Биохимический Титрование гликогена<em&gt; В пробирке</em

Резюме

Мы описываем здесь точный, воспроизводимый и удобный биохимический метод титрования гликогена в пробирке. Этот метод использует набор для анализа Abcam гликогена и основан на последовательном гидролиза гликогена в глюкозу и глюкозы титрования по флуоресценции.

Аннотация

Гликоген является основным энергичный полимер глюкозы в позвоночных животных и играет решающую роль во всей обмен веществ, а также в клеточном метаболизме. Многие методы для обнаружения гликогена уже существуют, но лишь немногие из них количественный. Мы описываем здесь метод, используя набор для анализа Abcam гликогена, который основан на определенной деградации гликогена в глюкозу по глюкоамилазой. Глюкоза затем окисляют в частности к продукту, который реагирует с зондом OxiRed для получения флуоресценции. Титрование является точным, чувствительным и может быть достигнуто на клеточных экстрактов или срезов тканей. Однако, в отличие от других методов, он не дает информацию о распределении гликогена в клетке. В качестве примера этого метода описаны здесь титрование гликогена в двух клеточных линий, китайского хомячка фибробластов легких CCL39 человека и LS174 карциномы толстой кишки, инкубированных в нормоксии (21% O ₂₎ в сравнении с гипоксией (1% O _2). Мы предположили, что гипоксия является сигАнал, что готовит клетки синтезировать и хранить гликоген, чтобы выжить ^1.

Введение

Гликоген multibranched полимер из остатков глюкозы, который присутствует в цитоплазме многих типах клеток. Это один из основных форм накопления энергии в клетках и играет важную роль в метаболизме глюкозы. Большинство клеток млекопитающих способны производить и хранить гликоген, который можно быстро разлагается на глюкозу для продвижения гликолиза и производство АТФ при метаболическом стрессе. Гепатоциты производить огромное количество гликогена регулировать уровень сахара в крови, тем самым, обеспечивая непрерывную подачу глюкозы в организме. В противоположность этому, концентрация гликогена в других клетках (мышцы, клетки крови, и т.д.) является относительно низким. Тем не менее, на местном уровне, эти величины являются достаточными для обеспечения энергии в краткосрочной перспективе, когда клетки вдруг подвергается среде, лишенной питательных веществ.

Синтез гликогена и распад гликогена те же шаги во всех тканях (рис. 1). Во-первых, глюкозапроникает в клетку путем переносчиков глюкозы (излишкам), и быстро превращается из глюкозо-6-фосфата (G6P) в глюкозо-1-фосфата (G1P) по фосфоглюкомутазы. G1P затем модифицируется на UDP-глюкозы, и атом углерода, С1 UDP-глюкозы прикреплен к остатка тирозина, glycogenin анкерного белка гликогена. Эта молекула, считается гликогена грунтовка, продлевается на крепления UDP-глюкозы в терминал глюкозы с помощью α (1 → 4) облигаций через гликогенсинтазы. Наконец, когда линейной цепочки более 11 остатков глюкозы образуется, ветвления фермент передает терминала олигосахарид, образованную как минимум 6 глюкозных остатков глюкозы в другой цепи около через α (1 → 6) связей. Повторение этого процесса дает массивный фрактальной структуры, содержащий ветви, которые образуют спираль с 6,5 глюкозы на очереди. Гликоген может быть обратно гидролизованный до глюкозы согласованных действийиз обрезка сучьев ферменты, которые гидролиза α (1 → 6) связан и гликогенфосфорилазы, что гидролизует α (1 → 4) гликозидную грань между последним остатком глюкозы филиала и молекулы гликогена. Эта реакция называется гликогенолиз активируется за счет увеличения уровня АМФ (отражающие потребление АТФ), и ингибируется глюкозой и АТФ ^2,3.

С помощью электронного микроскопа, молекулы гликогена были описаны во многих типах клеток, как β свободных частиц (или гликогена monoparticles) 15-30 нм в диаметре. В конкретных типов клеток, таких как гепатоцитов, β частицы могут быть собраны в комплексе с образованием розетки, также известный как α частиц, которые изменяются в диаметре от 80 нм до не более 200 нм ⁴ . Как эти частицы β присоединены, образуют более крупные кластеры частиц α еще полностью не выяснены. Некоторые данные, как правило, доказать, что β частицы могут быть соединены путем ковалентного связывания ^5, водородных связей, или даже через белок-белковых взаимодействий ^6. Количество гликогена, запасенного в клетках зависит от многих параметров: (I) количество glycogenin в клетке, который инициирует синтез гликогена; (II) активность гликоген-синтазы и фосфорилазы, регулируемой фосфорилирования белка / дефосфорилирования; (III) концентрация глюкозы в клетках, который зависит от нескольких параметров, таких как поставку глюкозы из сосудистой системы и усвоения глюкозы клетками. Запасы гликогена жестко регулируется аллостерической регуляции биосинтеза гормонов через промежуточные метаболиты, гормонами, регулирующими энергетический обмен, а питательных зондирования сигнальных путей ^7.

Важно бытьв состоянии определить количество гликогена в биологических образцах, чтобы лучше понять важность обмена гликогена в всего тела и клеточном уровне. Мы описываем здесь точное, воспроизводимое и удобный биохимические в анализе пробирке для гликогена. Этот метод основан на флуоресценции количественное глюкозы до и после определенного гидролиза гликогена.

Другие методы существуют, чтобы оценить уровень гликогена в клетках, но большинство из них не являются количественными. Одним из первых методов, описанных для количественного определения гликогена в клетках была основана на измерении ^[14 C]-глюкозы в гликоген включения ^8,9. Использование радиоактивности делает этот процесс более сложным делом, но оно имеет преимущество в обеспечении скорости глюкозы в гликоген включения и в различении между распределением остатков глюкозы на внешних ветвей и в сердцевине молекулы (это также требует дополнительная β-amylolyсестра и хроматографический шаг). Другой метод был разработан в последнее время и основан на включении 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-окса-1 ,3-тиадиазол-4-ил] амино}-2-дезоксиглюкозы), 2-дезоксиглюкозы люминесцентные производная, в гликоген ^10. Измеренная интенсивность флуоресценции отражает количество гликогена, полученный и может быть измерена с читателем флуоресценции. Распределение флуоресценции в клетке также может быть оценена с помощью конфокальной микроскопии.

Среди других неколичественных методов, Периодическая кислота-Шифф окрашивание (PAS) является, пожалуй, наиболее распространенным. Он может быть использован для обнаружения гликогена в фиксированных клеток, тканевых срезов в парафин, либо заморожены. Это гистологические цвета техника, не специально полисахариды, гликолипиды, гликопротеины, целлюлоза и нейтральные муцины в фиолетовый. Специфичность этого теста может быть увеличена путем обработки основных клеток или срезов ткани с диастаза, который специфически переваривает гликоген. После этогоуровень гликогена может быть качественно оценивается путем сравнения негидролизованной образцы (все углеводов изменение макромолекулы) гидролизованными образцов (углеводов изменение макромолекулы кроме гликогена). PAS окрашивания и микроскопический анализ, в отличие от биохимических анализов гликогена, предоставляет информацию о распределении гликогена в клетке, которая может быть рассеянный или сконцентрированных в определенной части клетки. Однако, даже если оценках окрашивания PAS различий в накоплении гликогена между различными условиях, это не количественный ^11.

Мышиные моноклональные антитела первоначально с использованием нижнечелюстной мыщелкового хряща в качестве антигена было показано, реагируют с гликогена в клетках и очищенной гликогена в пробирке ^12. Как это антитело специфически распознает гликогена, связанных сахарных цепей, это является полезным инструментом для выявления гликогена по иммуногистохимии в более конкретном способом, чем окрашивания PAS.

Электронная микроскопия является другая техника, которая позволяет визуализировать зерен гликогена в клетках и оценки степени гликогена. На самом деле, гликогена β частицы легко узнаваемы с электронной микроскопии как электронных плотных гранул ^1.

протокол

Биохимический Титрование гликогена

1. Лизиса клеток

1. Семенной клетки в концентрации 0,5-2 × 10 ⁶ на 100 мм диаметра блюдо.
2. Лечение: инкубировать клетки 24, 48, или 72 часа в низкой концентрации кислорода (гипоксия) в Буг-Box анаэробной рабочей станции (Ruskinn Технология Biotrace International Plc, Bridgend, Великобритания), установленной на 1%, или на 0,1% O _2, 94% или 94,9% N _2, и 5% СО _2. Параллельно, инкубировать клетки в нормоксии (21% O _2, 5% СО _2). Изменение среды (25 мМ глюкозо-содержащую среду) каждые 24 ч, чтобы минимизировать изменения в концентрации глюкозы во время эксперимента.
3. После обработки клетки мыть 2x с PBS, чтобы удалить следы глюкозы из культуральной среды. Очистите клеток в холодной PBS.
4. Центрифуга решение при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин, отбросить супернатант и промывают осадок один раз ЗФР. Осадок могут быть заморожены при -20 ° С, прежде чем продолжить.
5. Ресуспендируют осадок в 100 мкл дистиллированной воды. Добавить 100 мкл гликогена гидролиза буфера, поставляемые с гликогена Пробирной Kit (Abcam). Кипятите лизат при 95 ° С в течение 5 мин для инактивации ферментов.
6. Vortex и центрифуга лизат при 13000 оборотах в минуту в течение 10 мин, чтобы удалить нерастворимые продукты. Держите супернатант.
7. Для нормализации уровня гликогена в содержании белка между образцами, количественное определение белков может быть сделано с 25-35 мкл супернатанта с использованием анализа бицинхониновой кислоты (BCA-Interchim).

Некоторые из лизата может быть использован для измерения концентрации глюкозы в свободное внутри клеток.

2. Гидролиз гликогена

1. Смешать 50 мкл супернатанта (шаг 1) с 1 мкл смеси ферментов гидролиза. Эта смесь содержит глюкоамилазу. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
2. Подготовка калибровочной кривой путем разбавления стандартного гликоген (2 мг / мл) сupplied с комплектом к раствору 10 мкг / мл в буфере гидролиза. Далее, подготовить шесть отдельных трубок с 0, 4, 8, 12, 16 и 20 мкл 10 мкг / мл стандарта и регулировать каждую пробирку до конечного объема 50 мкл буфером гидролиза с получением концентрации гликогена из 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 и 0,2 мкг / мл. Добавить 1 мкл смеси ферментов гидролиза в стандартах и ​​инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.

Фон концентрация глюкозы из клеточной линии, задается значением для свободного концентрации глюкозы, необходимо вычесть из значения для общей концентрации глюкозы (глюкозы от гликогена гидролиза + свободного глюкозы) для определения уровня гликогена в клетке.

3. Разработка и чтение флуоресценции

1. Для каждого состояния, готовить одну трубку (трубка 1) для измерения концентрации свободной глюкозы и две трубки (трубок 2 и 3) для измерения общей концентрации глюкозы (каждая трубка с домашнимха отличается объем гидролизованного гликогена).
2. Добавить 15 мкл супернатанта, извлеченные в конце стадии 1 в трубке 1. Добавить 35 мкл буфера для завершения гидролиза до конечного объема 50 мкл. Полученные флуоресценции даст концентрацию свободной глюкозы.
3. Добавить X мкл гликогена гидролизованного (полученного на стадии 2) в трубе 2. Регулировка до конечного объема 50 мкл. Объем пробы (Х мкл) должен быть отрегулирован в соответствии с плотностью клеток и / или типа клеток с целью получения флуоресценции значения, которые не выходят за рамки концентраций калибровочной кривой.
4. Добавить 2 X мкл гидролизованного гликогена в трубке 3. Регулировка до конечного объема 50 мкл.
5. Приготовьте раствор разработки для образцов и стандартов путем смешивания для каждой трубки 48,7 мкл буфера развития, 1 мкл развития ферментной смеси и 0,3 мкл OxiRed Probe (поставляется в гликоген Пробирной Kit). Например, в течение 2 условиях приготовить смесь в течение 12 трубкис (6 стандартов, 2 для свободной глюкозы и 4 на общую флуоресценции глюкозы).
6. Добавить 50 мкл этой смеси в каждую пробирку и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
7. Измерьте флуоресценции при длине волны возбуждения 535 нм, длине волны эмиссии 587 нм в соответствии с рекомендациями, и щель 3 нм для возбуждения и эмиссии.

Результаты

Низкий уровень кислорода (гипоксии) в опухолях сигналов к опухолевым клеткам нужно хранить энергию для обработки последующее истощение питательных веществ, таким образом, чтобы выжить. Как гликоген является основным энергичный полимер глюкозы в клетках млекопитающих, мы изучали регу...

Обсуждение

Биохимический титрование гликогена в пробирке позволяет точно количественное клеток гликогена содержания. По сравнению с некоторыми другими методами (PAS, иммунофлюоресценции с гликогена антитела, и т.д..), Это титрования очень специфичен, чувствителен и воспроизводимым. Кром...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
EQUIPMENT
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B