一个孤立的半完整的上下游鼠标前庭上皮细胞电生理和高分辨率的双光子显微镜

摘要

前庭毛细胞功能分析是复杂的，最难的部分颅骨，颞骨岩部内位置较深。功能最全的毛细胞的研究已经用毛细胞急性分离。在这里，我们描述了一个半完整的小鼠前庭上皮细胞的电生理和双光子显微镜研究编制。

摘要

了解前庭毛细胞的功能在正常条件下，或外伤，疾病，老化破坏这种功能如何预防方法和/或新的治疗策略的发展是一个重要的步骤。然而，大多数看着前庭功能异常的研究还没有在细胞水平上，但主要集中在行为检测前庭功能障碍，如步态分析和前庭眼反射性能。虽然这项工作已经取得了宝贵的数据，会发生什么事情出错时，几乎没有信息搜集功能障碍的根本原因。集中在细胞和亚细胞过程背后前庭功能的研究，大部分都依赖于毛细胞急性分离的，没有他们的突触连接和支持细胞环境。因此，重大的技术挑战已经在准备访问极其敏感的前庭毛细胞aration至少打乱，生理。在这里，我们展示了一个半完整编制的鼠标前庭感觉上皮细胞，保留局部微环境，包括毛细胞/初级传入神经复合物。

引言

尽管前庭系统的重大贡献，我们的日常生活中，一个清醒的认识过程负责前庭功能明显下降，随着年龄的增长仍然是难以捉摸的。这种缺乏知识的原因之一是，在前庭功能下降，几乎完全被探索使用行为分析，包括前庭眼反射（VOR），精确的外在前庭功能的指标，但提供有限的内在因素的变化洞察。这是我们了解前庭毛细胞功能健康，疾病或衰老的一个主要障碍。

虽然已经有许多研究个别前庭毛细胞，一大缺憾一直依赖急性毛细胞制剂，其中毛细胞和从他们的正常的环境中，通过机械和/或酶处理甚至萼传入终端被删除。这种方法不可避免地BLY破坏毛细胞和花萼，毛细胞和支持细胞之间的微妙微架构。半完整的准备^1-5和鼠标一个孤立的迷宫准备⁶随着时代的发展，现在有机会学习各种形式的突触通信的条件下，更接近于体内 。事实上，林等人 （2011）表现出显着的差异，在我前庭毛细胞相比那些仍然嵌入神经 ​​上皮的全细胞电流记录急性分离型。具体而言，钾被认为积聚在细胞间隙，毛细胞和萼传入神经 ​​之间，并显着改变毛细胞响应^7。这种类型的信息将是不可能取得未经半完好无损的在前庭感觉上皮这里描述的制备。我们证明了半完整编制鼠标嵴³，显示全细胞膜片电，代表结果和双光子钙成像。

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研究方案

1。动物

1. 小鼠获得了来自澳大利亚啮齿动物中心（ARC澳大利亚珀斯）和悉尼大学博世动物设施在一个正常的12小时的光/暗周期与环境富集举行。所有的实验是由悉尼大学动物伦理委员会的批准。
2. 雄性和雌性小鼠（C57/BL6）被用于所有的实验中是常用的，因为该菌株进行遗传操作的背景，可以视为等同野生型 ^8-9。

2。组织编制

1. 准备300毫升的甘油的人工脑脊液（ACSF）组成的（以mM计）：26的NaHCO _3，11葡萄糖，250份甘油，2.5氯化钾，1.2的NaH ₂ PO _4，1.2的MgCl _{2，CaCl 2的} 2.5。在此之前加入的CaCl _2，气体卡波金（95％O ₂和5％CO _2）的解决方案，以建立应用7.4和H的，避免钙质沉淀（混浊）。冻结的溶液在-80℃的冰箱中45分钟，使冰形成浆料。
2. 深麻醉小鼠通过腹腔注射氯胺酮（100毫克/千克）（帕内尔，亚历克斯，澳大利亚）。
3. 一旦后肢捏反射消失杀头鼠标使用的是锋利的不锈钢剪刀，并用刀片（四舍五入＃22），暴露颅骨矢状切开皮肤。在这一点上和整个步骤2.3-2.8颅，脑，及相关的前庭器官应保持尽可能凉爽，由冰冷学联组织在普通的应用程序。
4. 使用标准模式剪刀尖臂（FST），加拿大北温哥华做一个小切口在颅骨的Lambda和切沿矢状缝。确保大脑不是“拖”在此步骤中的剪切刀片。
5. 小心剥离的顶骨，横向和枕骨posterio的的RLY使用，浅弯皮尔逊咬骨钳（FST）。
6. 然后，使用一个小的不锈钢刮勺轻轻抬起大脑从中间和后颅窝的表面，暴露vestibulocochlea的神经（CNVIII）内耳和脑干中的一对细的虹膜剪切的中间。切割神经初级传入和他们与毛细胞的轴突最大限度地减少不必要的紧张。
7. 第八CN横断脑全盘被删除。
8. 前庭迷路中颅窝清晰可见，与耳蜗指向前内侧。咬骨钳才轻轻抓住前半规管和横向拉切除两侧的前庭迷路。
9. 沉浸在解剖盘冰冷的，连续毒气学联第2.1节中描述的的切除迷宫（ 图1）。在立体显微镜下，按住迷宫烹调的基础上，通过抓住耳蜗。用细镊子刮去骨覆盖前半规管壶腹。一旦实现一个小洞，在骨开始滑动骨离壶腹。时应注意，不要推，通过骨钳，因为这可能会导致损坏底层膜迷路和感觉上皮。的前部和相邻的水平半圆形膜管壶腹继续 ​​执行此过程，直到露出（ 图2）。

图1。小鼠离体前庭迷路。左面板）示意图小鼠离体前庭迷路。重要的参考点访问前庭感觉上皮细胞，耳蜗，前壁，水平半规管实验室ELED。星号表示半规管壶腹的前庭感觉上皮。右面板）的显微照片，从1个月大的小鼠的孤立前庭迷路。

图2。曝光的膜前庭迷路。骨覆前水平半规管壶腹被划伤，露出黑色/ ​​棕色斑点膜壶腹及相关壶腹的神经（CNVIII）。底部面板中的示意性表示的结构中的高亮区域的显微照片，显示的关系半规管的管道壶腹和CNVIII的。

10. 用细镊子，轻轻抬起壶腹及相关囊远离骨迷路，确保中部地区壶腹（CONTA矿业感觉上皮）没有被损坏。在某些情况下，可能需要削减的半圆形的膜管与虹膜剪，以释放从骨壶腹近端部分。
11. 包含两个壶腹和囊Leibovitz的L-15培养基（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）到培养皿充满了黑社会转移。使用光纤“背光”组织。这使得感觉上皮内壶腹嵴清晰的可视化。
12. 斑点的椭圆囊的“屋脊”之称的罚款虹膜剪小心地做一个切口。屋顶的前，后水平壶腹继续通过此切口。使切口尽可能靠近边缘的感觉上皮尽可能不接触（ 图3A）。确保有膜覆盖的感觉上皮无件（ 图3B）
13. 孤立半完整的准备转移到一个小GLASL-15的媒体充满了S-有底录音室。称取下来使用网格固定的扁平的U形的铂丝（ 图3B）的细尼龙纤维编制。理想情况下，纤维的网格不应该覆盖在感觉上皮，但是在某些情况下，更多的稳定性是必需的，横切的感觉上皮可能优选的单纤维。

图3。前庭感觉上皮。示意图的半完整的准备和电极配置的分离的半完整的制备 。壶腹嵴上覆有“封顶”的感觉上皮（绿色）的表面露出半完整的'黑社会'准备前（AC）和水平（HC）嵴（囊的显微照片。掩盖是后腿交流）。注意用于录音室的基础上制备固定的尼龙纤维。比例尺：100微米。C.记录电极放置在一个单独的前庭毛细胞。比例尺：15微米。

3。电

1. 灌注的半完整的连续含氧的L-15培养基的制备。该媒体包含pH指示剂（酚红）和颜色的介质应监测整个录音。与氧的pH值应为7.3-7.4，对应的红色的颜色。
2. 从1.5毫米（1.19 mm内径）硼硅酸盐玻璃上的微量拉马（成茂，日本，PP-830型），实现了使用一个两步骤的协议（加热步骤1：72;和热步骤2：50）准备记录移液管最终3-4MΩ阻抗。
3. 填充有3-4毫米的氟化钾为基础的内部含有（以mM）110 KF，氯化钾12 27氢氧化钾，氯化钠，10 HEPES，10 EGTA，1.8 MgCl ₂的溶液的吸液管柄，3个D-葡萄糖，钠-ATP和2，pH为7.4，用KOH。
4. 包裹柄部的移液管的2-3倍，并尽可能远的前端尽可能用封口膜的细带绝缘的电极，并缩小移液器电容。
5. 吸管放置在感觉上皮一个堂堂正正的显微镜（奥林巴斯BX51）在低功率放大倍率（5倍）。切换到高功率（40X）和一个附加的CCD相机，可视个别前庭毛细胞。
6. 仓移液管上的膜用显微操纵器（萨特仪器，加利福尼亚州，美国）的可视化毛细胞（ 图3C）。一旦千兆欧姆密封件来实现，适用于通过吸液管保持器上的吸入口的负压用少量的细胞膜破裂。
7. 请使用标准的^8-9技术的全细胞电压钳记录。

4。双光子显微镜

1. 准备一个0.9％的生理盐水溶液含有5毫米俄勒冈绿488 BAPTA-1（OGB-1; hexapotassium盐; Invitrogen公司，德国）。
2. 虽然仍然淹没，放置到一小块滤纸（4X4毫米，厚0.8微米的微孔，德国），确保，感觉上皮通畅的从上面的“封顶”半完整的黑社会准备。
3. 再有5微升5mM的溶液中合成的硅酸钙转移到盐水覆盖基铂电极（7微升）的脉冲发生器和一个宽带放大器的组合构成的电穿孔，滤纸及其制备和盖指示剂染料俄勒冈绿488 BAPTA-1（ 图4）。

图4。散装电。电配置的横截面示意图。半完整的制剂（*）被放置在一张滤纸浸入DY钙E（俄勒冈绿488 BAPTA-1）和2铂电极之间施加电流。改编自Briggman和欧拉，2011年^10。

4. 在距离约2毫米的基极，带来顶级的铂电极平行小心，不要破坏的准备方向与俄勒冈绿488 BAPTA-1解决方案时。
5. 整个编制参数的电流，+13 V，10毫秒的脉冲宽度，频率1赫兹，10个方波脉冲电流脉冲通过一个简短的^10-11。
6. 在底部的玻璃有底录音室充满了L-15培养基，放置一个小的硅油和位置的半完整的制剂轻拍到它，从而也确保了感觉上皮来自上述通畅。为了确保整个成像稳定性，在准备取代尼龙网格如上所述（见2.13点）。
7. 使用双光子显微镜，光学录音自发neous Ca2 +活动的感觉上皮（ 图7），使用标准的成像协议^10-11。

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结果

前庭毛细胞的电生理特性依赖于它们所嵌入的⁷上的复杂的微体系结构。 图5示出了半完整的前庭上皮细胞的制备，可用于区分不同的我发细胞（ 图5A），II型毛细胞（ 图5B），萼初级传入神经 ​​（ 图5C），基于特征的全细胞电导。这些特性包括去极化过程中一个明显的“凹陷”和大型“崩溃”的尾电流I型毛细胞，存在暂时...

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讨论

我们平衡感的机制已经收到了有限的关注相比，与其他的感官系统， 例如视觉和听觉系统。的调查研究，在前庭平衡功能的变化，大多数都集中行为的措施，包括前庭眼反射，平衡的前庭毛细胞本身的基本构建块不完整的知识。这些研究都集中在毛细胞几乎每年都这样做急性分离的毛细胞，从他​​们的家乡环境中删除。在这篇文章中，我们展示了一个半完整编制的鼠标前庭感觉上皮细胞...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Two-photon microscope	Olympus/La Vision	BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
InstraTECH A-D converter	HEKA	ITC-18
Sutter Micromanipulator	Sutter	MP-225/M
multiclamp amplifier	Axon Instruments	700B
Data acquisition software (electrophysiology)	Axograph	N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon)	Max Planck innovation	N/A