定した¹回目と選択測定の第2 ^回微分を取るために平滑化スプラインをフィット。 （明確に定義された誘導体の目的のために、時系列前のサイクルのエンドポイントを満たすために、次の細胞周期のデータをシフトすることによって分裂にわたる連続的な作られています。）
   5. すべての地域の出力生と平滑化時系列、および全細胞平滑化、連続しており、各測定のための配列として差別化された時系列。最初の要素は、背景減算用のカラーインデックスであり、最初の行の残りの部分は、セルIDを保持する第1列の残りの部分は、フレーム番号であり、残りの要素は、各行と列に各単セル用の時系列を保持する最初の列のフレームに対応する。細胞周期の進行時系列及び系統情報の類似の配列はまた、出力される。配列 "LineageArrayは"第五列を通じて母芽関係と最初を表す各行を持つテーブルを含む母ID、つぼみID、最初のつぼみ領域推定出芽フレーム、推定分割フレームのフレームです。データは、*。マットファイル（MATLABデータファイル）にエクスポートされます。

結果

正常に実行され、分析実験は、現実的に割り当てられた芽の出現と分割時間を持つ単一の細胞全体のために主に連続的な時系列が得られます。例として、我々は表4、Y47の成長とグローバルな表現は、単一の細胞で、経時的に変化するかを観察するために構成的ADH1プロモーターによって駆動セルリアン蛍光タンパク質（CFP）（の統合されたコピーを表現ハプロイド酵...

ディスカッション

上記のプロトコルでは、マイクロ流体、またはソフトウェア開発の限られた経験を有する蛍光時系列データを取得して分析するための簡単​​な方法が記載されている。バーテン追跡および系統の割り当て;、関連するセルサイズおよび発現測定値を抽出し、それは1つは、単一の酵母細胞の経時蛍光ムービーを取得することができ、市販のマイクロ流体培養装置を用いて、時間と汎用性の高?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit