Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Zusammenfassung

Analyse der vestibulären Haarzellen Funktion wird durch ihre Lage tief innerhalb der schwierigste Teil des Schädels, der Felsenbein kompliziert. Die meisten funktionalen Haarzellen Studien haben akut isolierten Haarzellen verwendet. Hier beschreiben wir eine semi-intakten Herstellung von Maus vestibulären Epithel für elektrophysiologische und Zwei-Photonen-Mikroskopie Studien.

Zusammenfassung

Verstehen vestibulären Haarzellen funktionieren unter normalen Bedingungen, oder wie Trauma, Krankheit und Altern stören diese Funktion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von präventiven Ansätze und / oder neue therapeutische Strategien. Allerdings haben die meisten Studien, die abnormale vestibulären Funktion nicht auf der zellulären Ebene gewesen, aber konzentrierte sich hauptsächlich auf Verhaltens-Assays Vestibularisausfall wie Ganganalysen und vestibulookulären Reflex Leistung. Während diese Arbeit wertvolle Daten über das, was passiert, wenn etwas schief geht ergeben hat, ist nur wenig Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Funktionsstörung aufgelesen. Von den Studien, dass auf der zellulären und subzellulären Prozessen, die Vestibularfunktion zugrunde zu konzentrieren, haben die meisten auf akut isolierten Haarzellen, ohne ihre synaptischen Verbindungen und Unterstützung Zellumgebung verlassen. Daher ist eine große technische Herausforderung gewesen Zugriff auf die außerordentlich empfindlich vestibulären Haarzellen in einem prepTrennung, die am wenigsten gestört, physiologisch. Hier zeigen wir eine semi-intakten Präparat der Maus vestibulären Sinnesepithel, die die lokale Mikroumgebung behält einschließlich Haarzellen / primären afferenten Komplexe.

Einleitung

Trotz der bedeutenden Beitrag des vestibulären Systems zu unserem täglichen Leben, bleiben ein klares Verständnis der Prozesse, die für die beobachtete Abnahme in vestibulären Funktion mit dem Alter schwer zu fassen. Ein Grund für diesen Mangel an Wissen ist, dass Rückgang der vestibulären Funktion hat fast ausschließlich erforscht mit Verhaltensstörungen Assays, einschließlich der vestibulookulären Reflex (VOR), eine genaue Anzeige der extrinsische vestibulären Funktion, sondern bietet nur begrenzten Einblick in die Veränderungen der intrinsischen Komponenten . Dies ist ein wesentliches Hindernis für unser Verständnis der vestibulären Haarzellen Funktion in Gesundheit, Krankheit oder Alterung.

Zwar gibt es viele Studien einzelner vestibulären Haarzellen wurde ein entscheidender Nachteil war die Abhängigkeit von akuten Haarzellen Zubereitungen, in denen Haarzellen und sogar Kelch afferenten Terminals aus ihrer normalen Umgebung über mechanische und / oder enzymatische Behandlung entfernt werden. Solche Ansätze zwangsBly stören das empfindliche Mikroarchitektur zwischen Haarzellen und Kelch und Haarzellen und Stützzellen. Mit der Entwicklung von semi-intakten Präparate ^1-5 und einem isolierten Maus Labyrinth Zubereitung ^6, gibt es jetzt eine Möglichkeit, die verschiedenen Formen der synaptischen Kommunikation unter den Bedingungen, die stärker die in vivo ähneln studieren. Tatsächlich zeigte Lim et al. (2011) deutliche Unterschiede in ganzen Zellen Ströme von akut isoliert Typ I aufgezeichnet vestibulären Haarzellen zu denen, die eingebettet in die Neuroepithel blieb verglichen. Insbesondere wird angenommen, dass Kalium in den interzellulären Raum ansammeln, zwischen den Haarzellen und Kelch afferenten und signifikant verändern Haar-Zell-Antwort ^7. Diese Art von Informationen wäre unmöglich, ohne die semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel hier beschriebenen zu erhalten. Wir zeigen die semi-intakten Präparat der Maus crista ³Und zeigen repräsentative Ergebnisse von whole-cell Patch Elektrophysiologie erhalten und Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging.

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Protokoll

1. Tiere

1. Die Mäuse wurden von der australischen Nagetier Centre (ARC; Perth, Australien) gewonnen und gehalten an der Universität von Sydney Bosch Tierlabor auf einem normalen 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit ökologischen Bereicherung. Alle beschriebenen Experimente wurden von der University of Sydney Tier Ethikkommission genehmigt.
2. Männliche und weibliche Mäuse (C57/Bl6) wurden für alle Experimente verwendet werden, da dieser Stamm häufig als Hintergrund für genetische Manipulation verwendet werden, und kann als äquivalent zu ^8-9 Wildtyp werden.

2. Tissue Vorbereitung

1. Bereiten 300 ml eines Glycerin-Basis künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), bestehend aus (in mM): 26 NaHCO _3, 11 Glucose, 250 Glycerin, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 1,2 MgCl _2, CaCl ₂ und 2,5. Vor der Zugabe von CaCl _2, Gas die Lösung mit Carbogen (95% O ₂ und 5% CO _2), um festzustellen, apH von 7,4 und vermeiden Calciumpräzipitation (Bewölkung). Einfrieren der Lösung in einem -80 ° C-Gefrierschrank für 45 min, so daß eine Ice-Slurry gebildet wird.
2. Tief betäuben Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australien) über eine intraperitoneale Injektion.
3. Sobald Hinterbeine Extremität Prise Reflexe fehlen decapitate Mäusen mit scharfen Schere aus rostfreiem Stahl und eine sagittalen Hautschnitt mit einer Rasierklinge (gerundet # 22), um den Schädel freizulegen. An dieser Stelle und in Schritten von 2,3 bis 2,8 die Schädelhöhle, Gehirn, und die zugrunde liegenden Vestibularapparat sollte so kühl wie möglich durch die regelmäßige Anwendung von eiskaltem ACSF über das Gewebe gehalten werden.
4. Mit dem spitzen Arm Standard Muster Schere (FST, North Vancouver, Kanada) machen einen kleinen Schnitt in den Schädel bei Lambda und entlang der Sagittalnaht. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn nicht "gezogen" durch die Schermesser bei diesem Schritt.
5. Vorsichtig schälen Scheitelbeine weg seitlich und Os occipitale posteriorly mit flachen Kurve Pearson rongeurs (FST).
6. Eine kleine Spatel aus rostfreiem Stahl wird dann verwendet, um heben das Gehirn von der Oberfläche des mittleren und hinteren Schädelgrube, und die freigelegte vestibulocochlea Nerven (CNVIII) schneiden in der Mitte zwischen dem Innenohr und Hirnstamm mit einer feinen Schere Iris. Schneiden diesen Nerv minimiert unnötige Spannung auf Axone der Primärafferens und deren Verbindungen mit Haarzellen.
7. Nach Durchtrennung des CN VIII wird das Gehirn in toto entfernt.
8. Die vestibuläre Labyrinth ist jetzt deutlich sichtbar in der mittleren Schädelgrube, mit dem Cochlea zeigt anteromedial. Rongeur beiden Seiten des vestibulären Labyrinth vor sanft Ausschneiden durch Ergreifen des vorderen Bogengang und Ziehen seitlich.
9. Tauchen Sie die ausgeschnitten Labyrinthe (Abbildung 1) in einem Seziertisch Schale mit den eiskalten, kontinuierlich vergast ACSF in Abschnitt 2.1 beschrieben. Unter einem Stereomikroskop, halten das Labyrinth zuder Boden der Schale durch Ergreifen des Cochlea. Verwenden feinen Pinzette entfernt zu kratzen an der Knochen über der vorderen Bogengang Ampulle. Sobald ein kleines Loch in den Knochen erreicht beginnen Fingern an die Knochen von der Ampulle. Vorsicht ist geboten, nicht auf die Zange durch den Knochen drücken, da dies Schäden an der zugrunde liegenden häutigen Labyrinths und Sinnesepithel verursachen kann. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sowohl die Front-und benachbarten horizontalen halbkreisförmigen häutige Kanäle und Ampullen ausgesetzt sind (Abbildung 2).

Abbildung 1. Die isolierten Maus vestibulären Labyrinth. A. Links) Schematische Darstellung der isolierten Maus vestibulären Labyrinth. Wichtige Bezugspunkte für den Zugriff auf den vestibulären Sinnesepithel sind die Cochlea, vordere und horizontalen Bogengänge Laboreled. Sternchen zeigen den Bogengang Ampulle mit dem vestibulären Sinnesepithel. B. Rechts) Photomicrograph des isolierten vestibulären Labyrinth aus einem 1-Monate alten Maus.

Abbildung 2. Die Exposition der Membranöse vestibulären Labyrinth. Die Knochen über der vorderen und horizontalen Bogengang Ampullen wurden entfernt, um die schwarz / braun gesprenkelte membranöse Ampullen und zugehörige ampullären Nerven (CNVIII) offenbaren zerkratzt. Das Schema in der unteren Platte stellt die Strukturen in den hervorgehobenen Bereich der Mikroaufnahme und zeigt die Beziehung der halbkreisförmigen Kanal Kanäle der Ampullen und CNVIII.

10. Mit feinen Pinzette vorsichtig heben Sie die Ampullen und zugehörige utricle vom knöchernen Labyrinth, um sicherzustellen, dass der zentrale Bereich der Ampullen (Contaligt ist, das sensorische Epithel) nicht beschädigt wird. In einigen Fällen kann der proximale Teil des halbkreisförmigen membranöse Kanal müssen möglicherweise mit Iris Schere geschnitten werden, um die Ampulle aus dem Knochen zu lösen.
11. Übertragen Sie die Triade, die beiden Ampullen und utricle in eine Petrischale mit Leibovitz L-15 Kulturmedium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gefüllt. Verwenden Sie ein Glasfaserkabel zu "Hintergrundbeleuchtung" das Gewebe. Dies ermöglicht die übersichtliche Visualisierung der Crista, die das sensorische Epithel innerhalb der Ampullen.
12. Vorsichtig einen Einschnitt in der gesprenkelten "Dach" der utricle mit den feinen Iris Schere. Setzen Sie diesen Einschnitt durch das Dach des vorderen und dann die horizontale Ampullen. Als den Einschnitt so nahe an der Kante des sensorischen Epithels möglichst ohne sie zu berühren (Fig. 3A). Stellen Sie sicher, dass es keine Stücke von Membran über der Sinnesepithel (3B)
13. Übertragen Sie die isolierten halb intakt Vorbereitung zu einem kleinen Glass-Boden Aufnahme Kammer mit L-15 Medien gefüllt. Belasten die Herstellung mit einem Raster aus feinen Nylonfasern, die an einem abgeflachten U-förmigen Platindraht (3B). Idealerweise werden die Fasern des Gitters nicht überlagern Sinnesepithel jedoch in einigen Fällen, in denen mehr Stabilität erforderlich ist, eine einzelne Faser Durchschneiden Sinnesepithel vielleicht bevorzugt.

Abbildung 3. Die isolierte semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel. A. Schematische Darstellung der semi-intakten Vorbereitung und Elektroden-Konfiguration. Die Ampulle über der Crista wurde "de-Dach", um die Oberfläche des Sinnesepithel (grün) freizulegen. B. Photomicrograph der semi-intakten 'Dreiklang' Vorbereitung zeigt die vordere (ac) und horizontalen (hc) Crista (utricle verdecktHinterbeine ac). Beachten Sie die Nylonfaser verwendet werden, um die Herstellung der Basis der Aufnahme Kammer zu sichern. Maßstab:. 100 um C. Eine Aufnahme Elektrode auf einem einzelnen vestibulären Haarzellen positioniert. Maßstab: 15 um.

3. Elektrophysiologie

1. Perfundieren die semi-intakten Präparat mit kontinuierlich Sauerstoff L-15-Medium. Der Datenträger enthält einen pH-Indikator (Phenolrot) und die Farbe des Mediums sollte in den Aufnahmen überwacht werden. Der pH-Wert mit Sauerstoff sollte 7,3-7,4 sein und entsprechen einer roten Farbe.
2. Bereiten Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilikatglas mit einem Zwei-Schritt-Protokoll (Wärme Stufe 1: 72, und Wärme Schritt 2: 50) auf einem Feinpipettenziehvorrichtung (Narishige, Japan, Modell PP-830), um ein zu erreichen endgültige Impedanz von 3-4 MOhm.
3. Füllen Sie den Schaft der Pipette mit 3-4 mm Kaliumfluorid-basierte interne Lösung, die (in mm) 110 KF, KCl 12, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl _2,3 D-Glukose und 2 Na-ATP, pH 7,4 mit KOH.
4. Wickeln der Schaft der Pipette 2-3 mal und bis zur Spitze wie möglich mit einer dünnen Parafilm, um die Elektrode zu isolieren und zu reduzieren Pipette Kapazität.
5. Positionieren Sie die Pipette über die Sinnesepithel unter Low-Power-Vergrößerung (5X) auf einem aufrechten Mikroskop (Olympus BX51). Wechseln Sie zu hohe Leistung (40X) und visualisieren einzelnen vestibulären Haarzellen mit einem angeschlossenen CCD-Kamera.
6. Position Pipette an der Membran eines visualisierten Haarzellen (3C) mit einem Mikromanipulator (Sutter Instruments, Kalifornien, USA). Sobald ein Gigaohm Dichtung erreicht, Bruch der Zellmembran mit einer kleinen Menge von Unterdruck durch eine Saugöffnung auf der Pipettenhalter aufgebracht.
7. Machen whole-cell voltage clamp Aufnahmen unter Verwendung von Standardverfahren ^8-9.

4. Zwei-Photonen-Mikroskopie

1. Vorbereiten einer 0,9% igen Kochsalzlösung, enthaltend 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB 1-; hexakaliumsalz; Invitrogen, Deutschland).
2. Während noch unter Wasser, legen Sie die "de-Dach" semi-intakten Dreiklang Vorbereitung auf ein kleines Stück Filterpapier (4x4 mm, 0,8 um dick, Millipore, Deutschland) sicherzustellen, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist.
3. Das Filterpapier und Vorbereitung auf die Salzlösung bedeckt Basis Platinelektrode (7 ul) eines Elektroporators bestehend aus der Kombination von einem Impulsgeber und einem breitbandigen Verstärker, und die Abdeckung mit weiteren 5 ul 5 mM Lösung des synthetischen Calcium Indikator-Farbstoff Oregon Green 488 BAPTA-1 (Abbildung 4).

Abbildung 4. Masse Elektroporation. A. schematische Darstellung Querschnitt Elektroporation Konfiguration. Der semi-intakten Zubereitung (*) auf einem Stück Filterpapier in Calcium dy eingetaucht platzierte (Oregon Green 488 BAPTA-1) und Strom zwischen 2 Platin-Elektroden aufgebracht. Adaptiert von Briggman und Euler, 2011 ^10.

4. Bringen Sie die obere Platinelektrode parallel mit der Basis-Elektrode in einem Abstand von etwa 2 mm, darauf achten, daß die Ausrichtung der Vorbereitung stören, wenn sie mit der Oregon Green 488 BAPTA-1-Lösung wird zu kontaktieren.
5. Übergeben Sie einen kurzen Stromimpuls in der Zubereitung (Parameter für den aktuellen, +13 V, 10 ms Impulsbreite, Frequenz 1 Hz, 10 Rechteckpulse) ^10-11.
6. Auf dem Boden einer Glasboden Aufnahme Kammer mit L-15-Medium gefüllt ist, legen Sie einen kleinen Klecks Silikonöl und Position der semi-intakten Vorbereitung auf sie, wieder dafür, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist. Um Stabilität in Bildgebung zu gewährleisten, ersetzen Sie die Nylon-Gitter über die Zubereitung wie oben beschrieben (siehe Punkt 2.13).
7. Mit der Zwei-Photonen-Mikroskop machen optischen Aufnahmen spontanneous Calcium Aktivität im sensorischen Epithel (Abbildung 7) mit Standard Bildgebungsprotokolle ^10-11.

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Ergebnisse

Die elektrophysiologischen Eigenschaften des vestibulären Haarzellen sind abhängig von der komplexen microarchitecture ^7, in dem sie eingebettet sind. 5 zeigt, dass die semi-intakten Epithel vestibulären Herstellung verwendet werden, um zwischen Typs unterschieden werden können I Haarzellen (5A), Typ II Haarzellen (5B), und der Kelch primären afferenten (5C) auf der Grundlage charakteristische Ganzzell Leitwerte. Diese Merkmale beinhalte...

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Diskussion

Die zugrunde liegenden Mechanismen unseren Gleichgewichtssinn haben begrenzte Aufmerksamkeit im Vergleich mit anderen sensorischen Systemen erhalten, z. B. die visuelle und auditive Systeme. Von den Studien, die Veränderungen in der vestibulären oder Balance-Funktion untersucht haben, haben die meisten auf verhaltensorientierten Maßnahmen einschließlich der vestibulookulären Reflex konzentriert, mit unvollständigen Kenntnis der fundamentalen Bausteine ​​der Balance-den vestibulären Haarzellen sich. D...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Two-photon microscope	Olympus/La Vision	BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
InstraTECH A-D converter	HEKA	ITC-18
Sutter Micromanipulator	Sutter	MP-225/M
multiclamp amplifier	Axon Instruments	700B
Data acquisition software (electrophysiology)	Axograph	N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon)	Max Planck innovation	N/A