전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

요약

전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

초록

이해 전정 유모 세포가 정상 조건 하에서 작동하는 방법이나 외상, 질병,이 기능을 방해 노화가 예방 방법 및 / 또는 새로운 치료 전략의 개발에 중요한 단계입니다. 그러나 비정상적인 전정 기능을 찾고 연구의 대부분은 세포 수준에서하고 있지만, 주로 보행 분석과 전정 안구 반사 성능과 같은 전정 기능 장애의 행동 분석에 집중하지 않았습니다. 이 작품은 일이 잘못 갈 때 일어나는에 대한 귀중한 데이터를 굴복하면서, 약간의 정보는 장애의 근본 원인에 대한 수집하고 있습니다. 전정 기능의 기초가 세포와 세포 내 프로세스에 집중하는 연구의 대부분은 시냅스 연결 및 지원 세포 환경의 결여 심하게 고립 된 유모 세포에 의존했다. 따라서 중요한 기술적 과제 준비에 절묘하게 맞는 전정 유모 세포에 액세스 할 수있다aration은 최소한 생리 학적, 중단됩니다. 여기에서 우리는 헤어 셀 / 기본 심성 단지 등 지역의 미세 환경을 유지 마우스 전정 감각 상피의 반 그대로 준비를 보여줍니다.

서문

우리의 일상 생활에 전정의 큰 공헌에도 불구하고, 나이 전정 기능 관찰 하락에 대한 책임 프로세스의 명확한 이해가 어려운 남아있다. 지식이 부족 한 이유는 전정 기능이 저하 거의 독점적으로 전정 안구 반사 (VOR), 외적 전정 기능의 정확한 지표 등 행동 분석을 사용하여 탐구되었습니다,하지만 본질적인 구성 요소의 변경에 제한 통찰력을 제공합니다 . 이 건강, 질병 또는 노화 전정 헤어 세포 기능에 대한 우리의 이해에 큰 장애물이다.

각각의 전정 유모 세포의 많은 연구가되어 있지만, 주요 단점은 머리카락 세포와도 꽃받침 성의 터미널은 기계적 및 / 또는 효소 처리를 통해 정상적인 환경에서 제거됩니다 급성 머리 세포 준비에 의존하고있다. 이러한 접근 방식의 필연적BLY 머리 세포와 꽃받침, 헤어 세포와지지 세포 사이의 섬세한 마이크로 아키텍처를 중단. 준 그대로 준비 ^1-5, 그리고 고립 된 마우스 미로 준비 ^6의 발달과 함께, 더 밀접하게 생체 내에서 이러한 닮은 상태에서 시냅스 통신의 다양한 형태를 연구 할 수있는 기회가 지금있다. 실제로 임 하였다. (2011) I 전정 유모 세포가 neuroepithelium 내에 포함 된 유지하는 사람에 비해 심하게 고립 된 형식에서 기록 된 전체 셀 전류에 표시된 차이를 보였다. 특히 칼륨은 머리 세포 성의 꽃받침 사이 간 공간에 축적 생각하고, 크게 머리 세포 반응 ⁷ 변경합니다. 이러한 유형의 정보는 여기에 설명 된 전정 감각 상피의 반 그대로 준비없이 취득하는 것은 불가능합니다. 우리는 마우스 crista ³ 반 그대로 준비를 보여줍니다, 및 전체 세포 패치 전기 생리학에서 얻은 대표적인 결과, 두 광자 칼슘 이미징을 보여줍니다.

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프로토콜

1. 동물

1. 마우스는 호주의 설치류 센터 (ARC, 퍼스, 호주)에서 얻은 환경 농축과 일반 12 시간 빛 / 어둠주기 시드니 보쉬 동물 시설의 대학에서 개최. 설명 모든 실험은 시드니의 동물 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.
2. 남성과 여성의 생쥐 (C57/BL6)이 변형은 일반적으로 유전자 조작을위한 배경으로 사용되기 때문에 모든 실험에 사용하였고, ^8-9 야생형 같은 것으로 간주 될 수 있습니다.

2. 조직 준비

1. 26 _NaHCO3를 11 포도당, 250 글리세롤, 2.5 KCl을, 1.2의 NaH ₂ PO _4, 1.2 MgCl _2, 2.5 염화칼슘 ₂ : 구성된 글리세롤 기반의 인공 뇌척수 (ACSF) (단위 : mm)의 300 ML을 준비합니다. _{염화칼슘의} 추가 이전에, 가스 carbogen (95 % O ₂ 5 % CO _2)와 솔루션은 AP를 구축하는7.4 H 피하고 칼슘 침전 (흐려). 아이스 슬러리가 형성되도록 45 분 -80 ° C의 냉동고에서 솔루션을 고정합니다.
2. 깊이 복강 주사를 통해 케타민 (100 ㎎ / ㎏) (파넬, 알렉산드리아, 호주)와 쥐를 마취시키다.
3. 일단 뒷다리 사지 핀치 반사 날카로운 스테인리스 가위를 사용하여 결석 목을 벨 마우스이며 두개골을 노출하는 면도날 (# 22 반올림)를 사용하여 시상 ​​피부 절개를합니다. 이 시점에서와 같이 2.3-2.8에 걸쳐 두개골 금고, 뇌 및 기본 전정 장치는 조직에 얼음처럼 차가운 ACSF의 일반 응용 프로그램에서 가능한 시원한로 유지해야합니다.
4. 표준 패턴 가위의 뾰족한 팔 (FST, 노스 밴쿠버, 캐나다)를 사용하여 람다에서 두개골에 작은 절개를하고 시상 봉합을 따라 잘라. 뇌가이 단계에서의 전단 블레이드로 "드래그"되지 않았는지 확인합니다.
5. 조심스럽게 옆으로 멀리 정수리 뼈와 뒤통수 뼈 posterio 껍질RLY 얕은 굴곡 피어슨 rongeurs (FST)를 사용하여.
6. 작은 스테인레스 스틸 주걱은 조심스럽게 중간과 후방 두개골 fossae의 표면에서 머리를 들어 올리는 데 사용하고, 노출 vestibulocochlea 신경 (CNVIII)는 내이 (内耳) 및 미세 홍채 가위와 뇌간 사이의 중간을 잘라. 이 신경을 절단 머리 세포의 기본 심성과 연결 축삭에 과도한 긴장을 최소화합니다.
7. CN VIII의 절개에 따라 뇌 토토에서 제거됩니다.
8. 전정 미로는 달팽이관이 anteromedially 가리키는 이제 중간 두개골 포사에서 명확하게 볼 수 있습니다. 조심스럽게 앞쪽에 반원형의 운하를 잡고 옆으로 잡아 당겨 절개 전에 전정 미로의 양쪽을 Rongeur.
9. 2.1 절에 설명 된 얼음처럼 차가운 지속적으로 가스를 공급 ACSF를 포함하는 해부 접시에 절제 미로 (그림 1)을 담가. 입체 현미경 아래에 미로를 개최달팽이관을 잡고하여 요리의 기초. 전방 반원의 운하 팽대부를 덮고있는 뼈에 멀리 스크래치 미세 집게를 사용합니다. 뼈에 작은 구멍이 달성되면 멀리 팽대부에서 뼈를 가볍게하기 시작합니다. 주의이 기본 막성 미로와 감각 상피에 손상을 일으킬 수 있으므로 뼈를 집게를 밀어하지 않도록주의해야한다. 전방과 인접한 수평 반원 막 덕트 및 ampullae 모두 (그림 2) 노출 될 때까지이 절차를 계속합니다.

그림 1. 고립 된 마우스 전정 미로입니다. A. 왼쪽 패널) 고립 된 마우스 전정 미로의 도식 표현. 전정 감각 상피에 액세스하기위한 기준의 중요한 점은, 달팽이관, 전방, 수평 반원의 운하 실험실입니다으로 모델링. 별표 전정 감각 상피를 포함하는 반원의 운하 팽대부를 나타냅니다. B.는 1 개월 마우스에서 분리 된 전정 미로의 오른쪽 패널) 현미경 사진.

그림 2. 막성 전정 미로의 노출. 전방 수평 반원의 운하 ampullae를 덮고있는 뼈는 블랙 / 브라운 반점이 막 ampullae 및 관련 팽대부 신경 (CNVIII)을 나타 내기 위해 멀리 긁힌되었습니다. 하단 패널의 회로도 현미경의 강조 표시된 영역에서 구조를 나타내고 ampullae 및 CNVIII에 반원의 운하 덕트의 관계를 보여줍니다.

10. 미세 집게를 사용, 가볍게 보장, 뼈 ​​미로에서 멀리 ampullae 및 관련 난형를 들어 그 ampullae의 중심 지역 (콘타감각 상피를) ining가 손상되지 않습니다. 어떤 경우에는 반원형 막 덕트의 근위 부분은 뼈 ampullae을 해제 홍채 가위로 잘라해야 할 수 있습니다.
11. Leibovitz의 L-15 배양액 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)로 가득 페트리 접시에 두 ampullae과 난형 낭을 포함하는 화음을 전송합니다. "백라이트"조직에 광학 섬유를 사용합니다. 이 ampullae 내 감각 상피를 포함하는 crista의 명확한 시각화 할 수 있습니다.
12. 조심스럽게 잘 홍채 가위로 난형의 얼룩덜룩 한 "지붕"의 절개를합니다. 전방의 지붕 그리고 수평 ampullae 통해 절개를 계속합니다. 합니다 (그림 3A)를 문의하지 않고 가능한 한 감각 상피의 가장자리에 가깝게 절개를합니다. 감각 상피를 덮고있는 막에는 조각 (그림 3B)가 없는지 확인
13. 작은 GLAS에 고립 된 반 그대로 준비를 전송의 바닥 녹음 챔버 L-15 미디어로 채워진. 평평 U-모양의 백금 와이어 (그림 3B)에 고정 좋은 나일론 섬유의 격자를 사용하여 준비를 무게. 이상적으로, 그리드의 섬유 감각 상피를 덮어 쓰기하지 말아야하지만 더 많은 안정성이 요구되는 경우에, 어쩌면 선호하는 감각 상피를 끊어 버렸네 단 하나 섬유.

그림 3. 반 그대로 준비 및 전극 구성의 전정 감각 상피. A. 도식 표현의 고립 된 반 그대로 준비. crista을 덮고 팽대부는 감각 상피 (녹색)의 표면을 노출하는 "드 지붕"이다. 전방 (AC)과 수평 (HC) crista (난형를 보여 준 그대로 '깡패'의 준비 B. 현미경 사진 할 가려) AC 뒷다리. 녹음 챔버의 기초에 준비를 고정하는 데 사용되는 나일론 섬유를합니다. 스케일 바 :. 100 μm의 C. 개별 전정 헤어 셀 위치 기록 전극. 스케일 바 : 15 μm의.

3. 전기 생리학

1. 지속적으로 산소 L-15 배지로 준 그대로 준비를 붓는다. 미디어 녹음을 통해 모니터링해야 배지의 pH 표시기 (페놀 레드)와 색상을 포함합니다. 산소와 pH는 7.3-7.4이어야하며 붉은 색에 해당합니다.
2. 를 달성하기 위해 micropipette의 풀러 (모형 PP-830 Narishige, 일본)에 :; 두 단계 프로토콜 (50 열 2 단 72 열 1 단계)를 사용하여 1.5 mm (1.19 mm의 ID) 붕규산 유리에서 녹음 피펫을 준비 MΩ 3-4의 마지막 임피던스.
3. MgCl ₂ (mm 단위) 110 KF, 12 KCl을 27 KOH 1, 염화나트륨, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8가 포함 된 칼륨 불소 기반의 내부 용액 3-4 mm 인 피펫의 정강이를 기입3 D-포도당과 2 NA-ATP, KOH로 pH를 7.4.
4. 멀리 아래로 전극을 절연 및 피펫 용량을 줄이기 위해 파라 필름 (parafilm)의 얇은 스트립 가능한 팁 피펫 2 ~ 3 배의 정강이를 래핑합니다.
5. 직립 현미경 (올림푸스 BX51)의 낮은 전력 배율 (배)에서 감각 상피에 피펫을 놓습니다. 높은 전력 (40X)로 전환 연결된 CCD 카메라로 개인의 전정 유모 세포를 시각화.
6. micromanipulator에 (셔터 악기, 캘리포니아, USA)를 사용하여 시각화 머리 세포 (그림 3C)의 막에 위치 피펫. 기가 옴 씰이 달성되면, 파열 피펫 홀더 흡입 포트를 통해 적용 부정적인 압력의 작은 양의 세포막.
7. 표준 기술 ^8-9를 사용하여 전체 셀 전압 클램프 녹음을합니다.

4. 두 광자 현미경

1. 5 mM의 오레곤 그린을 포함하는 0.9 % 생리 식염수를 준비488 BAPTA-1 (OGB-1, hexapotassium 소금, Invitrogen 사, 독일).
2. 감각 상피는 위의 방해임을 보장, 여전히 침수 동안 필터 종이의 작은 조각 (밀리 포아, 독일 4X4 mm, 두께 0.8 μm의)에 "드 지붕"반 그대로 깡패 준비를 놓습니다.
3. 합성 칼슘의 5 밀리미터 솔루션의 추가로 5 μL와 필터 종이 준비 펄스 발생기와 광대역 앰프의 조합으로 이루어진 electroporator의 염분 적용 기본 백금 전극 (7 μL) 위에, 그리고 덮개를 전송 표시 염료 오레곤 그린 488 BAPTA-1 (그림 4).

그림 4. 대량의 electroporation. A. 회로도 일렉트로 구성의 단면을 표시합니다. 준 그대로 준비 (*)는 칼슘 DY에 몰두 필터 종이에 배치됩니다E (오레곤 그린 488 BAPTA-1)과 전류는 2 백금 전극 사이에인가. Briggman 오일러 2011 년 ^10에서 적응.

4. 오레곤 그린 488 BAPTA-1 용액을 만들어 접촉 할 때 준비의 방향을 방해하지 않도록주의, 대략 2 mm의 거리에서베이스 전극 위에 백금 전극과 평행을 가져온다.
5. ^10-11, 준비 (+13 V, 10 밀리 초 펄스 폭, 1 Hz의 주파수, 10 방형 파 펄스 전류에 대한 매개 변수)를 통해 짧은 전류 펄스를 전달합니다.
6. L-15 배지로 가득 유리 바닥 녹음 챔버의 바닥에, 다시 감각 상피 위에서 방해 것을 보장 그것에 실리콘 오일 및 위치 반 그대로 준비의 작은 덩어​​리를 놓습니다. (포인트 2.13 참조) 위에서 설명한대로 이미지를 통해 안정성을 보장하기 위해 준비에 나일론 격자를 교체합니다.
7. 두 광자 현미경을 사용하여 sponta의 광학 녹음을표준 영상 프로토콜에게 ^10-11를 사용하여 감각 상피 (그림 7)에서 neous 칼슘 활동.

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결과

전정 유모 세포의 전기 생리학 속성들은 ⁷ 포함하는 내 복잡한 마이크로 아키텍처에 따라 다릅니다. 반 그대로 전정 상피 준비가 유형을 구별하는 데 사용할 수 있습니다 그림 5를 보여줍니다 I 유모 세포 (그림 5A), II 형 유모 세포 (그림 5B), 그리고 꽃받침 기본 심성 (그림 5C) 특징 전체 세포의 컨덕턴스에 따라. 이러한 특성은 탈분극하는 ...

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토론

균형 우리의 감각을 기본 메커니즘은 다른 감각 시스템에 비해 제한적인 주목을 받고 있고, 시각 및 청각 시스템을 예를 들어. 전정이나 균형 기능의 변화를 연구 한 연구의 대부분은 밸런스 전정 유모 세포 자체의 기본적인 빌딩 블록의 불완전한 지식, 전정 안구 반사 등의 행동 조치에 초점을 맞추고있다. 자신의 네이티브 환경에서 제거 심하게 격리 된 머리 세포를 사용하므로 유모 세포...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Two-photon microscope	Olympus/La Vision	BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
InstraTECH A-D converter	HEKA	ITC-18
Sutter Micromanipulator	Sutter	MP-225/M
multiclamp amplifier	Axon Instruments	700B
Data acquisition software (electrophysiology)	Axograph	N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon)	Max Planck innovation	N/A