Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Özet

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Özet

Anlamak vestibüler saç hücreleri normal koşullar altında işlev, ya da ne kadar travma, hastalık, ve bu fonksiyon bozabilir yaşlanma önleyici yaklaşımlar ve / veya yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi hayati bir adımdır. Ancak, anormal vestibüler fonksiyon bakarak çalışmaların çoğunluğu hücresel düzeyde olmuştur ama esas olarak yürüyüş analizleri ve vestibülookuler refleks performans olarak vestibüler fonksiyon bozukluğu davranış testleri odaklı değil. Bu iş terslik ne olur hakkında değerli bilgiler vermiştir olsa da, çok az bilgi disfonksiyon nedenleri ile ilgili toplanan edilir. Vestibüler fonksiyonu altında yatan hücresel ve hücre içi süreçleri odaklanmak çalışmaların, çoğu sinaptik bağlantıları ve destekleyici hücre çevre yoksun akut izole saç hücreleri, yararlanmıştır. Bu nedenle, büyük bir teknik meydan okuma bir hazırlık içinde zarif duyarlı vestibüler saç hücrelerinin erişimi olmuşturaration en fizyolojik, bozulur bu. Burada saç hücre / primer afferent kompleksleri dahil olmak üzere yerel mikro-çevre korur fare vestibüler duyu epitel bir yarı-sağlam hazırlık göstermektedir.

Giriş

Günlük hayatımıza vestibüler sistemin önemli bir katkı rağmen, yaşla birlikte vestibüler fonksiyonunda gözlenen düşüş sorumlu süreçlerin net bir anlayış zor kalır. Bu bilgi eksikliği bir nedeni vestibüler fonksiyonu bu düşüş neredeyse sadece vestibülookuler refleks (VOR), dışsal vestibüler fonksiyonun kesin bir gösterge dahil davranış testleri kullanılarak incelenmiştir, ancak içsel bileşenlerinin değişiklikleri içine sınırlı bilgiler sağlar . Bu sağlık, hastalık, ya da yaşlanma vestibüler saç hücre fonksiyonlarını daha iyi anlayabilmemiz için önemli bir engeldir.

Bireysel vestibüler saç hücrelerinin birçok çalışma varken, büyük bir eksiklik saç hücreleri ve hatta çanak afferent terminaller mekanik ve / veya enzimatik tedavi ile normal ortamdan kaldırılır akut saç hücresi hazırlıkları, üzerinde güven olmuştur. Bu tür yaklaşımlar kaçınılmazkızak kesici saç hücresi ve çanak ve saç hücre ve destekleyici hücre arasındaki hassas mikromimarisini bozabilir. Yarı sağlam hazırlıkları ^1-5, ve izole bir fare labirent hazırlık ⁶ gelişmesiyle birlikte, daha yakından in vivo benzeyen bu koşullar altında sinaptik iletişim çeşitli şekillerde incelemek için bir fırsat şimdi var. Gerçekten de, Lim ve ark. (2011) I vestibüler saç hücreleri neuroepithelium içinde gömülü kaldığını kıyasla akut izole türünden kaydedilen tüm hücre akımları belirgin farklılıklar gösterdi. Özellikle, potasyum saç hücresi ve afferent çanak arasında, hücreler arası boşlukta birikir düşünülmektedir, ve önemli ölçüde saç hücresi yanıtı ⁷ değiştirebilir. Bu tür bilgiler burada açıklanan vestibüler duyusal epitelin yarı sağlam hazırlık olmadan elde etmek mümkün olacaktır. Biz fare krista ³ yarı sağlam hazırlık göstermekVe tam hücreli yama elektrofizyoloji elde edilen temsilcisi sonuçları ve iki foton kalsiyum görüntüleme göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hayvanlar

1. Fareler Avustralya Kemirgen Merkezi (ARC, Perth, Avustralya) elde edildi ve çevresel zenginleştirme ile normal 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü Sidney Bosch Hayvan Tesisi Üniversitesi'nde düzenledi. Tanımlanan tüm deneyler Sidney Hayvan Etik Kurul Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
2. Erkek ve dişi fareler (C57/BL6) bu gerginlik yaygın genetik manipülasyon için arka planı olarak kullanılır çünkü tüm deneyler için kullanıldı ve ^8-9 vahşi-tipe eşdeğer kabul edilebilir.

2. Doku Hazırlanması

1. 26 _NaHCO3, 11 glukoz, 250, gliserol, 2,5 KCl, 1.2 NaH ₂ PO _4, 1.2, _MgCl2, ve 2.5 _CaCI2: oluşan bir gliserol bazlı yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mM olarak) 300 ml hazırlayın. _CaCl2 ilavesinden önce, karbojen gazı (% 95 _O2 ve% 5 _CO2) ile çözüm AP kurmak7.4 H ve önlemek kalsiyum yağış (bulutluluk). Bir buz bulamaç oluşmuştur, böylece, 45 dakika boyunca -80 ° C dondurucu içinde çözelti dondurun.
2. Derin bir içi-periton enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) (Parnell, İskenderiye, Avustralya) ile fareler uyuşturan.
3. Bir kez arka-bacak tutam refleksleri keskin paslanmaz çelik makas kullanarak yok başını kesmek fareler ve kafatası ortaya çıkarmak için bir jilet (# 22 yuvarlak) kullanarak sagital cilt kesi yapmak. Bu noktada ve adımları 2,3-2,8 boyunca kafatası, beyin, ve temel vestibüler cihaz doku üzerinde buz ACSF düzenli uygulama mümkün olduğunca serin tutulmalıdır.
4. Standart desen makas sivri kolu (FST, Kuzey Vancouver, Kanada) kullanılarak Lambda de kafatasında küçük bir kesi yapmak ve sagital sütür boyunca kesilir. Beynin bu adımı sırasında kesme bıçağı ile "sürüklenen" olmadığından emin olun.
5. Dikkatlice yanal parietal kemik ve oksipital kemik postero kabuğurly sığ viraj Pearson rongeurs (FST) kullanarak.
6. Küçük bir paslanmaz çelik spatula yavaşça orta ve posterior kranial fossa yüzeyinden beyin kaldırmak için kullanılan ve maruz vestibulocochlea sinir (CNVIII) iç kulak ve ince iris bir makas ile beyin sapı arasında yarı yolda kesilir. Bu sinir kesme saç hücreleri ile birincil afferentleri ve bağlantılarının akson üzerinde aşırı gerginlik en aza indirir.
7. CN VIII transeksiyonu takiben beyin toto uzaklaştırılmaktadır.
8. Vestibüler labirent koklea anteromediale işaret ile, şimdi orta kranial fossada açıkça görülebilir. Hafifçe ön semisirküler kanal kavrama ve yanal çekerek eksize önce vestibüler labirent her iki tarafında RONGEUR.
9. Bölüm 2.1 'de açıklanan buz gibi, sürekli gaz verilerek ACSF içeren bir diseksiyon çanak çıkarıldı labirentler (Şekil 1) bırakın. Bir stereomikroskopta altında, labirent tutunkoklea kavrayarak çanak taban. Ön semisirküler kanal ampulla örten kemik uzakta kazımak için ince forseps kullanın. Kemik küçük bir delik elde uzak bir kez Ampulla gelen kemik fiske başlar. Dikkat Bu temel membranöz labirent ve duyusal epitel zarar verebilir gibi kemik ile forseps itmek için değil alınmalıdır. Ön ve komşu yatay yarım daire membran kanalları ve ampullae hem (Şekil 2) maruz kalan kadar bu işleme devam edin.

Şekil 1. İzole fare vestibüler labirent. A. Sol panel) izole fare vestibüler labirent şematik. Vestibüler duyu epitel erişim için referans önemli noktaları, salyangoz, ön ve yatay semisirküler kanallar laboratuarıeLED. Yıldız vestibüler duyu epitel içeren semisirküler kanal ampulla göstermektedir. B. 1 aylık fareden izole vestibüler labirent sağ panel) photomicrograph.

Şekil 2. Membranöz vestibüler labirent maruz kalması. Anterior ve yatay semisirküler kanal ampullae örten kemik siyah / kahverengi benekli membranöz ampullae ve ilgili ampuller sinirler (CNVIII) ortaya çıkarmak için çizilmiş. Alt panelinde şematik fotomikrografisine vurgulanan bölgedeki yapıların temsil eder ve ampullae ve CNVIII için semisirküler kanal kanalların ilişkiyi gösterir.

10. Ince forseps kullanarak, yavaşça sağlanması, kemik labirent uzak ampullae ve ilgili kırbacık kaldırdıklarını ampullae merkez bölgesi (contaduyusal epitel) ining zarar değildir. Bazı durumlarda yarım daire membranöz kanal proksimalinde kemikten ampullae serbest bırakmak için iris makası ile kesmek gerekebilir.
11. Leibovitz L-15 kültür ortamı (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ile dolu bir Petri kabı içine iki ampullae ve kırbacık içeren üçlü aktarın. "Arka" dokuya optik bir fiber kullanın. Bu ampullae içinde duyusal epitel içeren kristanın açık görselleştirme sağlar.
12. Dikkatlice ince iris makas ile kırbacık en benekli "çatı" bir kesi yapmak. Ön çatısı ve daha sonra yatay ampülleri ile bu kesi devam edin. Bu (Şekil 3A) irtibat kurmadan mümkün olduğunca duyu epitel kenarına yakın kesi yapmak. Duyusal epitel örten zarın hiçbir parça (Şekil 3B) olmadığından emin olun
13. Küçük bir cam ile izole yarı sağlam hazırlanması aktarmas dipli kayıt odasına L-15 medya ile dolu. Düzleştirilmiş bir U-şekilli platin tel (Şekil 3B) sabitlenmiş ince naylon liflerden oluşan bir ızgara kullanarak hazırlanması aşağı tartılır. İdeal olarak, kılavuz teller duyusal epitel örter gerekir, ancak daha yüksek stabilite gerekli olduğu bazı durumlarda, belki de tercih duyu epitel kesilmesiyle tek bir fiber.

Şekil 3,. Yarı sağlam hazırlık ve elektrot yapılandırma vestibüler duyu epitel. A. şematik temsil izole yarı sağlam hazırlık. Crista örten ampulla duyusal epitel (yeşil) yüzeyine ortaya çıkarmak için "de-çatılı" olmuştur. Anterior (AC) ve yatay (hc) crista (kırbacık gösteren yarı sağlam 'üçlü' hazırlık B. photomicrograph olmak gizlenmiş) ac arka. Kayıt odasının tabanına hazırlanması sabitlemek için kullanılan naylon elyaf edin. Ölçek çubuğu:. 100 mikron C. bireysel vestibüler saç hücre yerleştirilmiş bir kayıt elektrot. Ölçek çubuğu: 15 mikron.

3. Elektrofizyoloji

1. Sürekli oksijenli L-15 ortamı ile yarı sağlam hazırlanması serpmek. Medya kayıtları boyunca izlenmelidir ortamın pH göstergesi (fenol kırmızı) ve renk içerir. Oksijen ile pH 7.3-7.4 olacak ve kırmızı bir renk uygun olmalıdır.
2. Bir elde etmek için bir mikropipet çektirmesi (model PP-830 Narishige, Japonya,) üzerinde:,: iki aşamalı bir protokol (50 ve ısı adım 2 72 ısı adım 1) ile 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın MQ 3-4 nihai empedansı.
3. _MgCl2 (mM olarak) 110 KF, 12 KCI, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 mM EGTA, 1.8 içeren bir potasyum flüorür temelli bir iç çözelti 3-4 mm olan pipet şaft doldurun3. D-glikoz, ve 2 Na-ATP, KOH ile pH 7.4.
4. Kadar aşağı elektrot izole ve pipet kapasitans azaltmak için parafilm ince bir şerit ile mümkün olduğunca ucu pipet 2-3 kez sap sarın ve.
5. Dik bir mikroskop (Olympus BX51) düşük güç büyütme (5X) altında duyu epitel üzerinde pipet yerleştirin. Yüksek güç (40X) geçin ve bağlı bir CCD kamera ile tek tek vestibüler saç hücrelerinin görselleştirmek.
6. Bir micromanipulator (Sutter Instruments, California, ABD) kullanılarak bir görsel saç hücresi (Şekil 3C) ve membran pozisyon pipet. Bir gigaohm sızdırmazlık elde edilir, kopma pipet tutucu bir emiş ağzı yoluyla uygulanan bir negatif basınç küçük bir miktarı ile hücre zarı.
7. Standart teknikler kullanılarak ^8-9 tam hücre voltaj sıkıştırma kayıtları yapın.

4. İki foton Mikroskopi

1. 5 mM Oregon Yeşil içeren% 0.9 serum fizyolojik hazırlayın488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium bir tuzu; Invitrogen, Almanya).
2. Duyusal epitel yukarıdan engelsiz sağlamak; hala batık ise, filtre kağıdı küçük bir parça (Millipore, Almanya 4X4 mm, kalın 0.8 mikron) üzerine "de çatılı" yarı-sağlam üçlü hazırlık yerleştirin.
3. Sentetik kalsiyum 5 mM'lik bir çözeltisi bir başka 5 ul ile filtre kağıdı ve hazırlık bir puls jeneratörü ve bir geniş-bant amplifikatörünün kombinasyonundan oluşan bir Electroporator arasında tuzlu su kaplı taban platin elektrot (7 ul) üzerine ve kapağın aktarma Gösterge boya Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 (Şekil 4).

Şekil 4. Toplu elektroporasyon. A. elektroporasyon yapılandırmasının şematik bir enine kesitini göstermektedir. Yarı sağlam hazırlanması (*) kalsiyum DY batırılır filtre kağıdına yerleştirilirE (Oregon Green 488 BAPTA-1) ve akım 2 platin elektrot arasında uygulanmaktadır. Briggman ve Euler 2011 ¹⁰ uyarlanmıştır.

4. Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 çözümü yapılır ile irtibata geçtiğinizde hazırlanması yönünü bozmak için dikkatli olmak, yaklaşık 2 mm bir mesafede taban elektrot ile üst platin elektrot paralel getirin.
5. ^10-11; hazırlanması (+13 V, 10 msn darbe genişliği, 1 Hz frekans, 10 kare dalga darbe akım için Parametreler) arasında kısa bir akım darbe Min.
6. L-15 ortamı ile doldurulmuş bir dipli cam kayıt odasının alt kısmında, yine duyu epitel yukarıda engelsiz olması sağlanmış, bunun üzerine silikon yağı ve pozisyon yarı sağlam hazırlanması küçük bir dab yerleştirin. (Noktası 2.13 bakınız) yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme boyunca istikrarı sağlamak için, hazırlanması üzerinde naylon ızgara değiştirin.
7. Iki foton mikroskop kullanılarak spontan optik kayıt yapmakstandart görüntüleme protokolleri ^10-11 kullanarak duyusal epitel (Şekil 7) neous kalsiyum aktivite.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Vestibüler saç hücrelerinin elektrofizyolojik özellikleri onlar ⁷ gömülü olduğu dahilinde kompleksin mikromimarisine bağlıdır. Yarı sağlam vestibüler epitel hazırlanması türü arasında ayırt etmek için kullanılabilir, Şekil 5'te de görüldüğü gibi bir saç hücreleri (Şekil 5A), tip II saç hücreleri (Şekil 5B) ve çanak birincil aferent (Şekil 5C) karakteristik tam hücre iletkenlikleri dayanmaktadır. Bu ö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Denge duygumuzu altında yatan mekanizmaları diğer duyu sistemleri ile karşılaştırıldığında sınırlı dikkat aldık, görsel ve işitsel sistemleri gibi. Vestibüler veya denge fonksiyonu değişiklikleri araştırdık çalışmaların, en denge-vestibüler saç hücrelerinin kendilerini temel yapı taşlarından eksik bilgi ile, vestibülookuler refleks dahil olmak üzere davranışsal tedbirler odaklanmıştır. Kendi ana ortamdan kaldırılır akut izole saç hücreleri kullanarak bunu saç hücre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Two-photon microscope	Olympus/La Vision	BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
InstraTECH A-D converter	HEKA	ITC-18
Sutter Micromanipulator	Sutter	MP-225/M
multiclamp amplifier	Axon Instruments	700B
Data acquisition software (electrophysiology)	Axograph	N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon)	Max Planck innovation	N/A