글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

요약

우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다.

초록

글리코겐은 척추 동물에있는 포도당의 주요 에너지 폴리머 및 중요한 몸 전체의 신진 대사의 역할뿐만 아니라, 세포의 신진 대사를한다. 글리코겐을 감지하는 많은 방법이 이미 존재하지만 몇 가지 양적 있습니다. 우리는 여기에 글루코 아밀라제에 의해 포도당 글리코겐의 분해에 기초하여 특정되는 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하는 방법을 설명한다. 포도당이어서 구체적으로 형광을 생성하는 OxiRed 프로브와 반응 생성물로 산화된다. 적정 결과, 정확한 구분하고 세포 추출물 또는 조직 섹션에 달성 될 수있다. 그러나, 다른 기술과 대조적으로, 그 셀의 글리코겐의 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이 기술의 예로서, 우리는 정상 산소 상태에서 배양이 세포 선 중국 햄스터 폐 섬유 아세포 CCL39 인간 결장암 LS174, 저산소증 대 (21 % O ₂₎ (1 % O ₂₎ 여기 글리코겐의 적정을 설명한다. 우리는 저산소증이 SIG는 것을 가정NAL 그 세포가 ¹ 살아 남기 위해 합성 및 저장 글리코겐을 준비합니다.

서문

글리코겐은 여러 종류의 세포의 세포질에 존재하는 글루코스 잔기의 다 분기 폴리머이다. 그것은 세포의 에너지 저장 장치의 주요 형태 중 하나이며 글루코스 대사에 중요한 역할을한다. 대부분의 포유 동물 세포는 빠르게 대사 스트레스를받는 동안 작용과 ATP의 생산을 촉진하기 위해 포도당으로 분해 할 수 있고, 저장 글리코겐을 생성 할 수있다. 간세포함으로써 신체의 포도당 연속적인 공급을 제공하는 혈당치를 조절하기 위해 글리코겐 대량 생산. 대조적으로, 다른 셀 (근육, 적혈구 등) 글리코겐의 농도는 상대적으로 낮다. 그러나, 국부적으로, 이들 양들은 세포가 갑자기 영양소 박탈 환경에 노출되어 단기간에 에너지를 제공하기에 충분하다.

글리코겐 합성과 글리코겐 분해는 모든 조직에서 동일한 단계 (그림 1)을 다음과 같습니다. 첫째, 포도당포도당 수송 체 (과잉)에 의해 세포를 입력하고 빠르게 포스 포 글루코스 -1 - 포스페이트 (G1P)에 포도당 -6 - 인산 (G6P)에서 변환됩니다. G1P이어서 UDP-글루코스로 변성되고, UDP-글루코스 탄소 C1은 glycogenin, 글리코겐의 고정 단백질의 티로신 잔기에 부착된다. 이 분자는 글리코겐 프라이머 고려, 글리코겐 합성 효소를 통해 α (1 → 4) 결합에 의해 터미널 포도당 UDP-글루코오스의 부착에 의해 확장됩니다. 11 이상의 글루코오스 잔기의 선형 사슬이 형성되면 마지막으로, 브랜칭 효소 부근 α (1 → 6) 결합을 통해 체인의 다른 포도당 6 글루코오스 잔기의 최소로 이루어지는 단자 올리고당을 전송한다. 이 과정의 반복은 다시 6.5 포도당과 나선을 형성하는 지점을 포함하는 대규모의 프랙탈 구조를 제공합니다. 글리코겐은 공동 작용에 의해 포도당 역으로 가수 분해 될 수있다분기의 포도당의 마지막 잔여 물과 글리코겐 분자 사이의 결합 글리코 시드 α (1 → 4)을 가수 분해 α (1 → 6) 결합과 글리코겐 포스를 가수 분해 효소를 debranching의. 글리코겐 분해 불리는이 반응은 (ATP 소모를 반영하는) AMP의 농도 증가에 의해 활성화하고, 글루코스 및 ATP ^2,3에 의해 억제된다.

전자 현미경으로 글리코겐 분자는 여러 세포 유형, 직경 15 ~ 30 ㎚의 입​​자로서 β 무료 (또는 글리코겐 monoparticles)에서 설명되었다. 그러한 간세포 등의 특정 세포 유형에서, β 입자는 80 nm 내지 200 nm의 ^(4)의 최대 직경이 될 또한 α 입자라고도 로제트를 형성하도록 복합체로 조립 될 수있다 . 이러한 β 입자는 α 입자의 큰 클러스터를 형성하기 위해 결합되는 방식은 아직 완전히 해명되지 않습니다. 몇몇 증거는 β 입자 공유 결합 ^4.0, 수소 결합, 또는 단백질 - 단백질 상호 작용을 통한 ⁶ 의해 결합 될 수 있다는 것을 증명하는 경향이있다. 세포에서 저장된 글리코겐의 양은 많은 변수에 의존한다 : (I) 글리코겐 합성을 개시 셀 glycogenin의 양, 단백질 인산화 / 탈 인산화에 의해 조절 글리코겐 신타 제 및 포스 포 릴라 제의 (II) 활성, (III) 농도 이러한 혈관 시스템에서 포도당의 공급과 세포의 포도당 흡수 등 여러 가지 매개 변수에 의존하는 세포에 포도당. 글리코겐 저장 단단히 에너지 대사를 조절하는 호르몬에 의해, 중간 대사 물질을 생합성 호르몬의 알로 스테 릭 조절에 의해 조절하고, 영양이 감지 신호 전달 경로 ^{7로됩니다.}

그것은하는 것이 중요합니다더 나은 몸 전체 및 세포 수준에서 글리코겐 대사의 중요성을 이해하는 생물학적 샘플에서 글리코겐을 정할 수. 우리는 여기에서 글리코겐을위한 체외 분석에서, 정확한 재현하고 편리한 생화학을 설명합니다. 이 기술은 글리코겐의 구체적인 가수 분해 전후 정량화 포도당 형광에 기초한다.

다른 방법은 세포에서의 글리코겐 수준을 추정하기 위해 존재하지만, 대부분은 정량적 않는다. 세포에있는 글리코겐의 정량화 한 제 방법 중 하나는 글리코겐 ^{8,9에 [14} C] - 포도당 결합 측정을 기반으로했다. 방사능 사용 취급이 과정을 더욱 어렵게 만들지 만이 글리코겐으로 그리고 외측 분기와 분자의 코어에서 글루코오스 잔기의 분포를 구별 글루코스 혼입 비율을 제공하는 이점이있다 (또한 필요합니다 추가 β-amylolySIS 및 크로마토 그래피 단계). 또 다른 기술은보다 최근에 개발되었고, 2-NBDG의 혼입에 기반 (2 - {N-[7-nitrobenz-2-옥사 -1,3 - diazol -4 - 일] 아미노} -2 - 데 옥시 글루코오스) 글리코겐 ^(10)에 2 - 데 옥시 글루코오스 형광 유도체. 측정 된 형광 강도는 제조 글리코겐의 양을 반영하고 형광 판독기로 측정 할 수있다. 셀에서 형광의 분포는 공 초점 현미경에 의해 평가 될 수있다.

다른 nonquantitative 기술 중, 요오드 산 쉬프 염색 (PAS)는 아마도 가장 일반적입니다. 그것은 고정 된 세포, 파라핀 조직 절편 또는 냉동 글리코겐의 검출을 위해 사용될 수있다. 보라색이 조직 학적 기술의 색깔이 아닌 구체적으로 다당류, 당지질, 당 단백질, 셀룰로오스 및 중립 뮤신​​. 이 테스트의 특이도는 특별히 글리코겐 소화 디아스타아제, 고정 세포 또는 조직 섹션의 처리에 의해 증가 될 수있다. 그 후,글리코겐의 수준은 질적 (탄수화물 글리코겐 제외한 고분자를 변경됨) 가수 분해 된 샘플을 가수 분해되지 않은 샘플 (전체 탄수화물 고분자 변경됨)을 비교함으로써 추정 될 수있다. 글리코겐의 생화학 적 분석법 달리 PAS 염색 및 현미경 분석은, 확산 또는 셀의 특정 부분에 집중 될 수있는 셀 글리코겐의 분포를, 관련된 정보를 제공한다. 심지어 다른 조건 사이의 글리코겐 축적 PAS 염색 추정치의 차이하지만 그러나, ¹¹ 양적 없습니다.

단일 클론 마우스 항체는 원래 항원 체외 ¹² 세포에서 글리코겐으로 정제 글리코겐과 반응을 보여줘왔다로서 하악 과두 연골을 사용했다. 이러한 항체는 특히 글리코겐 관련 당 사슬 인식로서, PAS 염색보다 더 구체적인 방법으로 면역 조직 화학에 의해 글리코겐의 검출을위한 유용한 도구이다.

전자 현미경은 세포와 글리코겐 저장의 정도의 평가에 글리코겐의 곡물의 시각화를 허용 다른 기술이다. 사실, 글리코겐 β 입자는 전자 조밀 ^한 과립과 같은 전자 현미경으로 용이하게 인식 할 수있다.

프로토콜

글리코겐의 생화학 적정

1. 세포 용해

1. 100mm 직경 접시 당 0.5 × ^106의 농도로 시드 세포.
2. 치료 : 세포를 품어 24, 1 % 또는 0.1 % O _2, 94 % 또는 설정 버그 박스 혐기성 워크 스테이션 (Ruskinn 기술 Biotrace 국제적인 Plc, 브리 젠드, UK)에서 낮은 산소 농도 (저산소증)에서 48, 또는 72 시간 94.9 %의 N _2, 5 % CO _2. 병행 (21 % O _2, 5 % CO ₂₎ 정상 산소 상태에서 세포를 배양한다. 실험의 시간 동안 포도당 농도의 변화를 최소화하기 위해 모든 24 시간 (25 mM의 포도당 함유 매체) 매체를 변경합니다.
3. 처리 후, 세척 세포는 배양 배지에서 포도당의 흔적을 제거하기 위해 PBS로 2 배. 차가운 PBS의 세포를 다 쳤어요.
4. 5 분 동안 1,000 rpm에서 솔루션을 원심 분리기, 상층 액을 버리고 PBS로 한번 펠렛을 씻으십시오. 펠렛을 더 진행하기 전에 -20 ° C에서 얼 수있다.
5. 증류수 100 μL에 펠렛을 재현 탁. 글리코겐 분석 키트 (ABCAM)와 함께 제공되는 글리코겐 가수 분해 버퍼 100 μl를 추가합니다. 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 95 ° C에서 용해 액을 끓인다.
6. 불용성 제품을 제거하는 10 분 동안 13,000 rpm으로 소용돌이 원심 분리기 해물. 뜨는을 유지합니다.
7. 샘플 사이의 단백질 함량에 글리코겐 수준을 정상화하기 위해, 단백질의 정량은 Bicinchoninic 산성 분석 (BCA-Interchim)를 사용하여 상청액의 25-35 ㎕를 사용하여 수행 할 수있다.

파쇄물 중 일부는 세포 내부에서 자유롭게 글루코스 농도를 측정하기 위하여 사용될 수있다.

2. 글리코겐의 가수 분해

1. 가수 분해 효소 믹스 1 μL와 상층 액 (1 단계) 50 μl를 섞는다. 이 혼합물은 글루코 아밀라아제가 포함되어 있습니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다.
2. 표준 글리코겐 희석하여 검량선을 작성 (2 ㎎ / ㎖)의가수 분해 완충액에서 10 ㎍ / ㎖의 용액으로 키트 upplied. 다음에, 여섯 별도 0으로 튜브, 4, 8, 12, 16 및 10 ㎍ / ㎖의 표준의 20 μL를 준비하여 0으로 글리코겐의 농도를 제공하기 위해 가수 분해 완충액 50 μL의 최종 부피로 각각의 튜브를 조정 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, 0.2 ㎍ / ㎖의. 기준에 가수 분해 효소 믹스 1 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어.

자유 글루코스 농도 값에 의해 주어진 세포주의 배경 글루코스 농도는, 셀의 글리코겐의 수준을 결정하기 위해 전체 글루코스 농도 (글리코겐 분해 + 자유 글루코오스로부터 글루코오스)의 값으로부터 감산되어야한다.

3. 개발 및 형광의 읽기

1. 각 조건에 대해 무료 포도당 농도와 두 개의 튜브를 측정하기 위해 (튜브 1) 하나의 튜브를 준비 (관 2, 3) 총 포도당 농도 (각 관의 지혜를 측정하는가수 분해 된 글리코겐의 하 다른 볼륨).
2. 관 (1) 1 단계의 끝에서 추출 상층 액의 15 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨에 완료하기 위해 가수 분해 버퍼의 35 μl를 추가합니다. 획득 형광 무료 포도당 농도를 줄 것이다.
3. 튜브 2 (2 단계에서 얻은) 가수 분해 된 글리코겐의 X의 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. 시료량 (X μL)는 검량선의 농도를 넘지 않은 형광 값을 얻기 위해서는, 세포 밀도 및 / 또는 세포 종류에 따라 조정되어야한다.
4. 관 (3)의 가수 분해 된 글리코겐의 2 개의 X μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다.
5. 각각의 튜브에 대한 개발 버퍼의 48.7 μL, 개발 효소 믹스 1 μL와 (글리코겐 분석 키트에 제공) OxiRed 프로브 0.3 μL를 혼합하여 시료와 표준의 개발 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 2 조건을, 12 관을위한 혼합 준비초 (표준 6, 무료 혈당 2 총 포도당 형광 4).
6. 각각의 튜브에이 믹스의 50 μl를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다.
7. 권장 535 nm의, 587 ㎚의 발광 파장의 여기 파장에서 형광과 여기 및 발광을위한 3 ㎚의 슬릿을 측정한다.

결과

종양 세포에 종양 신호의 산소 (저산소증) 살아남도록 후속 영양분 고갈을 처리하기 위해 에너지를 저장할 필요 저역. 글리코겐은 포유 동물 세포에서 포도당의 주요 에너지 폴리머, 우리는 저산소증에있는 글리코겐 저장의 규칙을 공부했다. 표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이 세포 용 해물에서의 글리코겐 농도의 계산 및 표준화 형광의 원시 데이터에 대해 수행되어야한다...

토론

체외에서 글리코겐의 생화학 적정 세포 글리코겐 함량을 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 다른 기술 (글리코겐 항체 PAS, 면역, 등.)에 비교해서,이 적정 매우, 특정 민감하고 재현. 그것은 어떠한 방사능하지만 형광 분광기가 필요하지 않기 때문에 더욱, 방법은 편리하다. 그러나,이 방법은 순전히 정량적이고 셀 글리코겐 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다.

?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
EQUIPMENT
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B