المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين<em&gt; في المختبر</em

Summary

نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان.

Abstract

الجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في الحيوانات الفقارية، ويلعب دورا حاسما في التمثيل الغذائي في الجسم كله، وكذلك في عملية الأيض الخلوية. العديد من الطرق للكشف عن الجليكوجين موجودة بالفعل ولكن فقط عدد قليل من الكمية. نحن هنا وصف طريقة استخدام عدة فحص Abcam الجليكوجين، والتي تقوم على تدهور محددة من الجليكوجين إلى جلوكوز عن طريق غلوكوأميلاز. ثم يتأكسد الجلوكوز خصيصا لمنتج أن يتفاعل مع التحقيق OxiRed لإنتاج مضان. المعايرة دقيقة وحساسة ويمكن أن يتحقق على مقتطفات الخلية أو أقسام الأنسجة. ومع ذلك، وعلى النقيض من تقنيات أخرى، فإنه لا يعطي معلومات حول توزيع الجليكوجين في الخلية. كمثال على هذه التقنية، وصفنا هنا المعايرة من الجليكوجين في اثنين من خطوط الخلايا والصينية CCL39 الليفية الهامستر الرئة والقولون وسرطان الإنسان LS174، المحتضنة في normoxia (21٪ O ₂₎ مقابل نقص الأكسجة (1٪ O _2). افترضنا أن نقص الأكسجين هو سيجنال التي تعد خلايا لتجميع وتخزين الجليكوجين من أجل البقاء على قيد الحياة ^1.

Introduction

الجليكوجين هو بوليمر multibranched من بقايا الجلوكوز، والتي هي موجودة في السيتوبلازم العديد من أنواع الخلايا. وهي واحدة من أهم أشكال تخزين الطاقة في الخلايا ويلعب دورا هاما في أيض الجلوكوز. معظم خلايا الثدييات هي قادرة على انتاج وتخزين الجليكوجين، والتي يمكن أن يتحلل سريعا إلى جلوكوز لتعزيز إنتاج وتحلل ATP أثناء الإجهاد الأيضي. خلايا الكبد تنتج كميات هائلة من الجليكوجين لتنظيم مستوى السكر في الدم وبالتالي توفير امدادات مستمرة من الجلوكوز في الجسم. في المقابل، فإن تركيز الجليكوجين في خلايا أخرى (العضلات، وخلايا الدم الحمراء، الخ) منخفضة نسبيا. ومع ذلك، محليا، وهذه الكميات كافية لتوفير الطاقة على المدى القصير عند فجأة تتعرض الخلايا لبيئة المحرومين من المواد المغذية.

توليف الجليكوجين والجليكوجين انهيار يتبع نفس الخطوات في جميع الأنسجة (الشكل 1). أولا، الجلوكوزيدخل الخلايا عن طريق ناقلات الجلوكوز (افراط)، ويتم تحويلها بسرعة من الجلوكوز 6 فوسفات (G6P) إلى جلوكوز-1-الفوسفات (G1P) من خلال فسفوغلوكوموتاز. ثم يتم تعديل G1P الى UDP الجلوكوز، ويتم إرفاق C1 الكربون من UDP الجلوكوز إلى بقايا التيروزين من glycogenin، البروتين رسو الجليكوجين. هذا الجزيء، يعتبر التمهيدي الجليكوجين، تم تمديده عن طريق الحجز من UDP الجلوكوز إلى جلوكوز عن طريق محطة α (1 → 4) السندات عن طريق سينسيز الجليكوجين. أخيرا، عندما يتم تشكيل سلسلة خطية من أكثر من 11 بقايا الجلوكوز، انزيم المتفرعة نقل وقليل السكاريد محطة مكونة من ما لا يقل عن 6 إلى بقايا الجلوكوز الجلوكوز آخر من سلسلة المجاورة من خلال α (1 → 6) الربط. تكرار هذه العملية يعطي هيكل كسورية ضخمة تحتوي على الفروع التي تشكل الحلزون مع 6.5 الجلوكوز في المقابل. الجليكوجين يمكن أن يكون باتجاهين معاكسين تحلل إلى جلوكوز عن طريق العمل المتضافرمن المشذب الانزيمات التي يتحلل لα (1 → 6) ملزمة والجليكوجين فسفوريلاز أن hydrolyzes وα (1 → 4) غليكوزيدية المربوطة بين بقايا الماضي من الجلوكوز من فرع وجزيء الجليكوجين. يتم تنشيط هذا التفاعل يسمى تحلل الغليكوجين من خلال زيادة مستويات AMP (التي تعكس استهلاك ATP)، وتحول دون الجلوكوز وATP ^2،3.

بواسطة المجهر الإلكتروني، وقد وصفت جزيئات الجليكوجين في العديد من أنواع الخلايا جزيئات β كما حرة (أو monoparticles الجليكوجين) من 15-30 نانومتر في القطر. في أنواع معينة من الخلايا مثل خلايا الكبد، والجسيمات β يمكن تجميعها في مجمع لتشكيل ريدات، والمعروف أيضا باسم جسيمات α التي تختلف في القطر من 80 نانومتر إلى حد أقصى قدره 200 نانومتر ⁴ . الطريق مستعبدين هذه الجسيمات β لتشكيل مجموعات أكبر من الجسيمات α لا يزال غير توضيح بالكامل. يميل بعض الأدلة لإثبات أن الجزيئات β يمكن المستعبدين من قبل الرابطة التساهمية ^5، الرابطة الهيدروجينية، أو حتى من خلال تفاعلات البروتين البروتين ^6. كمية الجليكوجين المخزن في الخلايا يعتمد على الكثير من العوامل: (I) كمية glycogenin في الخلية التي يبدأ تخليق الجليكوجين، (الثاني) نشاط سينسيز الجليكوجين وفسفوريلاز ينظمها البروتين الفسفرة / نزع الفسفات، (الثالث) تركيز الجلوكوز في الخلايا، والتي تعتمد على عدة معايير مثل توريد الجلوكوز من الأوعية الدموية وامتصاص الجلوكوز من قبل الخلايا. وينظم مخازن الجليكوجين بإحكام من قبل تنظيم تفارغي الهرمونات السكروز من خلال نواتج وسيطة، من خلال الهرمونات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي والطاقة، والمواد الغذائية الاستشعار عن مسارات إشارات ^7.

من المهم أن تكونقادرة على تحديد الجليكوجين في العينات البيولوجية إلى فهم أفضل لأهمية التمثيل الغذائي الجليكوجين في الجسم كله والمستوى الخلوي. نحن هنا وصف دقيق البيوكيميائية، واستنساخه ومريحة في فحص المختبر لالجليكوجين. ويستند هذا الأسلوب على مضان الجلوكوز الكمي قبل وبعد التحلل محددة من الجليكوجين.

توجد طرق أخرى لتقدير مستوى الجليكوجين في الخلايا، ولكن معظمهم ليسوا الكمي. واستند واحدة من التقنيات أول وصف لتقدير حجم الجليكوجين في الخلايا على قياس التأسيس ^[14 C] الجلوكوز في الجليكوجين ^8،9. استخدام النشاط الإشعاعي يجعل هذه العملية أكثر صعوبة في التعامل معها ولكن له ميزة توفير نسبة الجلوكوز إلى الجليكوجين التأسيس والتمييز بين توزيع بقايا الجلوكوز على الفروع والخارجي في قلب جزيء (فإنه يتطلب أيضا β-amyloly إضافيةجهاز الأمن والمخابرات وخطوة الكروماتوغرافي). وقد تم تطوير تقنية أخرى في الآونة الأخيرة ويقوم على دمج 2-NBDG (2 - {N-[7 nitrobenz-2-oxa-1 ،3-diazol-4-YL]} الأمينية-2-deoxyglucose)، و 2-deoxyglucose مشتقة الفلورسنت، في الجليكوجين ^10. قياس كثافة مضان يعكس كمية الجليكوجين إنتاجها ويمكن قياس مع قارئ مضان. ويمكن أيضا توزيع مضان في الخلية يتم تقييمها بواسطة المجهر متحد البؤر.

من بين التقنيات الأخرى nonquantitative، الدوري حمض شيف تلطيخ (PAS) وربما كان الأكثر شيوعا. ويمكن استخدامه للكشف عن الجليكوجين في خلايا ثابتة، أقسام الأنسجة في البارافين أو المجمدة. هذه الألوان تقنية النسيجية تحديدا غير السكريات، السكرية، البروتينات السكرية، والسليلوز mucins محايد باللون الأرجواني. ويمكن زيادة خصوصية هذا الاختبار عن طريق العلاج من خلايا ثابتة أو أقسام الأنسجة مع دياستاز، الذي يساعد على هضم تحديدا الجليكوجين. بعد ذلك،مستوى الجليكوجين يمكن تقدير نوعيا من خلال مقارنة عينات unhydrolyzed (جميع الجزيئات الكربوهيدرات تعديل) لعينات تحلل (الكربوهيدرات تعديل الجزيئات باستثناء الجليكوجين). يوفر تلطيخ PAS والتحليل المجهري، على عكس فحوصات البيوكيميائية من الجليكوجين، معلومات بشأن توزيع الجليكوجين في الخلية، والتي يمكن أن تنتشر أو تتركز في جزء معين من الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الاختلافات في التقديرات PAS تلطيخ تراكم الجليكوجين بين ظروف مختلفة، فإنه ليس الكمي ^11.

والأضداد وحيدة النسيلة الماوس في الأصل باستخدام الفك السفلي اللقمة الغضروف كما ثبت مستضد لتتفاعل مع الجليكوجين في الخلايا وتنقيته مع الجليكوجين في المختبر ^12. كما تعترف هذه الأجسام المضادة على وجه التحديد سلاسل السكر المرتبطة الجليكوجين، بل هو أداة مفيدة للكشف عن الجليكوجين عن طريق المناعية بطريقة أكثر تحديدا من تلطيخ PAS.

المجهر الإلكتروني هو أسلوب آخر أن يسمح التصور من الحبوب من الجليكوجين في الخلايا وتقييم درجة تخزين الجليكوجين. في الواقع، الجليكوجين جسيمات β يمكن التعرف عليها بسهولة مع المجهر الإلكتروني والإلكترون حبيبات كثيفة ^1.

Protocol

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين

1. تحلل الخلية

1. خلايا البذور بتركيز 0.5-2 × 10 ⁶ لكل 100 ملم طبق القطر.
2. العلاج: احتضان خلايا 24، 48، أو 72 ساعة في تركيز الأكسجين المنخفض (نقص الأكسجين) في علة بوكس محطة العمل اللاهوائية (Ruskinn تكنولوجيا Biotrace الدولية بي، كارديف، المملكة المتحدة) وضعت في 1٪ أو 0.1٪ O _2، 94٪ أو 94.9٪ N _2، و 5٪ CO _2. في موازاة ذلك، احتضان الخلايا في normoxia (21٪ O _2، 5٪ CO _2). تغيير المتوسطة (25 ملي المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز) كل 24 ساعة لتقليل الاختلافات في تركيز الجلوكوز خلال فترة التجربة.
3. بعد العلاج، وخلايا غسل 2X مع برنامج تلفزيوني لإزالة آثار الجلوكوز من مستنبت. تتخلص من الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة.
4. أجهزة الطرد المركزي الحل في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. بيليه يمكن تجميد في -20 درجة مئوية قبل المضي قدما.
5. resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. إضافة 100 ميكرولتر من الجليكوجين المخزن المائي المتوفرة مع الفحص كيت الجليكوجين (Abcam). غلي المحللة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل الإنزيمات.
6. وأجهزة الطرد المركزي في دوامة المحللة في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة لإزالة منتجات غير قابلة للذوبان. إبقاء طاف.
7. لتطبيع مستويات الجليكوجين لمحتوى البروتين بين العينات، التقدير الكمي للبروتينات يمكن القيام به مع 25-35 ميكرولتر من طاف باستخدام مقايسة حمض Bicinchoninic (BCA-Interchim).

بعض المحللة يمكن استخدامها لقياس تركيز الجلوكوز داخل الخلايا الحرة.

2. التحلل من الجليكوجين

1. مزيج 50 ميكرولتر من طاف (الخطوة 1) مع 1 ميكرولتر من التحلل أنزيم ميكس. يحتوي هذا الخليط غلوكوأميلاز. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد منحنى المعايرة عن طريق تمييع الجليكوجين القياسية (2 ملغ / مل) قupplied مع عدة لإيجاد حل من 10 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت التحلل. المقبل، وإعداد ستة أنابيب منفصلة مع 0، 4، 8، 12، 16، و 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل القياسية وضبط كل أنبوب إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر مع العازلة المائي لإعطاء تركيز الجليكوجين 0، 0.04 ، 0.08، 0.12، 0.16، و 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة 1 ميكرولتر من أنزيم ميكس التحلل في المعايير واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يجب أن تطرح تركيز الجلوكوز خلفية خط الخلية، التي قدمها قيمة للتركيز الجلوكوز الحرة، من قيمة للتركيز الجلوكوز الإجمالي (الجلوكوز من الجليكوجين التحلل + خالية من الجلوكوز) لتحديد مستوى الجليكوجين في الخلية.

3. التنمية والقراءة من الإسفار

1. لكل حالة، وإعداد أنبوب واحد (أنبوب 1) لقياس تركيز السكر الحر واثنين من أنابيب (أنابيب 2 و 3) لقياس مجموع تركيز الجلوكوز (كل الطرافة أنبوبها حجم مختلفة من الجليكوجين تحلل).
2. إضافة 15 ميكرولتر من طاف المستخرجة في نهاية الخطوة 1 في أنبوب 1. إضافة 35 ميكرولتر من العازلة المائي لإتمام إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. سوف مضان الحصول إعطاء تركيز الجلوكوز الحرة.
3. إضافة ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2) في أنبوب 2. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. حجم العينة (X ميكرولتر) لابد من تعديلها وفقا لكثافة الخلية و / أو نوع من الخلايا من أجل الحصول على القيم مضان التي لا تتجاوز تركيزات من منحنى المعايرة.
4. إضافة 2 ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل في أنبوب 3. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
5. إعداد محلول التنمية للعينات والمعايير عن طريق خلط لكل أنبوب 48.7 ميكرولتر من العازلة التنمية، 1 ميكرولتر من التنمية أنزيم ميكس و 0.3 ميكرولتر من OxiRed دقق (مرفق في الجليكوجين الفحص كيت). على سبيل المثال، لمدة 2 الظروف، وإعداد المزيج لمدة 12 أنبوبق (6 لمعايير، 2 للجلوكوز حرة و 4 لمجموع مضان الجلوكوز).
6. إضافة 50 ميكرولتر من هذا المزيج إلى كل أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
7. قياس مضان في الطول الموجي من 535 نانومتر الإثارة، والطول الموجي من 587 نانومتر الانبعاثات على النحو الموصى به، وفتحة من 3 نانومتر لالإثارة وانبعاث.

النتائج

وهناك مستوى منخفض من الأكسجين (نقص الأكسجين) في إشارات إلى الخلايا السرطانية الأورام الحاجة إلى تخزين الطاقة للتعامل مع نضوب المغذيات لاحقة، وذلك من أجل البقاء. والجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في خلايا الثدييات، درسنا تنظيم تخزين الجليكوجين في نقص ا...

Discussion

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين في المختبر يسمح الكمي الدقيق للخلايا محتوى الجليكوجين. مقارنة مع بعض التقنيات الأخرى (PAS، المناعي مع الأجسام المضادة الجليكوجين، الخ)، وهذه المعايرة هي محددة جدا وحساسة وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
			EQUIPMENT
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B