Une préparation semi-intact d'isolement de la souris vestibulaire épithélium sensoriel pour électrophysiologie et haute résolution microscopie à deux photons

Résumé

Analyse de la fonction des cellules ciliées vestibulaires est compliquée par leur localisation profonde dans la partie la plus difficile du crâne, l'os temporal rocher. La plupart des études sur les cellules capillaires fonctionnels ont utilisé intensément les cellules ciliées isolées. Nous décrivons ici une préparation semi-intactes de souris épithélium vestibulaire pour les études de microscopie électrophysiologiques et à deux photons.

Résumé

Comprendre les cellules ciliées vestibulaires fonctionnent dans des conditions normales, ou comment un traumatisme, la maladie et le vieillissement perturber cette fonction est une étape essentielle dans le développement d'approches préventives et / ou de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, la majorité des études portant sur la fonction vestibulaire anormal n'ont pas été au niveau cellulaire mais porté principalement sur des analyses comportementales des troubles vestibulaires telles que les analyses de la marche et de la performance réflexe vestibulo-oculaire. Bien que ce travail a donné de précieuses informations sur ce qui se passe quand les choses vont mal, peu d'informations ont été glanées sur les causes sous-jacentes de dysfonctionnement. Parmi les études qui se concentrent sur les processus cellulaires et sous-cellulaires qui sous-tendent la fonction vestibulaire, la plupart ont invoqué aiguë cellules ciliées isolés, dépourvus de leurs connexions synaptiques et de l'environnement de la cellule d'appui. Par conséquent, un défi technique majeur a été l'accès aux cellules ciliées vestibulaires extrêmement sensible dans un preparation qui est moins perturbé, physiologiquement. Ici, nous démontrons une préparation semi-intactes de la souris épithélium vestibulaire sensoriel qui conserve le micro-environnement local, y compris des cellules ciliées / complexes afférentes primaires.

Introduction

Malgré l'importante contribution du système vestibulaire de notre vie quotidienne, une bonne compréhension des processus responsables de la baisse observée dans la fonction vestibulaire avec l'âge reste insaisissable. Une des raisons de ce manque de connaissances est que le déclin de la fonction vestibulaire a presque exclusivement été explorée en utilisant des tests comportementaux, y compris le réflexe vestibulo-oculaire (VOR), un indicateur précis de la fonction vestibulaire extrinsèque, mais donne un aperçu limité dans les changements de composantes intrinsèques . Il s'agit d'un obstacle majeur à notre compréhension de la fonction des cellules ciliées vestibulaires dans la santé, la maladie ou le vieillissement.

Même s'il ya eu de nombreuses études sur les cellules ciliées vestibulaires individuels, une lacune majeure a été le recours à des préparations de cellules de cheveux courte durée, où les cellules ciliées et les terminaisons afférentes même calice sont retirés de leur environnement normal via un traitement mécanique et / ou enzymatique. Approches telles inéviBly perturber la microarchitecture délicat entre cellules ciliées et le calice, et les cheveux cellule et la cellule de soutien. Avec le développement de préparations semi-intactes ^1-5, et une souris préparation du labyrinthe isolé ^6, il ya maintenant une occasion d'étudier les différentes formes de communication synaptique dans des conditions qui ressemblent davantage à celles in vivo. En effet, Lim et al. (2011) ont montré des différences marquées dans les courants de cellules entières enregistrées à partir du type aigu isolé je cellules ciliées vestibulaires rapport à ceux qui sont restés ancrés dans le neuroépithélium. Plus précisément, le potassium est pensé pour s'accumuler dans l'espace intercellulaire, entre la cellule de cheveux et le calice afférente, et modifie considérablement la réponse des cellules de cheveux ^7. Ce type d'information serait impossible à obtenir sans la préparation semi-intact de l'épithélium vestibulaire sensoriel décrit ici. Nous démontrons la préparation semi-intactes de la crête souris ³Et montrer des résultats représentatifs obtenus à partir de cellules entières correctif électrophysiologie et d'imagerie calcique biphotonique.

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Protocole

1. Animaux

1. Les souris ont été obtenues auprès du Centre de rongeurs australien (ARC; Perth, Australie) et a tenu à l'Université de Sydney Bosch Animalerie une lumière / obscurité cycle normal de 12 heures à l'enrichissement de l'environnement. Toutes les expériences décrites ont été approuvées par l'Université de Sydney Comité d'éthique animale.
2. Des souris mâles et femelles (C57/BL6) ont été utilisés pour toutes les expériences depuis cette souche sont couramment utilisés comme arrière-plan pour la manipulation génétique, et peuvent être considérées comme équivalentes au type sauvage ^8-9.

2. Préparation des tissus

1. Préparer 300 ml d'un fluide à base de glycérol artificielle céphalorachidien (ACSF) constitué de (en mM): 26 NaHCO _3, 11 le glucose, le glycérol 250, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 1,2 _MgCl2 et _CaCl2 2,5. Avant l'addition de CaCl _2, le gaz de la solution avec carbogène (95% O ₂ et 5% de CO ₂₎ pour établir apH de 7,4 et éviter la précipitation de calcium (nébulosité). Congeler la solution dans un congélateur à -80 ° C pendant 45 minutes de telle sorte qu'un coulis de glace est formée.
2. Profondément anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg / kg) (Parnell, Alexandrie, Australie) via une injection intra-péritonéale.
3. Une fois les réflexes de pincement des membres postérieurs sont des souris de décapiter absents utilisant pointus ciseaux en acier inoxydable et de faire une incision sagittale de la peau avec une lame de rasoir (arrondi n ° 22) pour exposer le crâne. A ce stade et dans les étapes 2.3-2.8 la voûte crânienne, le cerveau, et l'appareil vestibulaire sous-jacente doivent être aussi frais que possible par l'application régulière de ACSF glacée sur le tissu.
4. En utilisant le bras de ciseaux pointus de modèle standard (FST, North Vancouver, Canada) faire une petite incision dans le crâne à Lambda et couper le long de la suture sagittale. Assurez-vous que le cerveau n'est pas «traîné» par la lame de cisaillement lors de cette étape.
5. Retirer délicatement les os pariétaux loin latéralement et l'os occipital posteriorly avec une faible courbure Pearson rongeurs (FST).
6. Une petite spatule en acier inoxydable est ensuite utilisé pour soulever légèrement le cerveau de la surface de la fosse crânienne médiane et postérieure, et le nerf vestibulocochlea exposée (CNVIII) coupée à mi-chemin entre l'oreille interne et le tronc avec une paire de ciseaux iris fines. Couper ce nerf minimise tension indue sur les axones des afférences primaires et leurs connexions avec les cellules ciliées.
7. Après la section transversale du CN VIII le cerveau est prélevé dans sa totalité.
8. Le labyrinthe vestibulaire est maintenant clairement visible dans la fosse cérébrale moyenne, avec la cochlée pointant anteromedially. Rongeur de chaque côté du labyrinthe vestibulaire avant exciser doucement en saisissant le canal semi-circulaire antérieur et en tirant latéralement.
9. Plonger les labyrinthes excisées (figure 1) dans un plat contenant la dissection glacée, ACSF gazés en continu décrit dans la section 2.1. En vertu d'une loupe binoculaire, maintenez le labyrinthe dele fond de la coupelle par préhension de la cochlée. Utilisez une pince fine à gratter à l'os recouvrant l'ampoule du canal semi-circulaire antérieur. Une fois un petit trou dans l'os est atteint commencer à feuilleter l'os loin de l'ampoule. Il faut faire attention à ne pas pousser la pince à travers l'os, car cela peut endommager le labyrinthe membraneux sous-jacente et de l'épithélium sensoriel. Continuez cette procédure jusqu'à ce que les deux la partie antérieure et conduits semi-circulaires membraneux horizontales adjacentes et ampoules sont exposés (figure 2).

Figure 1. La souris labyrinthe vestibulaire isolée. A. Le panneau de gauche) Représentation schématique de la souris labyrinthe vestibulaire isolée. Points de référence importants pour accéder à l'épithélium vestibulaire sensoriel, la cochlée, antérieure et horizontal canaux semi-circulaires sont labofirent du. Les astérisques indiquent l'ampoule du canal semi-circulaire contenant l'épithélium vestibulaire sensoriel. B. Panneau de droite) Photomicrograph du labyrinthe vestibulaire isolée à partir d'une souris 1-month-old.

Figure 2. L'exposition du labyrinthe vestibulaire membraneux. L'os recouvrant les ampoules des canaux semi-circulaire antérieure et horizontales ont été rayés pour révéler les ampoules membraneux noir / brun moucheté et les nerfs ampullaires associés (CNVIII). Le schéma dans le panneau du bas représente les structures dans la région en surbrillance de la microphotographie et montre la relation entre les conduits de canal semi-circulaire pour les ampoules et CNVIII.

10. En utilisant des pinces fines, soulevez doucement les ampoules et utricle associé loin du labyrinthe osseux, veiller à ce que la région centrale de la ampoules (containing l'épithélium sensoriel) ne soit pas endommagé. Dans certains cas, la partie proximale du canal semi-circulaire membraneux peut être nécessaire de couper avec des ciseaux iris pour libérer les ampoules de l'os.
11. Transférer la triade contenant deux ampoules et utricle dans une boîte de Pétri remplie avec-15 L de milieu de culture de Leibovitz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Utilisez une fibre optique à "backlight" le tissu. Cela permet une visualisation claire de la crête contenant l'épithélium sensoriel dans le ampoules.
12. Faites une nouvelle incision dans le "toit" moucheté de l'utricule avec les ciseaux iris fines. Poursuivre cette incision à travers le toit de la partie antérieure, puis les ampoules horizontales. Réaliser l'incision la plus proche du bord de l'épithélium sensoriel que possible, sans mise en contact (figure 3A). S'assurer qu'il n'y a pas de morceaux de membrane recouvrant l'épithélium sensoriel (figure 3B)
13. Transférer la préparation intacte semi-isolé pour un petit verrechambre d'enregistrement S-fond rempli de L-15 des médias. Peser la préparation à l'aide d'une grille de fibres de nylon fines fixées à un fil de platine en forme de U aplati (figure 3B). Idéalement, les fibres de la grille ne doivent pas recouvrir l'épithélium sensoriel, cependant, dans certains cas où une plus grande stabilité est requise, une seule fibre sectionnant l'épithélium sensoriel peut-être préféré.

Figure 3. La préparation semi-intactes isolées de l'épithélium. A. Représentation schématique sensorielle vestibulaire de la préparation semi-intacte et de la configuration d'électrode. L'ampoule recouvrant la crête a été «dé-couverte" pour exposer la surface de l'épithélium sensoriel (vert). B. Photomicrograph de la préparation semi-intactes «triade» montrant la partie antérieure (AC) et horizontale (hc) Crista (utricle obscurci êtrehind ac). Noter la fibre de nylon utilisée pour fixer la préparation de la base de la chambre d'enregistrement. Barre d'échelle:. 100 um C. Une électrode d'enregistrement placé sur une cellule de cheveux vestibulaire individu. Barre d'échelle: 15 um.

3. Électrophysiologie

1. Perfuser la préparation semi-intact avec oxygéné en permanence milieu L-15. Le support contient un indicateur de pH (rouge de phénol) et la couleur du milieu doit être surveillée pendant les enregistrements. Le pH avec de l'oxygène doit être 7.3 à 7.4 et correspondent à une couleur rouge.
2. Préparer pipettes d'enregistrement de 1,5 mm (1,19 mm de diamètre) en verre borosilicate en utilisant un protocole en deux étapes (étape de chaleur 1: 72, et l'étape de chaleur 2: 50) sur un extracteur micropipette (Narishige, le Japon, le modèle PP-830) pour atteindre un impédance finale de 3-4 MQ.
3. Remplir la tige de la pipette à 3-4 mm de la solution interne à base de fluorure de potassium contenant (en mM) 110 KF, KCl 12, 27 KOH, NaCl 1, HEPES 10, EGTA 10, 1.8 de _MgCl2,3 D-glucose et 2-Na ATP; pH 7,4 avec KOH.
4. Enrouler la tige de la pipette et 3.2 fois aussi loin de la pointe que possible avec une mince bande de parafilm pour isoler l'électrode et de réduire la capacité de la pipette.
5. Placez la pipette sur l'épithélium sensoriel à faible grossissement de puissance (5X) sur un microscope droit (Olympus BX51). Passer à haute puissance (40X) et de visualiser les cellules ciliées vestibulaires individuels avec une caméra CCD ci-joint.
6. pipette de position sur la membrane d'une cellule de cheveux visualisées (figure 3C) à l'aide d'un micromanipulateur (Sutter Instruments, Californie, USA). Une fois un joint d'étanchéité gigaohm soit atteint, la rupture de la membrane cellulaire avec une petite quantité de pression négative appliquée à travers un orifice d'aspiration sur le porte-pipette.
7. Faire des enregistrements de serrage de tension de cellules entières en utilisant des techniques standard ^8-9.

4. Microscopie à deux photons

1. Préparer une solution saline à 0,9% contenant 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB-1; sel hexapotassique; Invitrogen, Allemagne).
2. Alors qu'il était encore submergée, placez le «dé-couverte" préparation de triade semi-intactes sur un petit morceau de papier filtre (4x4 mm, 0,8 um d'épaisseur, Millipore, Allemagne) veiller à ce que l'épithélium sensoriel est dégagée par le haut.
3. Transférer le papier filtre et de la préparation sur le couvert électrode de platine de base et une solution saline (7 pi) d'un électroporateur consistant en la combinaison d'un générateur d'impulsions et d'un amplificateur à large bande, et le couvercle avec un autre 5 ul de solution à 5 mM de calcium synthétique indicateur colorant Oregon Green 488 BAPTA-1 (figure 4).

Figure 4. Électroporation vrac. A. section de configuration d'électroporation schématique. La préparation semi-intacte (*) est placé sur une feuille de papier filtre immergé dans dy de calciume (Oregon Green 488 BAPTA-1) et le courant appliqué entre les deux électrodes de platine. Adapté de Briggman et Euler 2011 ^10.

4. Apportez le haut électrode de platine parallèle avec l'électrode de base à une distance d'environ 2 mm, en prenant soin de ne pas perturber l'orientation de la préparation lorsque le contact avec le Green 488 BAPTA-1 solution Oregon est faite.
5. Passez une brève impulsion de courant à travers la préparation (Paramètres pour le courant, +13 V, 10 msec largeur d'impulsion, fréquence de 1 Hz, 10 impulsions rectangulaires) ^10-11.
6. Sur le fond d'une chambre d'enregistrement à fond de verre rempli de milieu L-15, placez une petite goutte d'huile de silicone et la position de la préparation semi-intact sur elle, assurant à nouveau que l'épithélium sensoriel est dégagée par le haut. Pour assurer la stabilité tout au long de l'imagerie, remplacez la grille de nylon sur la préparation comme décrit ci-dessus (voir point 2.13).
7. Utilisation du microscope à deux photons faire des enregistrements optiques de sponactivité de calcium tanée dans l'épithélium sensoriel (figure 7) en utilisant les protocoles classiques d'imagerie ^10-11.

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Résultats

Les propriétés électrophysiologiques des cellules ciliées vestibulaires sont tributaires de la microarchitecture complexe dans lequel ils sont intégrés ^7. Figure 5 montre que la préparation de l'épithélium vestibulaire semi-intactes peut être utilisé pour différencier type I cellules ciliées (figure 5A), les cellules ciliées de type II (figure 5B), et le calice primaire afférente (figure 5C) sur la base de conductances de c...

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Discussion

Les mécanismes qui sous-tendent notre sens de l'équilibre ont reçu une attention limitée en comparaison avec d'autres systèmes sensoriels, par exemple, les systèmes visuels et auditifs. Parmi les études qui ont examiné les changements dans la fonction vestibulaire ou de l'équilibre, la plupart ont mis l'accent sur des mesures comportementales, y compris le réflexe vestibulo-oculaire, avec une connaissance incomplète des composantes fondamentales de-la balance cellules ciliées vestibu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Two-photon microscope	Olympus/La Vision	BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
InstraTECH A-D converter	HEKA	ITC-18
Sutter Micromanipulator	Sutter	MP-225/M
multiclamp amplifier	Axon Instruments	700B
Data acquisition software (electrophysiology)	Axograph	N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon)	Max Planck innovation	N/A