グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

要約

ここでは、in vitroでのグリコーゲンの滴定のために、正確で再現性のある便利な生化学的方法を記載する。この手法は、アブカムグリコーゲンアッセイキットを使用し、蛍光により滴定グルコースとグルコースへのグリコーゲンの連続加水分解に基づく。

要約

グリコーゲンは、脊椎動物におけるグルコースの主なエネルギッシュなポリマーであり、全身の代謝にだけでなく、細胞の代謝に重要な役割を果たしている。グリコーゲンを検出するための多くの方法は、すでに存在しているが、わずか数は定量的である。ここでは、グルコアミラーゼによりグルコースにグリコーゲンの特異的分解に基づいているアブカムグリコーゲンアッセイキットを用いた方法について説明します。グルコースは、その後、特異的に蛍光を生成するOxiRedプローブと反応生成物に酸化される。滴定は、正確で高感度であり、細胞抽出物又は組織切片上で達成することができる。しかしながら、他の技術とは対照的に、細胞中のグリコーゲンの分布に関する情報を与えない。この技術の一例として、ここでは低酸素状態（1％O _2）に対する2つの細胞系におけるグリコーゲンの滴定、通常酸素下でインキュベートしたチャイニーズハムスター肺線維芽細胞をCCL39およびヒト結腸癌LS174（21％O _2）を表す。我々は、低酸素症がSIGあるという仮説を立てた細胞が^1を生き残るためにグリコーゲンを合成して保存するための準備をNAL。

概要

グリコーゲンは、多くの細胞型の細胞質中に存在するグルコース残基の多分岐ポリマーである。これは、細胞におけるエネルギー貯蔵の主要な形態の一つであり、グルコース代謝に重要な役割を果たしている。ほとんどの哺乳動物細胞は、急速に代謝ストレスの間に、解糖及びATP産生を促進するためにグルコースに分解することができ、店舗グリコーゲンを産生することができる。肝細胞は、それによって、身体へのグルコースの連続的な供給を提供し、血糖値を調節するために大量のグリコーゲンを産生する。対照的に、他の細胞（筋肉、赤血球など ）中のグリコーゲンの濃度が比較的低い。しかしながら、局所的に、これらの量は、細胞が急に栄養分を奪われた環境に曝露される短期的にエネルギーを提供するのに十分である。

グリコーゲン合成およびグリコーゲン分解は、すべての組織で同じ手順（ 図1）に従う。まず、グルコースグルコース輸送体（供給過剰）によって細胞に入り、急速ホスによるグルコース-1 - リン酸（G1P）へのグルコース-6 - リン酸（G6P）から変換された。 G1P次いで、UDP-グルコースに変更され、UDP-グルコースの炭素C1はグリコゲニン、グリコーゲンのアンカータンパク質のチロシン残基に結合している。この分子は、グリコーゲンプライマーと考え、グリコーゲン合成酵素を介した α（1→4）結合によって末端グルコースのUDP-グルコースの付加によって拡張されます。 11以上のグルコース残基の直鎖を形成する際に、最終的に、分枝酵素は、近くα（1→6）​​結合を介してチェーンの別のグルコースに6グルコース残基の最小によって構成され、端末オリゴ糖を転送します。このプロセスの繰り返しはターンごとに6.5グルコースを用いてらせんを形成分岐を含む大規模なフラクタル構造を提供します。グリコーゲンは協調作用によりグルコースに逆加水分解することができるα（1→6） ​​結合させ、枝やグリコーゲン分子のグルコースの最後の残基との間で結合されたα（1→4）グリコシドを加水分解し、グリコーゲンホスホリラーゼを加水分解する酵素を枝切りする。グリコーゲン分解と呼ばれるこの反応は、（ATP消費量を反映する）AMPのレベルを増加させることによって活性化され、グルコースおよびATP ^2,3によって阻害される。

電子顕微鏡により、グリコーゲン分子は、多くの細胞型、直径15〜30ナノメートルのような遊離β粒子（またはグリコーゲン単粒子）に記載されている。例えば、肝細胞などの特定の細胞型において、β粒子は、80ナノメートルから200ナノメートル⁴の最大直径が変化するα粒子として知られている、ロゼットを形成するために複合体に組み立てることができる。これらのβ粒子はα粒子の大きなクラスターを形成するために結合されている方法は、まだ完全に解明されていない。いくつかの証拠は、β粒子は、共有結合^5、水素結合によって、またはさらに、タンパク質-タンパク質相互作用⁶を介して結合することができることを証明する傾向がある。セルに格納されたグリコーゲンの量は、多くのパラメータに依存する：（I）グリコーゲン合成を開始するセル内グリコゲニンの量は、（II）タンパク質のリン酸化/脱リン酸化によって調節グリコーゲンシンターゼおよびホス活性;（III）濃度このような細胞による血管系およびグルコース取り込みからのグルコースの供給などのいくつかのパラメータに依存している細胞におけるグルコースの。グリコーゲン貯蔵緊密中間代謝物を介して、エネルギー代謝を調節するホルモンによって、および栄養感知シグナル伝達経路⁷で合成ホルモンのアロステリック調節によって調節される。

それがあることが重要ですよりよい全身および細胞レベルでのグリコーゲン代謝の重要性を理解するために、生物学的サンプル中のグリコーゲンを定量化することが可能。ここでは、グリコーゲンのためのin vitroアッセイでは、正確で再現性のある便利な生化学について説明します。この技術は、グリコーゲンの特異的加水分解の前後で定量化グルコース蛍光に基づいている。

他の方法は、細胞中のグリコーゲンのレベルを推定するために存在するが、それらのほとんどは、定量的ではない。細胞中のグリコーゲンの定量のために説明した第1の技術の一つは^、8,9グリコーゲンへの^[14 C] -グルコース取り込みの測定に基づいた。放射能の使用は、取り扱いが、このプロセスをより困難にするが、それはまた必要とする（これはグリコーゲンへと外側の枝に、分子のコア中のグルコース残基の分布を区別するのグルコース取り込み速度を提供するという利点を有している追加のβ-amylolySISおよびクロマトグラフィー工程）。別の技術は、より最近開発された、2 - NBDGの取り込みに基づいている（2 - {N-[7 - ニトロベンズ-2 - オキサ-1,3 - ジアゾール-4 - イル]アミノ} -2 - デオキシグルコース）グリコーゲン¹⁰への2 -デオキシグルコースの蛍光誘導体。測定された蛍​​光強度は、生成グリコーゲンの量を反映し、蛍光プレートリーダーで測定することができる。細胞内の蛍光の分布もまた、共焦点顕微鏡法によって評価することができる。

他の非定量技術の中で、過ヨウ素酸シッフ染色（PAS）は、おそらく最も一般的です。それは固定細胞、パラフィン組織切片または凍結中のグリコーゲンの検出のために使用することができる。この組織学的手法の色以外、特に多糖類、糖脂質、糖タンパク質、セルロース、紫中性ムチン。この試験の特異性は、特異的にグリコーゲンを消化するジアスターゼ、を有する固定された細胞又は組織切片の処理により増加させることができる。その後、グリコーゲンレベルは、質的に（炭水化物、グリコーゲン高分子を除い変性）加水分解されたサンプルに加水分解されていない試料（すべて炭水化物修飾高分子）を比較することによって推定することができる。グリコーゲンの生化学アッセイとは異なり、PAS染色および顕微鏡分析は、細胞のある部分に拡散又は濃縮することができる細胞中のグリコーゲンの分布に関する情報を提供する。 PAS染色は、異なる条件間グリコーゲン蓄積の差を推定するにもかかわらず、しかし、それは定量的ではない^11。

モノクローナルマウス抗体は、もともと抗原がインビトロ ¹² で細胞中のグリコーゲンと、精製されたグリコーゲンと反応することが示されているように、下顎の下顎頭軟骨を用いて製造。この抗体は、グリコーゲン関連の糖鎖を認識するように、PAS染色よりも具体的な方法で免疫組織化学によるグリコーゲンの検出に有用なツールです。

電子顕微鏡法は、細胞およびグリコーゲン貯蔵の程度の評価におけるグリコーゲンの粒子の可視化を可能にする別の技術である。実際には、グリコーゲンβ粒子は電子密度の高い顆粒¹として、電子顕微鏡で簡単に認識可能である。

プロトコル

グリコーゲンの生化学的滴定

1。細胞溶解

1. 直径100mmディッシュあたり0.5〜2×10 ⁶の濃度で種細胞。
2. 治療：細胞をインキュベート24、1％または0.1％のO _2、94％以上に設定したバグボックス嫌気ワークステーション（Ruskinnテクノロジーバイオトレース·インターナショナルplc、ジェンド、英国）における低酸素濃度（低酸素）が48、または72時間94.9％N ₂及び5％CO _2。並行して、（21％O _{2、5％CO 2）を}正常酸素状態で細胞をインキュベートする。 （25 mMグルコース含有培地）、実験の時間中グルコース濃度の変動を最小限に抑えるために24時間毎に培地を変更してください。
3. 処理後、洗浄細胞は、培養培地からのグルコースの痕跡を除去するためにPBSで2倍。冷PBSで細胞をこすり取る。
4. 5分間1,000 rpmで解決策を遠心分離、上清を捨て、PBSで一回ペレットを洗浄。ペレットを、先へ進む前に、-20℃で凍結することができる。
5. 100μlの蒸留水でペレットを再懸濁します。グリコーゲンアッセイキット（アブカム）を備えてグリコーゲンの加水分解緩衝液100μlを追加します。酵素を不活性化するために、5分間95℃で溶解物を沸騰させる。
6. 不溶性の生成物を除去する10分間13,000 rpmで溶解液をボルテックスし、遠心する。上清を保管してください。
7. サンプル間のタンパク質含有量にグリコーゲンレベルを正常化する、タンパク質の定量はビシンコニン酸アッセイ（BCA-Interchim社）を用いて25〜35μlの上清を用いて行うことができる。

溶解物のいくつかは、細胞内フリーグルコース濃度を測定するために使用することができる。

2。グリコーゲンの加水分解

1. 加水分解酵素ミックス1μlの上清（ステップ1）の50μLを混合します。この混合物は、グルコアミラーゼが含まれています。室温で30分間インキュベートする。
2. 規格グリコーゲン（2 mg / ml）での希釈することにより検量線を作成し加水分解緩衝液中で10μg/ mlの溶液に、キットにup​​plied。次に、6つの別々の0有する管、4、8、12、16、および10μg/ mlの標準液20μlを調製し、0のグリコーゲンの濃度を与えるために加水分解緩衝液で最終体積50μlに各チューブに調整0.04 、0.08、0.12、0.16、および0.2μgの個/ ml。規格で加水分解酵素ミックスの1μlを加え、室温で30分間インキュベートする。

遊離グルコース濃度の値によって与えられる細胞株のバックグラウンドのグルコース濃度は、細胞中のグリコーゲンのレベルを決定する総グルコース濃度（グリコーゲン加水+遊離グルコースからグルコース）の値から減算されなければならない。

3。蛍光の開発と読書

1. 各条件について、（総グルコース濃度を測定するための遊離グルコース濃度及びつのチューブ（チューブ2,3）を測定するために、各チューブウィットつのチューブ（チューブ1）を調製HA加水分解されたグリコーゲンの別のボリューム）。
2. チューブ1のステップ1の終了時に抽出された上澄み液15μlを追加します。 50μlの最終体積に完了するには加水分解緩衝液の35μlを加える。得られた蛍光は、遊離グルコース濃度が得られます。
3. チューブ2（ステップ2）で得られた加水分解されたグリコーゲンのXを添加する。 50μlの最終体積に調節してください。サンプル容量（Xμl）を検量線の濃度を超えていない蛍光値を得るために、細胞密度および/ ​​または細胞型に応じて調整する必要がある。
4. チューブ3で加水分解グリコーゲンの2 のXを添加する。 50μlの最終体積に調節してください。
5. 各チューブの開発バッファーの48.7μL、開発酵素ミックスを1μlと（グリコーゲンアッセイキットに付属）OxiRedプローブの0.3μLを混合することにより、サンプルおよび標準の開発ソリューションを準備します。例えば、2つの条件のために、チューブ12のためのミックスを調製S（標準のための6、遊離グルコースおよび総グルコース蛍光について4 2）。
6. 各チューブに、このミックスを50μl加え、暗所で室温で30分間インキュベートする。
7. 推奨されるように535 nmで587 nmの発光波長の励起波長で蛍光を測定し、励起および発光のため3nmのスリット。

結果

腫瘍細胞に対する腫瘍シグナルの酸素（低酸素）の低レベル生き残るように、その後の栄養枯渇を処理するためのエネルギーを蓄積する必要がある。グリコーゲンは、哺乳動物細胞中のグルコースの主なエネルギーのポリマーであるとして、我々は、低酸素状態におけるグリコーゲン貯蔵の調節を研究した。 表1、表2、および図3に示すように、細胞溶解物中のグリ?...

ディスカッション

in vitroでのグリコーゲンの生化学的滴定は、細胞のグリコーゲン含有量の正確な定量が可能になります。いくつかの他の技術（グリコーゲン抗体を用いたPAS、免疫蛍光など ）と比較すると、この滴定は、非常に、特定の高感度かつ再現性がある。それは放射能が、蛍光分光計を必要としないので、この方法が便利です。しかし、この技術は、純粋に定量的であり、細胞内のグリ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
			EQUIPMENT
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B