Titolazione biochimica di glicogeno<em&gt; In vitro</em

Riepilogo

Descriviamo qui un metodo biochimico accurato, riproducibile e conveniente per la titolazione del glicogeno in vitro. Questa tecnica utilizza il kit di analisi Abcam glicogeno e si basa sulla successiva idrolisi del glicogeno in glucosio e titolazione mediante fluorescenza.

Abstract

Il glicogeno è la principale polimero energetico del glucosio negli animali vertebrati e svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo del corpo intero e nel metabolismo cellulare. Esistono già molti metodi per rilevare glicogeno, ma solo pochi sono di tipo quantitativo. Descriviamo qui un metodo che utilizza il kit di analisi Abcam Glicogeno, che si basa sulla specifica degradazione del glicogeno in glucosio da glucoamilasi. Il glucosio viene ossidato specificamente ad un prodotto che reagisce con la sonda OxiRed per produrre fluorescenza. La titolazione è preciso, sensibile e può essere realizzato su estratti cellulari o sezioni di tessuto. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, non dà informazioni sulla distribuzione del glicogeno nella cellula. Come esempio di questa tecnica, descriviamo qui la titolazione di glicogeno in due linee cellulari, cinese CCL39 fibroblasti di polmone di criceto e LS174 carcinoma del colon umano, incubati in normossia (21% O ₂₎ rispetto ipossia (1% O _2). Abbiamo ipotizzato che l'ipossia è un segnalenale che prepara le cellule per sintetizzare e conservare glicogeno per sopravvivere ^1.

Introduzione

Il glicogeno è un polimero con molti rami di residui di glucosio, che è presente nel citoplasma di molti tipi di cellule. È una delle principali forme di immagazzinamento dell'energia nelle cellule e svolge un ruolo importante nel metabolismo del glucosio. La maggior parte delle cellule di mammiferi sono capaci di produrre e immagazzinare glicogeno, che può essere rapidamente degradato in glucosio per promuovere la glicolisi e produzione di ATP durante lo stress metabolico. Gli epatociti producono enormi quantità di glicogeno per regolare il livello di zucchero nel sangue fornendo così un approvvigionamento continuo di glucosio nel corpo. Al contrario, la concentrazione di glicogeno in altre cellule (muscoli, globuli rossi, ecc) è relativamente bassa. Tuttavia, localmente, queste quantità sono sufficienti a fornire energia a breve termine, quando le cellule sono improvvisamente esposti a un ambiente privo di sostanze nutritive.

Sintesi di glicogeno e la ripartizione del glicogeno segue gli stessi passi in tutti i tessuti (Figura 1). In primo luogo, il glucosioentra cellule trasportatori del glucosio (glutei), e viene rapidamente convertito dal glucosio-6-fosfato (G6P) in glucosio-1-fosfato (G1P) da fosfoglucomutasi. G1P viene quindi modificato in UDP-glucosio e il carbonio C1 di UDP-glucosio è attaccato ad un residuo di tirosina glycogenin, la proteina di ancoraggio di glicogeno. Questa molecola, considerato un primer glicogeno, viene esteso mediante attacco del UDP-glucosio al glucosio terminale da un α (1 → 4) bond tramite il glicogeno sintasi. Infine, quando si forma una catena lineare di oltre 11 residui di glucosio, l'enzima di ramificazione trasferisce un oligosaccaride terminale costituito da un minimo di 6 residui di glucosio all'altro glucosio della catena vicina attraverso un α (1 → 6) linkage. La ripetizione di questo processo dà una struttura frattale massiccia contenente rami che formano un'elica con 6,5 glucosio ogni turno. Il glicogeno può essere inversamente idrolizzato al glucosio con l'azione concertatadebranching di enzimi che idrolizzano il α (1 → 6) vincolato e glicogeno fosforilasi che idrolizza il α (1 → 4) glicosidico limite tra l'ultimo residuo di glucosio di un ramo e la molecola di glicogeno. Questa reazione chiamato glicogenolisi viene attivato aumentando i livelli di AMP (riflettente consumo di ATP), e inibito dal glucosio e ATP ^2,3.

Mediante microscopia elettronica, le molecole di glicogeno sono stati descritti in molti tipi cellulari particelle β libere (o monoparticelle glicogeno) di 15-30 nm di diametro. In specifici tipi cellulari quali epatociti, particelle β possono essere assemblate in un complesso per formare rosette, noto anche come particelle α che variano in diametro da 80 nm a un massimo di 200 nm ⁴ . Il modo in cui queste particelle β sono legati per formare grandi aggregati di particelle α non è ancora completamente chiarito. Alcune prove tende a dimostrare che le particelle β possono essere legati da legami covalenti ^5, legame a idrogeno, o anche attraverso le interazioni proteina-proteina ^6. La quantità di glicogeno immagazzinato nelle cellule dipende da molti parametri: (I) la quantità di glycogenin nella cella che inizia la sintesi del glicogeno, (ii) l'attività di glicogeno sintasi e fosforilasi regolato dalla proteina fosforilazione / defosforilazione; (III) la concentrazione di glucosio nelle cellule, che dipende da diversi parametri, quali la fornitura di glucosio dal sistema vascolare e l'assorbimento del glucosio da parte delle cellule. Le riserve di glicogeno sono strettamente regolati da regolazione allosterica di ormoni biosintetici attraverso metaboliti intermedi, da ormoni che regolano il metabolismo energetico, e attraverso vie di segnalazione di rilevamento nutrienti ^7.

È importante esseregrado di quantificare glicogeno in campioni biologici per meglio comprendere l'importanza del metabolismo del glicogeno in tutto il corpo e livello cellulare. Descriviamo qui un preciso, riproducibile e conveniente biochimico prova in vitro per glicogeno. Questa tecnica si basa sulla fluorescenza quantificazione glucosio prima e dopo specifico idrolisi di glicogeno.

Altri metodi esistono per stimare il livello di glicogeno nelle cellule, ma la maggior parte di essi non sono quantitative. Una delle prime tecniche descritte per la quantificazione di glicogeno nelle cellule era basato sulla misurazione di costituzione ^[14 C]-glucosio in glicogeno ^8,9. L'uso di radioattività rende questo processo più difficile da gestire, ma ha il vantaggio di fornire la velocità di incorporazione del glucosio in glicogeno e nel distinguere tra la distribuzione di residui di glucosio sui rami esterni e nel nucleo della molecola (richiede anche un ulteriori β-amylolysis ed una fase cromatografica). Un'altra tecnica è stata sviluppata più recentemente e si basa sull'incorporazione di 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-il] ammino}-2-deossiglucosio), un derivato fluorescente 2-deossiglucosio, in glicogeno ^10. L'intensità di fluorescenza misurata riflette la quantità di glicogeno prodotta e può essere misurata con un lettore di fluorescenza. Distribuzione di fluorescenza nella cella può essere valutata mediante microscopia confocale.

Tra le altre tecniche nonquantitative, Periodic Acid Schiff colorazione (PAS) è forse il più comune. Può essere usato per la rilevazione di glicogeno in cellule fissate, sezioni di tessuto in paraffina o congelati. Questo istologici colori tecnica non specificamente polisaccaridi, glicolipidi, glicoproteine, cellulosa e mucine neutre in viola. La specificità di questo test può essere aumentata mediante trattamento di cellule fissate o sezioni di tessuto con diastasi, che digerisce specificamente glicogeno. Successivamente,il livello di glicogeno può essere qualitativamente stimata confrontando campioni non idrolizzati (tutti macromolecole carboidrati modificati) per campioni idrolizzati (carboidrati modificato macromolecole tranne glicogeno). Colorazione PAS e analisi microscopica, a differenza saggi biochimici di glicogeno, fornisce informazioni relative alla distribuzione di glicogeno nella cellula, che può essere diffusa o concentrata in una determinata parte della cellula. Tuttavia, anche se le differenze stime PAS colorazione in accumulo glicogeno tra condizioni diverse, non è quantitativa ^11.

Un anticorpo monoclonale di topo originariamente realizzato utilizzando condilare mandibolare cartilagine come antigene ha dimostrato di reagire con glicogeno in cellule e con glicogeno purificato in vitro ^12. Dato che questo anticorpo riconosce specificamente catene di zuccheri glicogeno riscontrato, è un utile strumento per la rilevazione di glicogeno mediante immunoistochimica in maniera più specifica della colorazione PAS.

La microscopia elettronica è un'altra tecnica che permette la visualizzazione di grani di glicogeno nelle cellule e la valutazione del grado di glicogeno accumulo. Infatti, le particelle β glicogeno sono facilmente riconoscibili con un microscopio elettronico come elettroni densi granuli ^1.

Protocollo

Titolazione biochimica di glicogeno

1. Lisi cellulare

1. Alveoli ad una concentrazione di 0,5-2 x 10 ⁶ per ogni 100 mm di diametro piatto.
2. Trattamento: incubare cellule 24, 48, o 72 ore a bassa concentrazione di ossigeno (ipossia) in una stazione di lavoro anaerobico Bug-Box (Ruskinn Tecnologia Biotrace International Plc, Bridgend, Regno Unito) fissato al 1% o 0,1% O _2, 94% o 94,9% N _2, e 5% di CO _2. Parallelamente, incubare le cellule in normossia (21% O _2, 5% CO _2). Cambiare mezzo (25 mM mezzo contenente glucosio) ogni 24 ore per minimizzare variazioni della concentrazione di glucosio durante il periodo dell'esperimento.
3. Dopo il trattamento, le cellule lavaggio 2x con PBS per rimuovere tracce di glucosio dal mezzo di coltura. Raschiare le cellule in PBS freddo.
4. Centrifugare a 1.000 rpm per 5 min, scartare il surnatante e lavare il pellet una volta con PBS. Il pellet può essere congelato a -20 ° C prima di procedere ulteriormente.
5. Risospendere il pellet in 100 ml di acqua distillata. Aggiungere 100 ml di idrolisi Buffer glicogeno forniti con il glicogeno Assay Kit (Abcam). Bollire il lisato a 95 ° C per 5 minuti per inattivare gli enzimi.
6. Vortex e centrifugare il lisato a 13.000 rpm per 10 minuti per rimuovere i prodotti insolubili. Conservare il surnatante.
7. Per normalizzare i livelli di glicogeno al contenuto proteico tra i campioni, quantificazione delle proteine ​​può essere fatto con 25-35 ml del supernatante utilizzando il test Acid bicinconinico (BCA-Interchim).

Alcuni di lisato può essere utilizzato per misurare la concentrazione di glucosio libero all'interno delle cellule.

2. L'idrolisi del glicogeno

1. Mescolare 50 ml di surnatante (passo 1) con 1 ml di miscela di idrolisi enzimatica. Questa miscela contiene glucoamilasi. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Preparare la curva di taratura diluendo il glicogeno standard (2 mg / ml) supplied con il kit per una soluzione di 10 mg / ml nel tampone di idrolisi. Quindi, preparare sei provette separate con 0, 4, 8, 12, 16, e 20 ml di 10 mg / ml di serie e regolare ogni tubo ad un volume finale di 50 ml con tampone di idrolisi per ottenere una concentrazione di glicogeno di 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 e 0,2 mg / ml. Aggiungere 1 ml di idrolisi enzimatica Mix nelle norme e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

La concentrazione di glucosio sfondo della linea cellulare, data dal valore della concentrazione di glucosio libero, deve essere sottratta dal valore della concentrazione di glucosio totale (glucosio dal glicogeno idrolisi + senza glucosio) per determinare il livello di glicogeno nella cellula.

3. Sviluppo e lettura di fluorescenza

1. Per ogni condizione, preparare un tubo (tubo 1) per misurare la concentrazione di glucosio libero e due tubi (tubi 2 e 3) per misurare la concentrazione di glucosio totale (ogni wit tuboha diverso volume di glicogeno idrolizzato).
2. Aggiungere 15 ml di surnatante estratti alla fine del passaggio 1 nella provetta 1. Aggiungere 35 ml di tampone di idrolisi per completare ad un volume finale di 50 microlitri. Fluorescenza Ottenuto darà la concentrazione di glucosio libero.
3. Aggiungi X ml di glicogeno idrolizzato (ottenuta nella fase 2) in tubo 2. Regolare il volume finale di 50 microlitri. Volume del campione (X microlitri) deve essere regolata in funzione della densità cellulare e / o tipo cellulare al fine di ottenere valori di fluorescenza che non vadano oltre concentrazioni della curva di calibrazione.
4. Aggiungere 2 X ml di glicogeno idrolizzato nel tubo 3. Regolare il volume finale di 50 microlitri.
5. Preparare una soluzione di sviluppo per i campioni e gli standard miscelando per ogni tubo 48,7 ml di tampone Sviluppo, 1 ml di Sviluppo Enzyme Mix e 0,3 ml di OxiRed Probe (fornita nel glicogeno Assay Kit). Ad esempio, per 2 condizioni, preparare una miscela per 12 tubos (6 per gli standard, 2 per il glucosio libero e 4 per la fluorescenza totale di glucosio).
6. Aggiungere 50 ml di questa miscela a ciascuna provetta e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
7. Misurare la fluorescenza ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 535 nm, lunghezza d'onda di emissione di 587 nm come raccomandato, e una fessura di 3 nm di eccitazione e di emissione.

Risultati

Un basso livello di ossigeno (ipossia) in segnali tumori a cellule tumorali la necessità di immagazzinare energia per gestire conseguente esaurimento degli elementi nutritivi, in modo da sopravvivere. Come glicogeno è il principale polimero energetico del glucosio nelle cellule di mammifero, abbiamo studiato la regolazione della glicogenosi in ipossia. Il calcolo e la standardizzazione della concentrazione di glicogeno in lisati cellulari devono essere eseguite sui dati grezzi di fluorescenza come mostrato nelle

Discussione

Titolazione biochimica di glicogeno in vitro permette una quantificazione precisa delle cellule contenuto di glicogeno. Rispetto ad altre tecniche (PAS, immunofluorescenza con un anticorpo glicogeno, ecc.), Questa titolazione è molto specifico, sensibile e riproducibile. Inoltre, il metodo è conveniente in quanto richiede nessuna radioattività ma uno spettrometro a fluorescenza. Tuttavia, questa tecnica è puramente quantitativa e non fornisce informazioni sulla distribuzione glicogeno nella cella. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Glycogen Assay Kit	Abcam	ab65620
PBS
EQUIPMENT
Fluorescence Spectrometer	PerkinElmer	LS 50B