Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier eine genaue, reproduzierbare und bequem biochemische Methode zur Titration von Glykogen in vitro. Diese Technik nutzt die Abcam Glykogen-Assay-Kit und ist auf aufeinander folgende Hydrolyse von Glykogen durch Fluoreszenz Glukose und Glukose-Titration.

Zusammenfassung

Glycogen ist das Haupt energetische Polymer von Glucose in Wirbeltieren und spielt eine entscheidende Rolle bei der Ganzkörper-Stoffwechsels als auch im Zellstoffwechsel. Viele Verfahren zur Glykogen erkennen existieren bereits, aber nur wenige sind quantitativ. Wir beschreiben hier eine Methode mit dem Abcam Glykogen-Assay-Kits, die auf spezifischen Abbau von Glykogen basiert, um durch Glucoamylase Glucose. Glukose wird dann speziell auf ein Produkt, das mit dem OXIRED Sonde an Fluoreszenz zu erzeugen reagiert oxidiert. Die Titration ist präzise, ​​empfindlich und kann auf Zellextrakten oder Gewebeschnitten erreicht werden. Im Gegensatz zu anderen Techniken, es nicht geben Informationen über die Verteilung von Glykogen in der Zelle. Als ein Beispiel für diese Technik, beschreiben wir hier die Titration von Glykogen in beiden Zelllinien des Chinesischen Hamsters CCL39 Lungenfibroblasten und menschlichen Kolonkarzinom LS174, in Normoxie inkubiert (21% O ₂₎ in Abhängigkeit von Hypoxie (1% O _2). Wir vermuten, dass Hypoxie ist eine signal, dass bereitet Zellen, um zu überleben ¹ zu synthetisieren und zu speichern Glykogen.

Einleitung

Glycogen ist ein mehrfach verzweigten Polymer von Glucose-Resten, die im Zytoplasma von vielen Zelltypen vorhanden ist. Es ist eine der Hauptformen der Energiespeicher in Zellen und spielt eine wichtige Rolle in den Glukosestoffwechsel. Die meisten Säugetierzellen sind in der Lage, und speichern Glykogen, die schnell in Glukose abgebaut können Glykolyse und ATP-Produktion während der metabolischen Stress fördern zu produzieren. Hepatozyten produzieren riesige Mengen von Glykogen, um den Blutzuckerspiegel, wodurch eine kontinuierliche Zufuhr von Glucose, um den Körper zu regulieren. Im Gegensatz dazu ist die Konzentration von Glykogen in anderen Zellen (Muskeln, rote Blutkörperchen, etc.) relativ gering. Jedoch lokal ausreichend sind, um Energie in der kurzfristigen, wenn die Zellen einmal in eine Umgebung von Nährstoffen entzogen ausgesetzt sind diese Mengen.

Glykogen-Synthese und Glykogen-Abbau folgt den gleichen Schritten in allen Geweben (Abbildung 1). Erstens Glucosetritt Zellen durch Glucose-Transporter (GLUTs), und wird schnell von der Glucose-6-Phosphat (G6P) in Glucose-1-phosphat (G1P) durch Phosphoglucomutase umgewandelt. G1P wird dann in UDP-Glucose geändert, und das C-C1 von UDP-Glucose auf einen Tyrosinrest glycogenin, dem Verankerungsprotein von Glykogen befestigt. Dieses Molekül, als ein Primer Glykogen wird durch die Befestigung des UDP-Glucose an die terminale Glucose durch eine α (1 → 4)-Bindung über die Glykogensynthase verlängert. Schließlich wird, wenn eine lineare Kette von mehr als 11 Glucoseresten gebildet wird, das Verzweigungsenzym trägt ein Endgerät Oligosaccharid von einem Minimum von 6 Glucosereste an einer anderen Zuckerkettensuche durch eine α (1 → 6)-Bindung gebildet wird. Die Wiederholung dieses Prozesses gibt eine massive fraktalen Struktur, die Zweige, die eine Helix mit 6,5 Glukose pro Runde bilden. Glykogen kann umgekehrt hydrolysiert werden, um durch die konzertierte Aktion Glucosevon entzweigenden Enzymen, die α (1 → 6) verbunden und Glykogen Phosphorylase, die die α (1 → 4)-glycosidisch gebundene zwischen dem letzten Rest von Glucose aus einem Zweig und dem Glykogenmoleküls hydrolysiert hydrolysieren. Diese Reaktion nennt Glycogenolyse durch die Erhöhung von AMP (reflektierende ATP-Verbrauch) aktiviert und durch Glukose und ATP ^2,3 gehemmt.

Durch Elektronenmikroskopie wurden Glykogen Moleküle in vielen Zelltypen als freie Teilchen β (oder Glykogen Monopartikel) von 15-30 nm im Durchmesser beschrieben. In bestimmten Zelltypen, wie Hepatozyten, können β-Teilchen in eine komplexe zusammengebaut werden, um Rosetten, auch bekannt als α-Teilchen, die im Durchmesser variieren von 80 nm zu einem Maximum von 200 nm ⁴ bilden . Die Art, wie diese β-Teilchen gebunden sind, größere Cluster von α-Teilchen zu bilden, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Einige Beweise scheint zu beweisen, daß β-Teilchen können durch kovalente Bindung ^5, Wasserstoffbrücken oder auch durch Protein-Protein-Wechselwirkungen ⁶ verklebt werden. Die Menge von Glykogen in den Zellen gespeichert ist abhängig von vielen Parametern: (I) die Menge des glycogenin in der Zelle, die Glykogensynthese initiiert, (ii) die Aktivität von Glykogen-Synthase-Phosphorylase und durch Protein-Phosphorylierung / Dephosphorylierung reguliert, (iii) die Konzentration Glucose in den Zellen, die abhängig von verschiedenen Parametern wie beispielsweise die Bereitstellung von Glucose aus dem Gefäßsystem und die Glucoseaufnahme durch die Zellen ist. Glykogenspeicher sind eng durch allosterische Regulation der Biosynthese Hormone über Zwischenmetabolite reguliert durch Hormone regulieren den Energiestoffwechsel und durch Nährstoffsensorsignalwege ^7.

Es ist wichtig,Lage, Glykogen in biologischen Proben zu quantifizieren, um die Bedeutung der Glykogen-Stoffwechsel im ganzen Körper und zellulärer Ebene zu verstehen. Wir beschreiben hier eine präzise, ​​reproduzierbare und bequem biochemischen in vitro-Assay für Glykogen. Diese Technik beruht auf der Quantifizierung Glucose Fluoreszenz vor und nach der spezifischen Hydrolyse von Glykogen basiert.

Es gibt andere Methoden, um das Niveau von Glykogen in den Zellen zu schätzen, aber die meisten von ihnen sind nicht quantitativ. Eine der ersten für die Quantifizierung von Glykogen in den Zellen beschriebenen Verfahren wurde der Messung der ^[14 C]-Glucose in Glykogen Einbau ^8,9 basiert. Die Verwendung von Radioaktivität macht dieses Verfahren schwieriger zu handhaben, sondern es den Vorteil, dass die Rate der Glukose in Glykogen Einbau und bei der Unterscheidung zwischen der Verteilung der Glucosereste an den äußeren Ästen und in dem Kern des Moleküls (es erfordert auch eine zusätzliche β-amylolysis und einem chromatographischen Schritt). Eine andere Technik wurde in jüngerer Zeit entwickelt und beruht auf dem Einbau von 2-NBDG basiert (2 - {N-[7-Nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazolon-4-yl] amino}-2-Desoxyglucose), ein 2-Desoxyglucose fluoreszierendes Derivat, in Glykogen ^10. Die gemessene Fluoreszenzintensität spiegelt die Menge an Glykogen hergestellt und kann mit einem Fluoreszenzlesegerät gemessen werden. Fluoreszenzverteilung in der Zelle kann durch konfokale Mikroskopie ausgewertet.

Unter den anderen nicht-quantitative Techniken ist Periodic Acid-Schiff-Färbung (PAS) vielleicht die häufigste. Es kann für den Nachweis von Glykogen in fixierten Zellen, Gewebeschnitte in Paraffin oder gefroren werden. Diese histologischen Technik Farben nicht speziell Polysaccharide, Glykolipide, Glykoproteine, Zellulose und neutrale Muzine in Lila. Die Spezifität des Tests kann durch Behandlung der fixierten Zellen oder Gewebeschnitten mit Diastase, die spezifisch verdaut Glykogen erhöht werden. Danachdas Niveau von Glykogen kann qualitativ durch den Vergleich nicht hydrolysierten Proben (alle Kohlenhydrat modifizierter Makromoleküle) zu hydrolysierten Proben (Kohlenhydrat-modifizierten Makromolekülen außer Glykogen) geschätzt werden. PAS-Färbung und mikroskopische Analyse, im Gegensatz zu biochemischen Assays von Glykogen, enthält Informationen über die Verteilung von Glykogen in der Zelle, die diffundiert oder in einem bestimmten Teil der Zelle konzentriert werden können. Obwohl PAS-Färbung Schätzungen Unterschiede in Glykogen Akkumulation zwischen verschiedenen Bedingungen ist es jedoch nicht quantitativ ^11.

Ein monoklonaler Maus-Antikörper, ursprünglich unter Verwendung Kiefer Kondylenknorpels als Antigen wurde gezeigt, dass mit Glykogen in den Zellen und mit gereinigtem Glykogen in vitro ¹² reagieren. Da diese Antikörper spezifisch Glykogen-verwandte Zuckerketten, ist es ein nützliches Werkzeug für den Nachweis von Glykogen durch Immunhistochemie in einer spezifischeren Weise als die PAS-Färbung.

Elektronenmikroskopie ist eine weitere Technik, die Visualisierung von Körnern von Glykogen in den Zellen und die Bewertung des Grades der Glykogen-Speicher ermöglicht. In der Tat sind Glykogen β-Teilchen leicht mit einem Elektronenmikroskop als elektronendichtes Granulat ¹ erkennbar.

Protokoll

Biochemische Titration von Glykogen

1. Zelllyse

1. Samenzellen in einer Konzentration von 0,5-2 x 10 ⁶ pro 100 mm Schale.
2. Behandlung: inkubieren Zellen 24, 48 oder 72 Stunden in niedriger Sauerstoffkonzentration (Hypoxie) in einem Bug-Box anaerobe Arbeitsstation (Ruskinn Technologie Biotrace International Plc, Bridgend, UK) bei 1% oder 0,1% O _2, 94% oder eingestellt 94,9% _N &sub2; und 5% CO _2. Parallel inkubieren Zellen in Normoxie (21% O _2, 5% CO _2). Mediumwechsel (25 mM Glucose-haltigem Medium) alle 24 h auf Schwankungen in der Glukosekonzentration während der Zeit des Experiments zu minimieren.
3. Nach der Behandlung, Wasch Zellen 2x mit PBS, um Spuren von Glukose aus dem Kulturmedium zu entfernen. Kratzen Sie die Zellen in kaltem PBS.
4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 rpm für 5 min, den Überstand verwerfen und waschen das Pellet einmal mit PBS. Das Pellet bei -20 ° C eingefroren, bevor weiter fortgefahren werden.
5. Resuspendieren des Pellets in 100 ul destilliertem Wasser. 100 l des Glykogen-Hydrolyse-Puffer mit der Glykogen-Assay Kit (Abcam) vorgesehen ist. Man kocht das Lysat bei 95 ° C für 5 min, um Enzyme zu inaktivieren.
6. Vortex-Zentrifuge und das Lysat bei 13.000 rpm für 10 min, um die unlöslichen Produkte zu entfernen. Halten Sie den Überstand.
7. Glykogen Ebenen auf den Proteingehalt zwischen den Proben zu normalisieren, kann die Quantifizierung von Proteinen mit 25-35 ul des Überstands unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Assays (BCA-Interchim) erfolgen.

Einige der Lysat kann verwendet werden, um die freie Glucose-Konzentration in den Zellen zu messen.

2. Hydrolyse von Glykogen

1. Mischungs 50 ul des Überstands (Schritt 1) ​​mit 1 &mgr; l der Hydrolyse Enzyme Mix. Dieses Gemisch enthält Glucoamylase. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
2. Bereiten Sie das Kalibrierungskurve durch Verdünnen der Standard Glykogen (2 mg / ml) smit dem Kit zu einer Lösung von 10 ug / ml in dem Puffer upplied Hydrolyse. Als nächstes bereiten sechs getrennten Röhrchen mit 0, 4, 8, 12, 16 und 20 ul von 10 ug / ml-Standard und justieren Sie jedes Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 50 ul mit Hydrolyse-Puffer auf eine Konzentration von Glykogen von 0 zu geben, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 und 0,2 ug / ml. 1 ul Enzym-Hydrolyse-Mischung in den Standards und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.

Der Hintergrund Glukosekonzentration der Zelllinie, nach Wert für die freie Glucose-Konzentration gegeben werden, aus dem Wert für die Gesamtglucosekonzentration (Glukose aus dem Glykogen Hydrolyse + free-Glucose), um das Niveau von Glykogen in der Zelle bestimmen, subtrahiert werden.

3. Entwicklung und Lesen von Fluoreszenz

1. Für jeden Zustand, bereiten ein Rohr (Rohr 1) in freie Glucose-Konzentration und zwei Röhren zu messen (Rohre 2 und 3) Gesamtglucosekonzentration (jedes Rohr Witz messenha verschiedenen Volumen von hydrolysierten Glykogen).
2. Hinzufügen von 15 &mgr; l Überstand am Ende von Schritt 1 in Rohr 1 extrahiert. Hinzufügen von 35 &mgr; l Puffer, um die Hydrolyse bis zu einem Endvolumen von 50 ul zu vervollständigen. Erhalten Fluoreszenz gibt die freie Glucose-Konzentration.
3. In X ul hydrolysierten Glykogen (in Schritt 2) erhalten, auf Rohr 2. Einstellen, um ein Endvolumen von 50 ul. Probenvolumen (X ul) ist entsprechend der Zelldichte und / oder Zelltyp, um Fluoreszenzwerte, die nicht über die Konzentrationen der Kalibrierungskurve zu erhalten eingestellt werden.
4. In 2 X ul hydrolysierten Glykogen in Röhre 3. Einstellen, um ein Endvolumen von 50 ul.
5. Bereiten Sie eine Entwicklungslösung für Proben und Standards, indem man für jedes Rohr 48,7 ul Entwicklung Buffer, 1 ul der Entwicklung Enzyme Mix und 0,3 ul OXIRED Probe (in der Glykogen-Assay Kit geliefert). Zum Beispiel für zwei Bedingungen, bereiten Sie einen Mix für 12 Rohrs (6-Standards, 2 für freie Glucose und 4 für die Gesamtglucose Fluoreszenz).
6. Dann werden 50 ul dieser Mischung zu jedem Röhrchen und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
7. Messung der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 535 nm, einer Emissionswellenlänge von 587 nm, wie empfohlen, und einen Schlitz von 3 nm für die Anregung und Emission.

Ergebnisse

Ein niedriger Gehalt an Sauerstoff (Hypoxie) in Tumoren Signale an Tumorzellen die Notwendigkeit, Energie zu speichern, um nachfolgende Nährstoffverarmung verarbeiten, um zu überleben. Glycogen ist das Haupt energetische Polymer von Glucose in Säugerzellen, untersuchten wir die Regulierung der Glykogen-Speicherung im Hypoxie. Die Berechnung und die Standardisierung der Konzentration von Glykogen in Zelllysaten müssen auf den Rohdaten der Fluoreszenz durchgeführt werden, wie in den Tabellen 1, 2 und...

Diskussion

Biochemische Titration von Glykogen in vitro ermöglicht eine genaue Quantifizierung von Zellen Glykogen. Im Vergleich zu einigen anderen Techniken (PAS, Immunfluoreszenz mit einem Glykogen-Antikörper, usw..) Ist diese Titration sehr spezifisch, empfindlich und reproduzierbar. Darüber hinaus ist das Verfahren bequemer, da es keine Radioaktivität aber eine Fluoreszenz-Spektrometer erfordert. Jedoch ist diese Technik rein quantitativ und liefert keine Informationen über Glykogen Verteilung in der Zel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
			EQUIPMENT
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B