الحصول على عينات مع تباطأ، وتسارع الشيخوخة في عكس عسل النحل النموذجي

Summary

في العمال عسل النحل، والشيخوخة يعتمد على السلوكيات الاجتماعية بدلا من التركيز على العمر الزمني. نحن هنا تظهر الكيفية أنواع عامل مع أنماط مختلفة جدا الشيخوخة ويمكن الحصول على وتحليلها لالشيخوخة الخلوية.

Abstract

مجتمعات الحيوانات الاجتماعية للغاية تتميز الاختلافات الشاسعة بين الأفراد عمر ترتبط ارتباطا وثيقا. بين الحشرات الاجتماعية، وعسل النحل هو النموذج الأفضل الذي أنشئ لدراسة كيفية شرح اللدونة في عمر الشيخوخة وبعوامل اجتماعية.

طبقة عاملة نحل العسل النحل يشمل ممرضة، والتي تميل الحضنة، والمؤن النحل، الذي جمع الرحيق وحبوب اللقاح. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن وظائف المخ وأداء الطيران senesce بسرعة أكبر مما كانت عليه في علافات في الممرضات. ومع ذلك، يمكن استعادة وظائف المخ، وعندما تعود علافات إلى مهام التمريض. وترتبط هذه الأنماط من تسارع الشيخوخة وعكس الوظيفية لمستويات الموارد التمثيل الغذائي المتغيرة، إلى تغييرات في وفرة البروتين وظيفة المناعة. Vitellogenin، وهو بروتين صفار مع وظائف التحكم في تكييفها الهرمونية والدفاع الخلوية، قد تكون بمثابة عنصر التنظيمية الرئيسية في الشبكة التي تتحكم في ديناميات مختلفة في الشيخوخة العمال.

نحن هنا تصف كيف يمكن رصد ظهور الممرضات وعلافات، والتلاعب بها، بما في ذلك من انعكاس علافات قصيرة الأجل عادة إلى الممرضات الأطول عمرا. تظهر النتائج بممثل كيف يمكن للأفراد مع العمر الزمني مماثلة تفرق في علافات وممرضة النحل تحت ظروف تجريبية. نحن تجسد كيفية انعكاس السلوكية من علافات إلى الممرضات يمكن التحقق من صحتها. مشاركة، وتبين لنا كيف يمكن تقييم مختلف الشيخوخة الخلوية عن طريق قياس تراكم يبوفوسين، العلامات البيولوجية العالمية من الشيخوخة.

لدراسة الآليات التي قد تصل التأثيرات الاجتماعية والشيخوخة اللدونة، ويوفر هذا البروتوكول أداة موحدة لتعيين اكتساب مادة العينة ذات الصلة، وتحسين قابلية البيانات للمقارنة بين الدراسات المستقبلية.

Introduction

تتم المحافظة على الهياكل المعقدة مستعمرة من الحيوانات الاجتماعية للغاية من خلال التفاعل بين طائفة الإنجابية، والطبقات المساعد من عادة العمال غير استنساخ مع السلوكيات المهمة الاجتماعية المختلفة. في عامل مختلف، والتكييف فسيولوجية معينة تمكين السلوكيات الرعاية السيب متميزة، وترتبط أيضا إلى الاختلافات عمر المدقع. نحل العسل والفئران الخلد تمثل أفضل النماذج الحيوانية المتقدمة لدراسة كيفية ارتباط السلوك الاجتماعي لأنماط المعجل، لا تذكر أو عكس الشيخوخة ^1-3.

في مستعمرات نحل العسل، ويساعد على وضع البيض ملكة واحدة من قبل الآلاف من العمال التي تميل الحضنة، يبحثون عن الطعام، والدخول فى حراسة، أو السلوكيات الصحية الحراري ^4. بين هؤلاء العمال هي علافات قصيرة الأجل للغاية، والنحل ممرضة مع وسيطة، وفصل الشتاء (diutinus) النحل مع أعمار أطول. الأفراد، ومع ذلك، ليست ملزمة بشكل دائم إلى بعض التعليم الجامعيمن نوع rker، ولكن عرض تطور الجنين السلوكية مرنة: يغيروا من سلوك واحد مهمة اجتماعية إلى أخرى ("الطبقات الزمنية"). يمكن كالو النحل تغيير الحضنة تميل ممرضة النحل والتي في النهاية قد تتغير إلى البحث عن الطعام خارج. ومع ذلك، يمكن كالو عش النحل أيضا تتحول إلى شتاء النحل الأطول عمرا، ويمكن علافات لم يدم طويلا حتى تعود إلى الممرضات عادة الأطول عمرا. وقد العمال مع المدقع (الشتاء النحل) والمتوسطة (ممرضة النحل) عمر متطورة لإنتاج وتخزين المواد الغذائية مع الأجهزة موارد وفيرة - على عكس علافات قصيرة الأجل (إعادة النظر في ^1،5). مع ذلك، أن تنظيم عمر الفرد يتجاوز تغييرات بسيطة في توازن الموارد الفرد تطرحها البحوث على بروتين البيض، التي لها وظائف تكييفها متنوعة في العامل الطبقي غير التكاثر، مثل إنتاج هلام ^6، التحكم الهرموني ^7، المناعة ⁸ ومضادة للأكسدة الدفاع ^9.

أنماط وانخفاض unctional (الشيخوخة) الفوارق بين عمر المرآة العمال، كما أنشئت لحاسة الشم، وأيضا للمخ أو السيارات وظائف أخرى ^10-13. على وجه التحديد، وانخفاض كبير في التعلم وظيفة بعد أسبوعين فقط من العلف مباريات متوالية وفيات مماثلة في علافات ^14، في مقابل عدم وجود انخفاض كشفها (الشيخوخة ضئيلة) في النحل عاش فترة طويلة في فصل الشتاء ^15.

للتعرف على البصمات الجزيئية من الشيخوخة مرنة تتكيف نحن النماذج التجريبية المنشأة التي تسمح لرصد والتلاعب الشيخوخة من نوع التحولات ^8،16،17. تجربة 1 تفاصيل كيفية الحصول على العينات التي آثار العمر الزمني ونوع عامل السلوكيات الاجتماعية محددة بشأن الشيخوخة يمكن فصلها. تجربة 2 يصف عكس علافات مع تسارع في النحل ممرضة مع ديناميات الشيخوخة تباطأ. التجربة 3 توفر نهجا لبحث آثار الشيخوخة الخلوية بواسطة التشريحيةل الكمي من العلامات البيولوجية المحددة للشيخوخة الخلوية (يبوفوسين) ^18.

Protocol

1. فصل الشيخوخة من العمر الزمني

يصف هذا القسم الإعداد من المستعمرات الفوج المزدوج، والتي تتكون من لفيف من الأفراد المحددة التي تشترك في نفس العمر الزمني ("الفئة العمرية واحدة")، وفوج من عش النحل. والأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين نفسها من الفئة العمرية فصل واحد في نهاية المطاف إلى مختلف أنواع العمال ومع ديناميات الشيخوخة المختلفة - وهذه هي ممرضة النحل مع النحل تباطأ وعلافات مع انخفاض الوظيفية متسارعة. يتم وصف كل الإجراءات لمستعمرة تجريبية واحدة. ونحن ننصح، ولكن، لإجراء تجارب لمدة سنتين على الأقل مستعمرة مكررات بحيث الآثار مستعمرة يمكن التحكم ل(يومين تكرار التصميم).

1. إعداد صناديق خلية للمستعمرات الفوج مزدوجة: إعداد مربع واحد العادية الخلية الذي يتلقى اثنان أمشاط الطعام مع العسل والغذاء مشط آخر مع حبوب اللقاح، واثنين من أمشاط فارغة. تأكد من تحديد موقع ملكة تزاوج وكذلك مستعمرة المانحة مع أكثر من 3،000النحل العش. وسيتم عرض كل من في وقت لاحق (1.3).
2. وبمناسبة الحصول على الأفراد مع العمر الزمني مماثلة: جمع أمشاط مع الحضنة المختومة التي هي على وشك الظهور. للمرء أن يتوقع تكرار لجمع أمشاط مع ما مجموعه 3،000-5،000 خلايا الحضنة المغطاة. لكل تكرار استخدام كمية متوازنة من الحضنة من ثلاثة على الأقل من مصادر مختلفة خلية لتجنب توزيعات منحرفة من المورثات الأمهات (الأصل خلية).
   1. وضع أمشاط الحضنة في حاضنة تعيين إلى 34 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 60-70٪. تأكد لتخزين أمشاط في مثل هذه الطريقة التي الحضنة الناشئة لا يمكن الفرار.
   2. دعونا نحل الظهور لمدة يومين وبمناسبة هذه النحل مع علامة الطلاء صغيرة على الصدر (مثل يوني POSCA، شركة ميتسوبيشي المحدودة قلم رصاص). سوف علامة الطلاء تسمح بتحديد النحل من الفئة العمرية احد (يوم ظهور)، وتمييزها عن غيرها من المستعمرات تكرار.
3. إنشاء مستعمرة الفوج المزدوج الذي يضم الفوج طdentified، واحدة النحل العمر: في اليوم اتسمت النحل الصغير، وجمع حوالي 2،500-3،000 النحل عش من مستعمرة المانحة (قارن القسم 1 في مناقشة.)، وإضافة هذه النحل لا تحمل علامات إلى مربع الخلية التي أعدت قبل (انظر الخطوة 1.1). فإن الأفراد الأخير تشكل عش النحل الفوج مجهولين.
   1. إضافة ملكة، والتي سوف تكون محصورة في البداية إلى قفص الملكة (متوفرة تجاريا). ختم القفص مع الحلوى صالحة للأكل (مثل Apifonda، Südzucker AG، مانهايم / Ochsenfurt، ألمانيا) لجعل الشغالات الافراج ببطء الملكة.
   2. إضافة النحل ظهرت حديثا وتميز، والتي سوف تشكل الفئة العمرية واحدة. هذه النحل هي علامة الأفراد فقط، وهما مجموعة التركيز لكافة الخطوات التالية.
4. مراقبة تستخدم علفا بداية ووسم علافات: تقييم وظهور ديناميات التحول ممرضة إلى المؤن في الفئة العمرية احدة، ورصد تطور الديموغرافية النشاط تستخدم علفا هاليوم الآخر جدا لكل مستعمرة. بدء العد خمسة أيام بعد أن تم تعيين ما يصل المستعمرات (الشكل 1).
   1. عد عدد من النحل العائدين من رحلات البحث عن الطعام (التهم المدخل) في غضون 3 × 20 دقيقة فترات المراقبة في أوقات محددة. تأكد من أن لا تعول النحل خلال فترات الرحلات الجوية التوجه (انظر مناقشة).
   2. عندما تشير التهم مدخل النشاط تستخدم علفا كبيرة لبدء (> 100 التهم مدخل / يوم)، وتبدأ علامات علافات. للقيام بذلك، علافات من الفئة العمرية احد (الأفراد ملحوظ واحد) يحصل على علامة الطلاء الثاني عند عودته من رحلات البحث عن الطعام هم أولى. وهذا دهان علامة تحديد يوم من بداية البحث عن الطعام، وسوف تسمح في وقت لاحق لتحديد سن تستخدم علفا للكل المؤن.
   3. تكرار علامات يوميا حتى تم وضع علامة على عدد كاف من النحل. لتقدير عدد كاف من علافات ملحوظ، ونتوقع معدل استرجاع ما لا يزيد عن 5-10٪ بعد أن تم سن هذه النحل، وعادة بعد 14 يوما منتستخدم علفا.
5. أخذ العينات: وبما أن جميع النحل ملحوظ في البداية يكون لها العمر الزمني مماثلة، مجموعات العمر المتطابقة من الممرضات وعلافات القديمة يمكن جمعها في وقت واحد، عندما جابوا علافات ل≥ 14 يوما.
   1. يتم جمع واحد ممرضة النحل ملحوظ داخل الخلية، ويتم تحديدها من قبل السلوك التمريض (تغذية وتنظيف اليرقات مع رؤساء اخماد في خلايا الحضنة المفتوحة).
   2. يتم جمع علافات علامة مزدوجة أيضا داخل الخلية قبل أن يبدأ النشاط العلف اليومي.
   3. جمع النحل في أقفاص (أنابيب، مربعات) التي توفر تهوية كافية، والحفاظ على الظلام حتى مزيد من المعالجة. بدلا من ذلك، لtranscriptomic، جينية أو دراسات البروتين، والمفاجئة مباشرة النحل تجميد في النيتروجين السائل. جمع أعداد متوازنة من الأفراد من جميع الفئات الاختبار وتكرار المستعمرات.

2. عكس العمال ذوي السريع إلى العمال ذوي الشيخوخة تباطأ بواسطة تغيير الديموغرافيا خلية النحل في

هذه التفاصيل القسم كيفية يتم تنفيذ انقلاب من العمال مع الشيخوخة المتسارعة (علافات) للعاملين مع الشيخوخة تباطأ (ممرضة النحل). وبفعل هذا الانعكاس السلوكي، عندما تواجه علافات عدم وجود ممرضة النحل، التي تشارك عادة في مجال الرعاية الحضنة. فإن الإجراء الارتداد فصل مستعمرة واحدة تكرار إلى قسمين خلايا: خلية واحدة مع جزء ممرضة النحل ("المشتقة من ممرضة")، وآخر واحد مع جزء المؤن ("المشتقة من المؤن"). بعد انقلاب ناجح، وأعراض ممكن من البلاستيك وعكس الشيخوخة يمكن دراستها في هذه الفئة العمرية واحد مع العمال عادت، علافات المستمر، واستمرار ممرضة النحل وعلافات المعينين حديثا. كما كان من قبل، والنحل التي تم تحديدها من الفئة العمرية واحدة، وليس فوج من عش النحل مجهولة الهوية، تشكل مجموعة التركيز التجريبية.

1. إعداد: تكرار خلايا مع الممرضات (واحد علامة) وعلافات (علامة مزدوجة) تتاح كما هو موضح في القسم السابق. تأكد من أن لا تبدأ مع الارتداد أقل من 500 علافات ملحوظ في تكرار مستعمرة لضمان استرجاع كافية بعد أن تم الانتهاء من الارتداد.
   1. لآمنة وتحديد مجموعات الاختبار بعد انعكاس فمن الأهمية بمكان أن السكان المؤن كامل في الخلية الأصلية تميزت من قبل الارتداد. يوصف الإجراء التالي لتكرار واحد.
   2. قبل يوم من الارتداد، وإعداد مربع واحد إضافي خلية لخلية المستمدة من المؤن (انظر الخطوة 1.1). تحديد موقع اثنين من الملكات واثنين من أمشاط من خلايا الحضنة المانحة. قبل نقلها إلى المستعمرات التجريبية فرشاة بعيدا عن النحل الكبار من هذه أمشاط. واحد في قفص الملكة (انظر الخطوة 1.3) واحد مشط الحضنة تحل محل الملكة والحضنة أمشاط في المربع خلية الأصلي. مجموعة أخرى من الملكة والحضنة المشط سيتم استخدامها في اليوم التالي لمربع خلية جديدة. تخصيص مماثلة من أمشاط الحضنة والملكات الجديدة الغريبة على حد سواء، الأصلي وينصح خلية جديدة للتأكد من أن علافات فصل وممرضةو سوف بالتساوي تجربة غيرت العظة الخلية ("رائحة الخلية").
2. الارتداد: في الصباح، قبل الارتداد، إضافة ملكة في قفص والمشط الحضنة إلى مربع جديدة من شأنها أن تلقي جزء المستمدة من المؤن. الانتظار حتى يبدأ وقت الذروة تستخدم علفا. ثم نقل مستعمرة الأصلي مع علافات ملحوظ وممرضة النحل لا يقل عن 100 متر من الموقع الأصلي.
   1. في الموقع الأصلي، وإنشاء مربع جديدة للخلية المستمدة من المؤن مع الحضنة والملكة فقط.
   2. سوف علافات ترك بخلع مربع الخلية الأصلية، والتوجه مرة أخرى إلى الموقع الأصلي. تسمح علافات للعودة إلى الموقع الأصلي لمدة 2 ساعة من أجل تحقيق المقبل لاستكمال الفصل بين السكان المؤن من عش النحل.
   3. ثم، لإنهاء الانفصال، تغلق الأصلي، والآن "المشتقة من ممرضة" خلية، وتحويلها إلى المنحل لا يقل عن 3 كم.
3. صيانة الخلية ورصد لمهمة اجتماعية ناجحةالانعكاس: التحقق من خلايا التجريبية بانتظام لصحية، الحضنة المفتوحة.
   1. خلال الأيام الأولى بعد التلاعب مستعمرة استبدال الحضنة غير المراقب والقتلى للحد من الحمل الممرض المحتملة.
   2. للتحقق من صحة انعكاس ناجحة داخل الخلية المستمدة من المؤن، والتقاط صور من أمشاط حضنة قبل إدخال هذه، ومرة أخرى عندما يتم استبدال أمشاط أو عند اكتمال التجربة الارتداد (الشكل 2). المناطق التي لم يسبق لهم اللعب الحضنة سابقا ومع فتح، الحضنة الحية هي علامات يمكن الاعتماد عليها من النشاط التمريض في المستعمرات المستمدة من المؤن.
4. تم فصل التأثيرات الفسيولوجية التي تصاحب عكس الاجتماعية يمكن أن يتم الكشف عن 3-8 أيام بعد علافات والممرضات: أخذ العينات.
   1. ونحن ننصح أخذ عينات اختبار جميع الفئات والعمال أي عاد وعلافات المستمر (المشتقة من خلية المؤن)، فضلا عن استمرار الممرضات وعلافات المعينين حديثا (المشتقة من خلية ممرضة) 8 أيام بعد بدء الانعكاس.
   2. عمودعينات lect الأول كما هو موضح في الخطوة 1.5.

3. تحليل العمالي نوع أنماط محددة من قبل الشيخوخة الخلوية الكمي ليبوفوسين

يبوفوسين هي العلامات البيولوجية العالمية من الشيخوخة الخلوية. كمنتج تراكم الجوهرية، تألق ذاتي يبوفوسين المحددة _{(الحد الأقصى} = 530-650 الانبعاثات نانومتر) يمكن استخدامها للكشف عن ^18.

1. تشريح والتثبيت: النحل البرد على الجليد حتى بلا حراك، وإزالة وتشريح عينات الأنسجة المطلوب.
   1. نقل إلى تثبيتي (4٪ بارافورمالدهيد في الفوسفات مخزنة المالحة، PBS، ودرجة الحموضة 7.2) لحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   2. غسل العينات 3 مرات في برنامج تلفزيوني.
2. معالجة الأنسجة وتركيب: قطع عينات الأنسجة إلى أقسام مع ما لا يزيد عن 40 ميكرون سمك، على سبيل المثال باستخدام شفرة مشراح تهتز، مثل لايكا VT 1000S (لايكا النظم البيولوجية، Nussloch، ألمانيا).
   1. للمقاصة، واحتضان أقسام الأنسجة بين عشية وضحاها في 30٪ الجلسرين (PBS)، وآخر في 2 ساعة 50٪ الجلسرين (PBS).
   2. جبل على الشرائح المجهرية المقاطع في 50٪ الجلسرين (PBS). لختم التخزين الطويل الأجل غطاء ينزلق بطلاء الأظافر.
3. الحصول على الصور: للكشف عن يبوفوسين، نقترح باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر التي توفر خطوط ليزر مع λ = 514، 561nm أو ما شابه ذلك لإثارة، ومع عرض النطاق الترددي للكشف عن تعيين 570-650 نانومتر.
   1. لتحديد أفضل ليبوفوسين، وتشمل قناة الثانية، والقيام بمسح في وقت واحد في أقصر طول موجي الأطياف (الإثارة = 405 نانومتر؛ الانبعاثات = 410-450 نانومتر). فإن قناة الطول الموجي الأطول تكشف كليهما، يبوفوسين الحبيبية، ولكن أيضا غير محددة "الخلفية" بسبب القصبة الهوائية autofluorescent والهياكل غير الحبيبية الأخرى. والثانية، وأقصر طول موجي قناة تكشف فقط تألق ذاتي غير محددة، ولكن ليس يبوفوسين. وبالتالي، يمكن تحديد يبوفوسين يكون facili tated بمقارنة إشارات في كل القنوات، مع واحد منهم فقط الكشف عن حبيبات مع مضان محددة يبوفوسين.
   2. لاقتناء صور عالية الدقة تستخدم مع الهدف 40X التكبير أو أعلى، ويفضل أن يكون الفتحة العددية 1.25 أو أعلى. صورة مسح مداخن مع أبعاد حوالي 100 × 100 × 10 ميكرون ^3. لديها كل عينة الفردية والأنسجة لتكون ممثلة من قبل عدة مداخن الصورة.
   3. للحد من التباين داخل الفرد وبين الفرد الناجمة عن اختلاف التقنية، والحفاظ دائما قوة الليزر للكشف عن الحساسية وثابتة.
   4. للحد من التحيز من قبل اليومية الاختلافات التقنية تفحص أرقام عينة متساوية من جميع الفئات في كل اختبار من عدة دورات المسح.
4. معالجة الصور: استخدام حزم البرمجيات التي تسمح مع وحدات المعالجة المتقدمة لمن مداخن صورة مجهرية، على سبيل المثال يماغيج (المعاهد الوطنية الأميركية للصحة في بيثيسدا، ميريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية،gej.nih.gov / ط / "الهدف =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. توليد أقصى الإسقاط 2D لكل من مداخن صورة 3D.
   2. تطبيق عامل تصفية غاوس مع حجم متواضعة نواة من أجل تخفيف الضوضاء عالية التردد، والحفاظ على الهياكل ذات أبعاد حبيبات يبوفوسين.
   3. دمج كل قنوات اللون لتسهيل تحديد يبوفوسين (انظر الخطوة 3.2).
5. يحلل الصورة: تأكد من أن موضوع تنفيذ الخطوات الكمي سوف تكون عمياء لاختبار هوية المجموعة.
   1. لجميع الصور عليك أولا أن تختار المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي يغطي الهياكل ذات الصلة، ولها أبعاد مماثلة لرويس من الصور الأخرى.
   2. ثم حدد العدد المطلوب من حبيبات يبوفوسين التي تمثل كل العائد على الاستثمار. عند اختيار حبيبات يبوفوسين ضمن عائدات الاستثمار، وتطبيق القواعد التالية الحد من التحيز الذاتي.
      1. اختيار موقع ثابت لاختيار granu الأولىجنيه. هذا يمكن أن يكون، على سبيل المثال، فإن أقصى اليسار حافة العائد على الاستثمار، والحبيبية وهذا هو الأقرب إلى حافة تكون دائما الاختيار الأول.
      2. واحدا تلو الآخر، ويتم اختيار حبيبات التي هي الأقرب إلى التحديد السابق (الجار التالي).
      3. عند اختيار الجار المقبل، تتحرك إلا في اتجاه واحد، على سبيل المثال فقط البحث اليمنى من التحديد السابق. هذه القاعدة يمنع أن اختيار تهيمن عليها مجموعات عرضية من حبيبات المزدحمة بالسكان.
      4. عند اكتمال اختيار وتقييم حجم كل الجسيمات يبوفوسين من خلال تحديد وقياس منطقة الحبيبية منها. استخدام الاختبارات الإحصائية المناسبة لمقارنة الأفراد من مجموعات اختبار مختلفة.

النتائج

أقسام بروتوكول 1 و 2 بالتفصيل كيف يمكن الحصول على مجموعات اختبار لدراسة سمات تسارع، تباطؤ وعكس الشيخوخة في المستعمرات مع الفئة العمرية واحدة. لمراقبة من نوع عامل التمايز الذي يصاحب تطور الجنين الطبيعي قمنا بتقييم التهم المؤن ("مدخل التهم") لمدة 6 مستعمرات (ال?...

Discussion

نحن هنا تعتمد سابقا وصف نهج ^{8،16،17،19،20،} ودمجها في سير عمل واحد من شأنها أن تسهل دراسة الشيخوخة مرونة في نحل العسل. هدفنا هو توفير العلماء التي هي المبتدئ في هذا المجال مع أداة موحدة تحدد للحصول على مواد العينة ذات الصلة، وتحسين استنساخ التجارب بين الفرق البحثية ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000