Изолированные Semi-нетронутыми Подготовка Мышь вестибулярного сенсорного эпителия электрофизиологии и высоким разрешением двухфотонной микроскопии

Резюме

Анализ вестибулярной функции волосковых клеток осложняется их расположения в глубине трудная часть черепа, височной кости височной кости. Большинство функциональных исследований волосковых клеток использовали остро изолированных клеток волос. Здесь мы опишем полу-нетронутыми подготовку вестибулярного эпителия мыши для электрофизиологических и двухфотонного микроскопических исследований.

Аннотация

Понимание вестибулярных волосковых клеток функционировать в нормальных условиях, или как травмы, болезни и старение нарушить эту функцию является жизненно важным шагом в развитии профилактических подходов и / или новых терапевтических стратегий. Тем не менее, большинство исследований, глядя на ненормального вестибулярной функции не были на клеточном уровне, но сосредоточены главным образом на анализе поведенческих вестибулярной дисфункции, такие как исследования походки и вестибулоокулярный рефлекс производительности. Хотя эта работа дала ценные данные о том, что происходит, когда что-то идет не так, мало информации о почерпнуть основные причины дисфункции. Из исследований, которые сосредоточены на клеточных и субклеточных процессов, лежащих в основе функционирования вестибулярного аппарата, большинство из них полагаются на остро изолированы волосковые клетки, лишенные своих синаптических связей и поддержки клеточного окружения. Таким образом, основной технической проблемой был доступ к чрезвычайно чувствительны вестибулярных волосковых клеток в подготовительнуютовка, в наименьшей степени нарушен, физиологически. Здесь мы показываем, полу-нетронутыми подготовке мыши вестибулярного сенсорного эпителия, который сохраняет местных микро-среды, включая клетки волос / первичных афферентных комплексов.

Введение

Несмотря на значительный вклад вестибулярной системы в нашей повседневной жизни, четкое понимание процессов, ответственных за наблюдаемое снижение вестибулярной функции с возрастом остаются неизвестными. Одна из причин этого отсутствие знаний является то, что снижение вестибулярной функции почти исключительно были изучать с помощью поведенческого анализа, в том числе вестибулоокулярный рефлекс (VOR), точным индикатором внешней вестибулярной функции, но предоставляет ограниченную способность проникновения в суть изменений собственных компонентов . Это является основным препятствием для нашего понимания вестибулярной функции волосковых клеток в области здравоохранения, болезни, или старения.

В то время было много исследований индивидуальных вестибулярных волосковых клеток, одним из основных недостатков была опора на острые волосы клеточных препаратов, где волосковые клетки и даже чашечки афферентных терминалов удаляются из своей нормальной среде с помощью механических и / или ферментативной обработки. Такие подходы неизбежностиБлай нарушить тонкое микроархитектуры между волосковых клеток и чашечки, и волосковых клеток и поддерживающих клетки. С развитием полу-нетронутыми препараты ^1-5 и изолированном препарате лабиринт мыши ^6, в настоящее время возможность изучить различные формы синаптические связи в условиях, которые больше напоминают те, в естественных условиях. Действительно, Лим и др.. (2011) показали заметные различия в целом токи ячейки записывается с остро изолированный типа я вестибулярных волосковых клеток по сравнению с теми, что остались встроенные в нейроэпителии. В частности, калий, как полагают, накапливаются в межклеточном пространстве между волосковых клеток и чашечки афферентных и значительно изменить волосы клеточный ответ ^7. Этот тип информации было бы невозможно получить без полу-нетронутыми подготовку вестибулярного сенсорного эпителия описаны здесь. Мы демонстрируем полу-нетронутыми подготовке мыши Криста ³, И показать представитель результаты, полученные из целых клеток патч электрофизиологии и двухфотонного Кальций изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Животные

1. Мыши были получены из Австралийского центра грызунов (ARC, Перт, Австралия) и выдерживают при Университете Сиднея фонда животных Bosch на обычной 12-часовой цикл свет / темнота с экологическими обогащения. Все эксперименты, описанные были одобрены Университета Сиднея животных Комитета по этике.
2. Самцов и самок мышей (C57/BL6) были использованы для всех экспериментов с этим штаммом обычно используются в качестве фона для генетических манипуляций, и может рассматриваться как эквивалент дикого типа ^8-9.

2. Приготовление тканей

1. Подготовка 300 мл основе глицерина искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF), состоящей из (в мМ): 26 NaHCO _3, 11 глюкозы, 250 глицерин, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 1,2 MgCl2 _и 2,5 CaCl _2. Перед добавлением CaCl _2, газ раствора с карбогеном (95% O ₂ и 5% CO _2), чтобы установить арН 7.4 и избежать осаждения кальция (облачность). Замораживание раствора в -80 ° С в морозильнике в течение 45 мин, так что лед образуется суспензия.
2. Глубокую анестезию мышей кетамином (100 мг / кг) (Парнелл, Alexandria, Австралия) с помощью интраперитонеальной инъекции.
3. Как только задних конечностей рефлексы отсутствуют щепотку мышей обезглавить острыми ножницы из нержавеющей стали и сделать сагиттального разреза кожи с помощью лезвия бритвы (округленно № 22), чтобы выставить черепа. В этот момент и на протяжении шаги 2.3-2.8 свода черепа, головного мозга и основные вестибулярного аппарата должны быть по возможности в холодном регулярным применением ледяной ACSF на ткани.
4. С помощью заостренного руку стандартных ножниц шаблон (ФСТ, Северный Ванкувер, Канада) сделайте небольшой надрез в черепе на Лямбда и разрезать вдоль стреловидного шва. Убедитесь, что мозг не "вытащили" от сдвига лезвия во время этого этапа.
5. Аккуратно снимите теменных костей в боковом направлении и затылочной кости posterioRLY использованием мелкой изгиб Rongeurs Пирсон (ФСТ).
6. Небольшое шпателя из нержавеющей стали затем используется для осторожно поднимите мозга с поверхности средней и задней черепной ямки и подвергается vestibulocochlea нерва (CNVIII) разрезать на полпути между внутренним ухом и ствола мозга с парой тонких ножниц радужной оболочки. Резка этого нерва уменьшает чрезмерное натяжение аксонов первичных афферентов и их связи с волосковых клеток.
7. После рассечение CN VIII мозг удаляют в целом.
8. Вестибулярного лабиринта теперь хорошо видны в средней черепной ямки, с улиткой указывая anteromedially. Rongeur обе стороны от вестибулярного лабиринта, прежде чем осторожно иссечения, взявшись за переднюю полукруглых каналов и потянув в стороны.
9. Погрузите вырезали лабиринты (рис. 1) в рассекает блюдо содержащего ледяную, непрерывно газом ACSF описано в разделе 2.1. Под стереомикроскопом, держите лабиринт, чтобыоснование блюдо, взявшись улитки. Используйте тонкий пинцет, чтобы поцарапать далеко в кости покрывающей переднюю полукруглую ампула канала. После небольшой отверстие в кости достигается начинают Флик кости от ампулы. Следует проявлять осторожность, чтобы не нажать щипцами через кость, так как это может привести к повреждению основного перепончатого лабиринта и сенсорного эпителия. Продолжайте эту процедуру, пока обе передние и соседних горизонтальных полукруглые мембранных каналов и ампулы не подвергаются (рис. 2).

Рисунок 1. Изолированные мышка вестибулярного лабиринта. А. Левая панель) Схематическое представление изолированных мышь вестибулярного лабиринта. Важные ориентиры для доступа к вестибулярной сенсорного эпителия, улитки, передней и горизонтальные полукружные каналы лабораторииELED. Звездочки указывают полукруглых канала ампулы содержащие вестибулярного сенсорного эпителия. B. Правая панель) микрофотография изолированного вестибулярного лабиринта от 1-месячной мыши.

Рисунок 2. Воздействие на мембранные вестибулярного лабиринта. Вышележащих кости передних и горизонтального канала полукруглого ампулы были поцарапаны, обнажая черные / коричневые шляпки мембранных ампулы и связанные с ними нервы ампулярной (CNVIII). Схема на нижней панели представляет структур в выделенной области микрофотографии и показывает отношение полукруглых каналах канал в ампулы и CNVIII.

10. Использование тонких щипцов, осторожно поднимите ампулы и связанных с ним сумочка от костного лабиринта, гарантируя, что центральная область ампулы (Containing сенсорного эпителия) не повреждена. В некоторых случаях проксимальной части полукруглого мембранного канала, возможно, придется вырезать ножницами Iris выпустить ампулами из кости.
11. Передача триады, содержащие два ампулы и сумочки в чашку Петри с L-15 Лейбовиц культуральной среде (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури). Использование волоконно-оптических к «Подсветка» ткани. Это позволяет четкой визуализации Криста содержащие сенсорного эпителия в ампулах.
12. Обязательно сделайте разрез в пятнистых «крышей» мешочке с тонкими ножницами диафрагмы. Продолжить этот разрез через крышу передней и затем горизонтальной ампулы. Сделайте разрез как можно ближе к краю сенсорного эпителия насколько это возможно без контактирования (рис. 3А). Убедитесь, что нет никаких частей мембраны вышележащих сенсорного эпителия (рис. 3В)
13. Передача изолированной полу нетронутыми подготовка к небольшой стекляннойс дном записи камеры, заполненной L-15 средств массовой информации. Отягощать подготовки с использованием сетки из тонких волокон нейлона, прикрепленный к плоский П-образной платиновой проволоки (рис. 3В). В идеальном случае волокон сетки не должны перекрывать сенсорного эпителия, однако в некоторых случаях, когда больше стабильности требуется, одно волокно, пересекающих сенсорный эпителий может быть предпочтительным.

Рисунок 3. Изолированной полу-нетронутыми подготовку вестибулярного сенсорного эпителия. А. Схематическое изображение полу-нетронутыми подготовки и конфигурации электродов. Ампула вышележащих Криста была "де крышей", чтобы разоблачить поверхности сенсорного эпителия (зеленый). B. микрофотография полу-нетронутыми подготовки 'Триада' показывает переднюю (AC) и горизонтальные (HC) Криста (маточки быть закрытзадние переменного тока). Обратите внимание на нейлоновых волокон, используемых для крепления подготовке к основанию записи камеры. Шкала бар:. 100 мкм C. записи электрода расположены на отдельных вестибулярных волосковых клеток. Шкала бар: 15 мкм.

3. Электрофизиологии

1. Заливать полу-нетронутыми препарата с кислородом непрерывно L-15 среде. Носитель содержит индикатор рН (фенол красный) и цвет среды следует контролировать в течение записи. РН с кислородом должно быть 7,3-7,4 и соответствует красный цвет.
2. Подготовьте записи пипетки от 1,5 мм (1,19 мм ID) боросиликатного стекла с использованием двухступенчатой ​​протокол (тепло шаг 1: 72, и тепло шаг 2: 50) на микропипетки съемник (Narishige, Япония, модель PP-830), чтобы достичь Окончательный сопротивление 3-4 МОм.
3. Заполните хвостовик пипетки с 3-4 мм калия на основе фторида внутренний раствор, содержащий (в мм) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, один NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 _MgCl2,3 D-глюкозы и 2 Na-АТФ, рН 7,4 с помощью КОН.
4. Обертка хвостовик пипеткой 2-3 раза и как далеко вниз к кончику это возможно, с тонкой полоской парафином, чтобы изолировать электродом и уменьшить пипетку емкостью.
5. Поместите пипетку над сенсорного эпителия при низком увеличении (5x) на прямой микроскоп (Olympus BX51). Переключить на высокой мощности (40X) и визуализировать отдельные вестибулярные волосковые клетки с прикрепленной камерой CCD.
6. Позиция пипетки на мембране клетки визуализировали волос (фиг.3С) с использованием микроманипулятор (Sutter Instruments, штат Калифорния, США). После того, как печать гигаом достигается, разрыв клеточной мембраны с небольшим количеством отрицательного давления, приложенного через всасывающее отверстие на держатель пипетки.
7. Сделать цельноклеточная напряжения зажим записи с использованием стандартных методов ^8-9.

4. Два-фотонной микроскопии

1. Подготовьте 0,9% солевой раствор, содержащий 5 мМ Орегон Зеленый488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium соль; Invitrogen, Германия).
2. Хотя до сих пор под водой, поместить "де крышей" полу-нетронутыми триады подготовки на небольшой кусочек фильтровальной бумаги (4х4 мм, 0,8 мкм; Millipore, Германия) обеспечение того, чувствующего эпителия беспрепятственный сверху.
3. Передача фильтровальную бумагу и подготовки на солевой покрытым электродом базы платины (7 мкл) электропораторе состоящий из комбинации генератор импульсов и широкополосный усилитель, а крышка с еще 5 мкл 5 мМ раствора синтетического кальция индикаторный краситель Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 (рис. 4).

Рисунок 4. Массовая электропорации. А. схематическое поперечное сечение электропорации конфигурации. Полу-нетронутыми препарата (*) помещают на лист фильтровальной бумаги, погруженный в кальция дые (Орегон Зеленый 488 BAPTA-1) и тока, приложенного между платиновыми электродами 2. Взято из Бриггмэн и Эйлер, 2011 ^10.

4. Принесите верхней параллельной платиновый электрод с базовым электродом на расстоянии примерно 2 мм, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить ориентацию подготовки когда контакт с Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 раствор доводят.
5. Передайте краткого импульса тока через препарат (параметры текущего; +13 В, 10 мс длительность импульса, частотой 1 Гц, 10 прямоугольных импульсов) ^10-11.
6. В нижней части со стеклянным дном камеры записи заполнен L-15 среда, место небольшое прикосновение силиконовое масло и положение полу-нетронутыми препарат на него, снова обеспечение того, чтобы сенсорный эпителий беспрепятственный сверху. Для обеспечения стабильности во изображений, заменить нейлон сетку на препарат, как описано выше (см. пункт 2.13).
7. Использование двухфотонного микроскопа сделать оптической записи спонтанногоспонтанной активности кальция в сенсорном эпителии (рис. 7) с использованием стандартных протоколов изображений ^10-11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Электрофизиологических свойств вестибулярных волосковых клетках зависят от комплекса микроархитектуру, в которой они встроены ^7. 5 показано, что полу-нетронутыми вестибулярной подготовки эпителия могут быть использованы для различать тип я волосковые клетки (рис. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Механизмы, лежащие в основе нашего чувства равновесия получили мало внимания по сравнению с другими сенсорными системами, например, зрительной и слуховой систем. Из исследований, изучавших изменения в вестибулярной или баланса белого, большинство из них сосредоточено на поведен?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Two-photon microscope	Olympus/La Vision	BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
InstraTECH A-D converter	HEKA	ITC-18
Sutter Micromanipulator	Sutter	MP-225/M
multiclamp amplifier	Axon Instruments	700B
Data acquisition software (electrophysiology)	Axograph	N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon)	Max Planck innovation	N/A