استعدادا شبه سليمة المعزولة من الفأر الدهليزي الظهارة الحسية للالكهربية وعالية الدقة الميكروسكوب ثنائي الفوتون

Summary

معقد تحليل الدهليزي وظيفة خلايا الشعر عن طريق موقعهم في أعماق أصعب جزء من الجمجمة، والعظم الصدغي الصخري. وقد استخدمت معظم الدراسات خلية الشعر وظيفي حاد خلايا الشعر معزولة. هنا نحن تصف إعداد شبه سليمة من ظهارة الدهليزي الماوس للدراسات المجهر الكهربية واثنين من الفوتون.

Abstract

فهم خلايا الشعر الدهليزي تعمل في ظل ظروف طبيعية، أو كيف الصدمات النفسية، والمرض، والشيخوخة تعطيل هذه الوظيفة هي خطوة حيوية في وضع نهج وقائي و / أو استراتيجيات علاجية جديدة. ومع ذلك، فإن غالبية الدراسات التي بحثت في وظيفة الدهليزي الشاذ لم تكن على المستوى الخلوي ولكنها ركزت في المقام الأول على المقايسات السلوكية من اختلال وظيفي الدهليزي مثل التحليلات مشية والأداء المنعكس الدهليزي العيني. في حين أن هذا العمل قد حقق بيانات قيمة حول ما يحدث عندما تسوء الأمور، واستقاها القليل من المعلومات بشأن الأسباب الكامنة وراء اختلال وظيفي. من الدراسات التي تركز على العمليات الخلوية والتحت خلوية التي تكمن وراء وظيفة الدهليزي، وقد اعتمدت معظم تماما على خلايا الشعر معزولة، خالية من صلاتهم متشابك ودعم بيئة الخلية. ولذلك، فقد كان التحدي التقني الرئيسي الوصول إلى خلايا حساسة بشكل رائع الشعر الدهليزي في الإعداديةaration التي تعطلت الأقل، من الناحية الفسيولوجية. هنا علينا أن نظهر استعدادا شبه سليمة من الفأرة دهليزي ظهارة الحسية التي يحتفظ الصغرى البيئة المحلية بما في ذلك خلية الشعر / المجمعات وارد الأولية.

Introduction

على الرغم من المساهمة الكبيرة للنظام الدهليزي في حياتنا اليومية، وفهم واضح لعمليات مسؤولة عن الانخفاض الملحوظ في وظيفة الدهليزي مع التقدم في السن لا تزال بعيدة المنال. وأحد أسباب هذا النقص في المعرفة هو أن الانخفاض في وظيفة الدهليزي قد وجه الحصر تقريبا تم استكشافه باستخدام المقايسات السلوكية، بما في ذلك المنعكس الدهليزي العيني (VOR)، وهو مؤشر دقيق من وظيفة الدهليزي خارجي، ولكنها توفر رؤى محدودة إلى التغييرات الجوهرية من مكونات . هذا يشكل عائقا رئيسيا في فهمنا لالدهليزي وظيفة خلايا الشعر في الصحة والمرض، أو الشيخوخة.

بينما كانت هناك العديد من الدراسات الفردية خلايا الشعر الدهليزي، وكان أحد أوجه القصور الرئيسية في الاعتماد على التحضيرات خلية الشعر الحادة، حيث يتم إزالة خلايا الشعر والمحطات وارد حتى الكأس من بيئتهم الطبيعية عبر المعالجة الميكانيكية و / أو الأنزيمية. النهج مثل inevitaتعطيل بلاي والمعمارية المصغرة الدقيق بين الخلية الشعر والكأس، والشعر الخلية والخلية الداعمة. مع تطور التحضيرات شبه سليمة ^1-5، والماوس معزولة إعداد متاهة ^6، وهناك الآن فرصة لدراسة مختلف أشكال الاتصالات متشابك في ظل ظروف أكثر شبها تلك الموجودة في الجسم الحي. في الواقع، ليم وآخرون (2011) وأظهرت فروق كبيرة في تيارات خلية كاملة مسجلة من نوع معزولة تماما أنا خلايا الشعر الدهليزي مقارنة مع تلك التي بقيت جزءا لا يتجزأ من داخل الظهارة العصبية. على وجه التحديد، ويعتقد البوتاسيوم لتتراكم في الفضاء بين الخلايا، بين الخلية الشعر والكأس وارد، ويغير كثيرا شعر استجابة الخلية ^7. وهذا النوع من المعلومات سيكون من المستحيل للحصول دون إعداد شبه سليمة من ظهارة الحسية الدهليزي هو موضح هنا. ونحن لشرح إعداد شبه سليمة من الفأرة العرف ³وتظهر نتائج ممثلة تم الحصول عليها من خلية كاملة التصحيح الكهربية، والتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. جماعة من الحيوان

1. وتم الحصول على الفئران من مركز القوارض الأسترالي (ARC؛ بيرث، أستراليا) والذي عقد في جامعة سيدني مرفق الحيوان بوش على الضوء / الظلام دورة 12 ساعة طبيعية مع تخصيب البيئية. وقد وافق جميع التجارب التي وصفها جامعة سيدني جنة الأخلاقيات الحيوان.
2. واستخدمت الفئران الذكور والإناث (C57/Bl6) لجميع التجارب منذ هذه السلالة تستخدم عادة كخلفية للتلاعب الجيني، ويمكن اعتبار ما يعادل wildtype ^8-9.

2. إعداد الأنسجة

1. إعداد 300 مل من الجلسرين الاصطناعية القائمة على السائل المخي الشوكي (ACSF)، ويتألف من (مم): 26 NaHCO _3، 11 الجلوكوز، 250 الجلسرين، و 2.5 بوكل، 1.2 ناه ₂ ص _4، 1.2 MgCl ₂ و 2.5 و CaCl _2. قبل إضافة و CaCl _2، الغاز الحل مع كربوجين (95٪ O ₂ و 5٪ CO ₂₎ لإنشاء APH من 7.4 وتجنب هطول الكالسيوم (الغيوم). تجميد الحل في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة وذلك أن الطين الجليد تتشكل.
2. تخدير عميق الفئران مع الكيتامين (100 ملغ / كغ) (بارنيل، الاسكندرية، أستراليا) عن طريق حقنة داخل الصفاق.
3. مرة واحدة ردود الفعل قرصة القائمة الخلفية هي الفئران قطع رأس غائبة باستخدام مقص حاد الفولاذ المقاوم للصدأ وجعل شق الجلد السهمي باستخدام شفرة حلاقة (تقريب رقم 22) لفضح الجمجمة. في هذه المرحلة وطوال الخطوات 2،3-2،8 يجب أن تبقى قبو الجمجمة والدماغ، والجهاز الدهليزي الكامنة وبارد ممكن عن طريق تطبيق العادية من ACSF الجليد الباردة على الأنسجة.
4. باستخدام ذراع مدببة من مقص نمط معياري (FST، شمال فانكوفر، كندا) إجراء شق صغير في الجمجمة في امدا وقطع على طول الدرز السهمي. تأكد من أن الدماغ لا "جر" بواسطة شفرة القص خلال هذه الخطوة.
5. بعناية قشر العظام الجداري بعيدا أفقيا والقذالي العظام posterioRLY باستخدام الضحلة منحنى بيرسون رينجرز (FST).
6. ثم يتم استخدام ملعقة صغيرة الفولاذ المقاوم للصدأ لرفع بلطف الدماغ من سطح الحفرة القحفية المتوسطة والخلفي، وvestibulocochlea العصب يتعرض (CNVIII) قطع منتصف المسافة بين الأذن الداخلية والدماغ مع زوج من مقص القزحية غرامة. قطع هذا العصب يقلل من التوتر لا مبرر له على محاور عصبية من afferents الابتدائية وصلاتهم مع خلايا الشعر.
7. بعد عانى من قطع من CN الثامن تتم إزالة الدماغ جملة وتفصيلا.
8. المتاهة الدهليزي هو الآن واضحة للعيان في الحفرة القحفية المتوسطة، مع القوقعة مشيرا anteromedially. قراضة جانبي من المتاهة الدهليزي قبل استئصال بلطف بواسطة تجتاح القناة الهلالية الأمامية وسحب أفقيا.
9. تزج المتاهات رفعه (الشكل 1) في طبق تشريح تحتوي على، ACSF الجليد الباردة بالغاز بشكل مستمر وصفها في القسم 2.1. تحت stereomicroscope، عقد المتاهة إلىقاعدة طبق من قبل تجتاح القوقعة. استخدام ملقط غرامة الى نقطة الصفر بعيدا في العظام التي تغمر الأمامية الهلالية أمبولة القناة. مرة واحدة ويتحقق وجود ثقب صغير في العظام تبدأ في نفض الغبار العظم بعيدا عن أمبولة. وينبغي اتخاذ الحذر على عدم دفع ملقط من خلال العظام وهذا يمكن أن تسبب ضررا على التيه الغشائي الكامنة وظهارة حسية. يستمر هذا الإجراء حتى يتم كشفها على حد سواء الأمامي والمتاخمة أفقي القنوات الهلالية الغشائية والأمبولات (الشكل 2).

الشكل 1. الماوس معزولة الدهليزي متاهة. A. اللوحة اليسرى) تمثيل تخطيطي للالمعزولة الماوس المتاهة الدهليزي. نقطة مرجعية هامة للوصول إلى ظهارة الحسية الدهليزي، القوقعة، الأمامية، والأفقي القنوات الهلالية هي مختبرإليد. العلامات النجمية تشير إلى أمبولة القناة الهلالية التي تحتوي على ظهارة الحسية الدهليزي. B. اللوحة اليمنى) صورة مجهرية من المتاهة الدهليزي المعزولة من الفأر 1 أشهر من العمر.

الشكل 2. التعرض من المتاهة الدهليزي غشائي. العظم المغطي الأمامي والأفقي نصف دائري الأمبولات قناة تم خدش بعيدا لتكشف أسود / البني الأرقط في الأمبولات غشائي والأعصاب المرتبطة أمبولي (CNVIII). التخطيطي في لوحة السفلي يمثل الهياكل في المنطقة وأبرز من صورة مجهرية ويظهر العلاقة بين القنوات القناة الهلالية إلى الأمبولات وCNVIII.

10. باستخدام ملقط غرامة، ورفع بلطف الأمبولات وما يرتبط بها من utricle بعيدا عن متاهة عظمي، وضمان أن المنطقة الوسطى من الأمبولات (كونتاining ظهارة حسية) غير معطوب. في بعض الحالات قد تحتاج الجزء القريب من القناة الهلالية الغشائية إلى قطع مع مقص القزحية للافراج عن الأمبولات من العظام.
11. نقل ثالوث الأمبولات التي تحتوي على اثنين وutricle في طبق بتري مليئة L-15 مستنبت ليبوفيتش (سيغما الدريخ، سانت لويس، MO). استخدام الألياف البصرية إلى "الخلفية" الأنسجة. هذا يسمح التصور واضح للعرف الذي يحتوي على ظهارة حسية داخل الأمبولات.
12. جعل بعناية شق في أرقط "سقف" من utricle مع مقص القزحية غرامة. يستمر هذا الشق من خلال سطح الأمامي ثم الأمبولات الأفقية. جعل شق أقرب إلى حافة ظهارة حسية ممكن من دون الاتصال عليه (الشكل 3A). ضمان عدم وجود أي قطعة من الغشاء المغطي ظهارة الحسية (الشكل 3B).
13. نقل إعداد سليمة شبه معزولة إلى غلا الصغيرةغرفة تسجيل SS-القاع مليئة L-15 وسائل الإعلام. تثقل إعداد باستخدام شبكة من ألياف النايلون غرامة تأمينها لسلك البلاتين على شكل حرف U بالارض (الشكل 3B). من الناحية المثالية، ينبغي أن ألياف من الشبكة لا علا ظهارة حسية، ولكن في بعض الحالات التي تتطلب مزيدا من الاستقرار، واحد من الألياف transecting ظهارة حسية ربما يفضل.

الشكل (3). ومعزولة إعداد شبه سليمة من دهليزي ظهارة حسية. A. تمثيل تخطيطي لإعداد شبه سليمة وتكوين قطب كهربائي. كان أمبولة تغمر العرف "دي ذات الاسطح" لفضح سطح الظهارة الحسية (الخضراء). B. صورة مجهرية من شبه سليمة إعداد 'ثالوث' تبين الأمامي (AC) والأفقي (HC) العرف (utricle حجب بehind AC). ملاحظة الألياف المستخدمة من النايلون لتأمين تمهيدا لقاعدة غرفة تسجيل. شريط مقياس: 100 ميكرون C. A القطب تسجيل المتمركزة على الفرد خلية الشعر الدهليزي. شريط النطاق: 15 ميكرون.

3. الكهربية

1. يروي إعداد شبه سليمة مع الاوكسيجين بشكل مستمر L-15 متوسطة. يحتوي على وسائل الاعلام مؤشر الرقم الهيدروجيني (أحمر الفينول) ولون متوسطة وينبغي رصد جميع أنحاء التسجيلات. الرقم الهيدروجيني مع الأكسجين يجب أن تكون 7،3-7،4 وتتوافق مع اللون الأحمر.
2. إعداد الماصات تسجيل من 1.5 مم (1.19 ملم ID) زجاج البورسليكات باستخدام بروتوكول من خطوتين (الخطوة الحرارة 1: 72؛ وخطوة الحرارة 2: 50) على مجتذب micropipette (Narishige، اليابان، نموذج PP-830) لتحقيق مقاومة النهائي من 3-4 MΩ.
3. ملء عرقوب من ماصة مع مم 3-4 من البوتاسيوم الحل الداخلي القائم على الفلورايد التي تحتوي على (مم) 110 KF، 12 بوكل، 27 KOH، 1 كلوريد الصوديوم، 10 HEPES، 10 EGTA، 1.8 MgCl _2،3 D-الجلوكوز، و2 نا ATP؛ درجة الحموضة 7.4 مع KOH.
4. التفاف عرقوب من ماصة 2-3 مرات، وكما انخفض الآن إلى تلميح ممكن بشريط رقيقة من parafilm إلى عزل القطب وتقليل السعة ماصة.
5. ضع ماصة على ظهارة حسية تحت تضخم منخفضة الطاقة (5X) على المجهر تستقيم (أوليمبوس BX51). التحول إلى الطاقة العالية (40X) وتصور الفرد خلايا الشعر الدهليزي مع كاميرا CCD المرفقة.
6. ماصة موقف على غشاء خلية الشعر تصور (الشكل 3C) باستخدام مياداة مجهرية (سوتر الآلات، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). حالما يتم التوصل إلى ختم gigaohm، تمزق غشاء الخلية مع كمية صغيرة من الضغط السلبي تطبيقها من خلال منفذ الشفط على حامل ماصة.
7. تسجيلات المشبك الجهد خلية كاملة باستخدام التقنيات القياسية ^8-9.

4. اثنين من الفوتون المجهري

1. إعداد محلول ملحي 0.9٪ تحتوي على 5 ملي أوريغون الأخضر488 BAPTA-1 (OGB-1؛ الملح hexapotassium؛ إينفيتروجن، ألمانيا).
2. في حين لا تزال مغمورة، ضع "دي ذات الاسطح" إعداد ثالوث شبه سليمة على قطعة صغيرة من ورق الترشيح (4X4 مم، 0.8 ميكرومتر سميكة؛ ميليبور، ألمانيا) ضمان أن ظهارة حسية هو دون عائق من فوق.
3. نقل ورقة الترشيح وإعداد على المالحة مغطاة قاعدة القطب البلاتين (7 ميكرولتر) من electroporator تتكون من مزيج من مولد النبض ومكبر للصوت واسعة النطاق، والغطاء مع 5 ميكرولتر مزيد من 5 ملم من محلول الكالسيوم الاصطناعية مؤشر صبغ أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1 (الشكل 4).

الشكل 4. electroporation السائبة. A. تخطيطي يبين المقطع العرضي للتكوين electroporation. يتم وضع إعداد شبه سليمة (*) على قطعة من ورق الترشيح مغمورة في الكالسيوم دانتم (ولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1) والحالية المطبقة بين 2 أقطاب البلاتين. مقتبس من Briggman ويولر، 2011 ^10.

4. جلب القطب البلاتين أعلى بالتوازي مع القطب قاعدة على مسافة حوالي 2 مم، والحرص على عدم عرقلة التوجه من إعداد عندما الاتصال مع مصنوع من ولاية أوريغون الأخضر 488 BAPTA-1 الحل.
5. تمر نبضة قصيرة الحالية عبر إعداد (معلمات للتيار؛ +13 V، 10 ميللي ثانية عرض النبضة، 1 هرتز تردد، 10 البقول مربع موجة) ^10-11.
6. في الجزء السفلي من الزجاج القاع غرفة تسجيل مليئة L-15 متوسطة، ووضع لمسة صغيرة من زيت السيليكون وموقف إعداد شبه سليمة على ذلك، وضمان مرة أخرى على أن ظهارة حسية هو دون عائق من فوق. لضمان الاستقرار في جميع أنحاء التصوير، واستبدال شبكة من النايلون على إعداد كما هو موضح أعلاه (انظر النقطة 2.13).
7. باستخدام المجهر ثنائي الفوتون جعل التسجيلات البصرية من مذكورة عفوياالنشاط الكالسيوم aneous في الظهارة الحسية (الشكل 7) باستخدام بروتوكولات التصوير القياسية ^10-11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الخصائص الكهربية للخلايا الشعر الدهليزي تعتمد على معمارية معقدة في غضون التي تضمهم ^7. يبين الشكل 5 أن إعداد ظهارة الدهليزي شبه سليمة ويمكن استخدامها للتمييز بين النوع الأول خلايا الشعر (الشكل 5A)، نوع خلايا الشعر الثاني (الشكل 5B)، والك?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد تلقى الآليات الكامنة وراء شعورنا التوازن اهتماما محدودا بالمقارنة مع النظم الحسية الأخرى، مثل نظم البصرية والسمعية. من الدراسات التي حققت تغييرات في وظيفة الدهليزي أو التوازن، وركزت معظم بشأن التدابير السلوكية بما في ذلك المنعكس الدهليزي العيني، مع معرفة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Two-photon microscope	Olympus/La Vision	BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
InstraTECH A-D converter	HEKA	ITC-18
Sutter Micromanipulator	Sutter	MP-225/M
multiclamp amplifier	Axon Instruments	700B
Data acquisition software (electrophysiology)	Axograph	N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon)	Max Planck innovation	N/A