糖原生化滴定<em&gt;在体外</em

摘要

我们在这里描述的糖原体外滴定准确，重现性好，方便的生化方法。这种技术使用了Abcam公司糖原测定试剂盒和基于糖原的连续水解的荧光成葡萄糖和葡萄糖滴定。

摘要

糖原是葡萄糖在脊椎动物的主要精力充沛的聚合物和起着全身代谢以及细胞代谢至关重要的作用。许多方法来检测糖原已经存在，但只有少数是定量的。我们在这里描述使用Abcam公司糖原测定试剂盒，它是基于糖原的特异性降解由葡糖淀粉酶对葡萄糖的方法。葡萄糖被再具体地说被氧化，因为与OxiRed探针，以产生荧光反应产物。滴定法准确，灵敏，可在细胞提取物或组织切片来实现。然而，相对于其他技术，它不提供有关糖原在细胞中分布的信息。作为这种技术的一个例子，我们在这里描述的糖原滴定在两种细胞系，中国仓鼠肺成纤维细胞CCL39和人结肠癌LS174，孵育在常氧（21％O _2）与低氧（1％O _2）。我们假设，缺氧是SIGNAL，准备细胞合成和储存糖原为了生存^1。

引言

糖原是葡萄糖残基的多分支聚合物，其存在于许多类型的细胞的细胞质中。它的能量储存在细胞中的主要形式之一，在糖代谢中起重要作用。大多数哺乳动物细胞能够生产和储存的糖原，可迅速降解成葡萄糖代谢应激过程中，以促进糖酵解和ATP生产。肝细胞糖原产生大量的调节血糖水平，从而提供给身体一个连续供应的葡萄糖。与此相反，糖原在其它细胞（肌肉，红细胞等 ）的浓度相对较低。然而，在当地，这些量足以在短期内，当细胞被突然暴露于被剥夺营养物质的环境中提供能量。

糖原合成和糖原分解如下在所有组织中相同的步骤（ 图1）。首先，葡萄糖进入细胞的葡萄糖转运蛋白（生产过剩）和葡萄糖-6 - 磷酸（G6P）由磷酸变迅速转化成葡萄糖-1 - 磷酸（G1P）。 G1P然后修改成UDP-葡萄糖，和UDP-葡萄糖的碳C1被附加到糖原生成，糖原的锚定蛋白的酪氨酸残基。这种分子，被认为是糖原引物，由附着了UDP-葡萄糖到终端葡萄糖的延长通过糖原合成酶的α（1→4）键。最后，当形成超过11个葡萄糖残基的直链，分支酶转移一个终端寡糖附近通过α（1→6）​​键由至少6个葡萄糖残基组成的链的另一个葡萄糖。这一过程的重复给出包含形成与每转6.5葡萄糖螺旋分支大规模分形结构。糖原可以反向水解由协调一致的行动，以葡萄糖脱支该水解α（1→6） ​​约束和糖原磷酸化酶能够水解的α（1→4）糖苷结合的一个分支的葡萄糖的最后一个残基与糖原分子之间的酶。此反应称为糖原分解是通过增加AMP水平（反映ATP消耗）激活，并且由葡萄糖和ATP ^2,3抑制。

通过电子显微镜，糖原分子已被许多细胞类型中，直径15-30纳米，β自由粒子（或糖原monoparticles）中所述。在特定的细胞类型，例如肝细胞，β粒子可被组装成一个复合物形成玫瑰花结，也称为α粒子，在不同的直径从80纳米至最多为200nm的⁴ 。这些β粒子结合形成较大的α粒子的集群的方式还没有完全阐明。一些证据倾向于证明β粒子可以通过共价键^5，氢键，或什至通过蛋白质-蛋白质相互作用⁶键合。糖原储存在细胞的量取决于许多参数：（Ⅰ）在糖原生成发起糖原合成的细胞的数量;由蛋白质磷酸化/去磷酸化调节糖原合酶和磷酸化酶（Ⅱ）的活性;（Ⅲ）的浓度葡萄糖在细胞内，这是依赖于几个参数，如葡萄糖从血管系统的供应和葡萄糖被细胞吸收。肝糖的储存是通过中间代谢产物严格的监管由生物合成的激素变构调节，受激素调节能量代谢，并通过营养感应信号通路^7。

是很重要的能够量化的糖原生物样品中更好地了解糖原代谢的整个身体和细胞水平的重要性。我们在这里描述的糖原体外测定准确，重现性好，方便生化。这个技术是基于之前和之后的糖原水解特定的量化葡萄糖荧光。

其他方法存在估计糖原水平在细胞内，但其中大多数是不定量的。一种用于糖原在细胞的定量描述的第一方法是基于^[14 C]-葡萄糖掺入糖原^8,9的测量值。使用的放射性使得这一过程更难以处理，但它具有提供葡萄糖掺入率成糖原和葡萄糖残基上的外分支和在该分子的核心分布之间进行区分的优点（它也需要一个额外的β-amylolySIS和层析步骤）。另一种技术被开发，最近，是基于2-NBDG的掺入对（2 - {N-[7 - 硝基苯并-2 - 氧杂-1,3 - 二唑-4 - 基]氨基} -2 - 脱氧葡萄糖），一2 -脱氧葡萄糖荧光衍生物，成糖原^10。所测量的荧光强度反映了糖原的产生量，并可以用荧光阅读器进行测定。荧光在细胞中的分布，也可以通过共聚焦显微镜评价。

在其他的非定量技术，高碘酸 - 希夫染色（PAS）可能是最常见的。它可用于糖原在固定的细胞，组织切片中的石蜡或冰冻的检测。这种组织学技术的色彩非特异性多糖，糖脂，糖蛋白，纤维素和中性粘蛋白在紫色。本试验的特异性可提高治疗固定细胞或组织切片与淀粉酶，其特异性地消化糖原。此后，糖原的水平可以通过比较未水解样品（所有碳水化合物大分子修饰），以水解样品（碳水化合物大分子修饰糖原除外）进行定性估计。 PAS染色和显微镜分析，与糖原的生化分析，提供关于糖原在细胞中的分布，从而可以扩散或集中在细胞的特定部分的信息。然而，即使在不同条件之间的糖原累积PAS染色估计的差异，这是不定量^11。

单克隆抗体的小鼠最初做用下颌骨髁状突软骨作为抗原已被证明与糖原的细胞和用纯化糖原在体外 ¹²反应。作为该抗体特异性地识别糖原相关的糖链，它是糖原在比PAS染色的更具体的方式的检测用免疫组织化学的有用工具。

电子显微镜是另一种技术，它允许在细胞和糖原贮积的程度的评价晶粒糖原的可视化。事实上，糖原β粒子很容易辨认用电子显微镜作为电子致密颗粒^1。

研究方案

糖原生化滴定

1。细胞裂解

1. 种子细胞以0.5-2×10 ⁶个，每100毫米直径的培养皿的浓度。
2. 治疗方法：细胞培养24，48，或72小时的氧气浓度低（缺氧）的一个Bug盒厌氧工作站（Ruskinn科技Biotrace INTERNATIONAL PLC，英国Bridgend）定为1％或0.1％的O _2，94％或94.9％N ₂和5％CO _2。同时，培养细胞在常氧_{（21％O2，5％CO2）。}改变培养基（25mM的含有葡萄糖的培养基中），每24小时以在实验的时间变化最小的葡萄糖浓度。
3. 治疗后，用PBS洗涤细胞2倍，从培养基中除去葡萄糖的痕迹。刮去细胞冷PBS。
4. 离心溶液以1,000 rpm离心5分钟，弃去上清，用PBS洗涤沉淀一次。沉淀可在-20°C进一步处理之前被冻结。
5. 重悬沉淀在100μl蒸馏水中。加入100μl的糖原水解缓冲器提供与糖原测定试剂盒（Abcam公司）。煮沸裂解物在95℃下5分钟，以灭活酶。
6. 涡旋并离心溶胞产物以13,000 rpm离心10分钟以除去不溶性产物。保留上清液。
7. 正常化糖原水平到样本之间的蛋白质含量，蛋白质的定量可以用25-35微升使用二喹啉甲酸测定（BCA-INTERCHIM）的上清液进行。

一些裂解物可用于测量细胞内的游离葡萄糖浓度。

2。糖原水解

1. 混合50微升上清液（步骤1）与1微升的水解酶混合物的。该混合物中含有淀粉酶。孵育30分钟，在室温下进行。
2. 通过稀释标准糖原制备校准曲线（2毫克/毫升）■upplied与试剂盒，以1​​0微克/毫升在水解缓冲液的溶液。接着，准备6 0分离的管，4，8，12，16，和20微升的10微克/毫升的标准和每个管调整到50微升与水解缓冲液的最终体积，得到的0糖原的浓度，0.04 ，0.08，0.12，0.16，和0.2微克/毫升。加入1μl水解酶混合物的标准中并孵育30分钟，在室温下进行。

该细胞系的背景葡萄糖浓度，按值的游离葡萄糖浓度给出，必须先减去该值的总葡萄糖浓度（从糖原水解+游离葡萄糖葡萄糖）来确定糖原在细胞中的水平。

3。发展与阅读荧光

1. 对于每个条件，（管1）准备一管来测量游离葡萄糖浓度和两管（管2和3）来测量总的葡萄糖浓度（每管机智哈哈不同的卷水解糖原）。
2. 加15微升上清液在管1步骤1的端部抽出。加35微升的水解缓冲液来完成的，以50微升的最终体积。得到的荧光将得到游离葡萄糖浓度。
3. 在管2添加水解糖原（在步骤2中获得的） 第 X微升。调整到50微升的最终体积。样品的体积（倍微升）必须根据为了获得所没有超出校准曲线的浓度的荧光值的细胞密度和/或细胞类型进行调整。
4. 添加水解糖原的2×μl，以管3。调整到50微升的最终体积。
5. 通过将每个管48.7微升发展缓冲区，1微升开发酶混合物和0.3微升OxiRed探头（在糖原检测试剂盒提供）准备样品和标准开发的解决方案。例如，对于2的条件下，准备一个混合的12管S（6标准，2个免费的葡萄糖和4总葡萄糖荧光）。
6. 加50μl的此混合物至每个管并孵育30分钟，在室温下在黑暗中。
7. 测量的荧光在535纳米，587纳米的发射波长的激发波长的建议，并为3nm用于激发和发射的狭缝。

结果

氧气（缺氧）肿瘤中的信号对肿瘤细胞需要存储能量来处理后续的养分耗竭，以便生存的低水平。糖原是葡萄糖在哺乳动物细胞中的主要高能聚合物，我们研究了糖原储存在缺氧的调节。糖原的细胞裂解液中的浓度的计算和标准化，必须对荧光的原始数据，进行如表1，2，和3。的生物化学测定糖原证实，电子致密聚集体上CCL39细胞的电子显微镜照片观察到（ 图2A）

讨论

糖原在体外生化滴定允许细胞糖原含量的准确定量。比较一些其他技术（PAS，免疫荧光与糖原抗体等 ），该滴定是非常特异，灵敏，可重复的。此外，该方法是方便的，因为它不需要放射性但荧光光谱仪。然而，这种技术是纯粹的定量和不提供有关在细胞糖原分布的信息。

在这个手稿中描述的技术是实现对细胞提取物中，但它也可以实现对组织切片以用于从组?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
EQUIPMENT
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B