Obtenir des échantillons avec ralenti accéléré et inversé vieillissement dans le Honey Bee Modèle

Résumé

Chez les travailleurs d'abeilles, le vieillissement dépend de comportements sociaux plutôt que sur l'âge chronologique. Ici, nous montrons comment les travailleurs-types avec des modèles très différents de vieillissement peuvent être obtenues et analysées pour la sénescence cellulaire.

Résumé

Sociétés d'animaux très sociaux disposent de grandes différences de durée de vie entre les individus étroitement liés. Chez les insectes sociaux, l'abeille est le meilleur modèle créé pour étudier la façon dont la plasticité dans la durée de vie et le vieillissement s'explique par des facteurs sociaux.

La caste des travailleurs des abeilles comprend nourrices, qui tendent le couvain et les abeilles butineuses, qui recueillent le nectar et le pollen. Des travaux antérieurs ont montré que les fonctions du cerveau et de la performance de vol sénescence plus rapidement dans les butineuses que chez les infirmières. Toutefois, les fonctions du cerveau peuvent récupérer, lorsque les butineuses reviennent à des tâches de soins infirmiers. Ces modèles de sénescence accélérée fonctionnelle et inversée sont liés aux niveaux de ressources métaboliques modifiées, à des altérations de la protéine abondance et de la fonction immunitaire. Vitellogénine, une protéine de jaune avec des fonctions adaptées à contrôle hormonal et de défense cellulaire, peut servir d'élément de régulation important dans un réseau qui contrôle les différentes dynamiques du vieillissement chez les travailleurs.

Ici, nous décrivons comment l'émergence d'infirmières et de butineuses peut être surveillé et manipulé, y compris la reprise de butineuses généralement de courte durée dans les infirmières de plus longue durée. Nos résultats représentatifs montrent comment les individus avec un âge chronologique se différencient en butineuses et nourrices dans des conditions expérimentales. Nous illustrons comment inversion comportementale de butineuses dos des infirmières peut être validé. Enfin, nous montrons comment les différents sénescence cellulaire peut être évaluée en mesurant l'accumulation de lipofuscine, un biomarqueur universel de la sénescence.

Pour étudier les mécanismes qui peuvent lier les influences sociales et vieillissement plasticité, ce protocole fournit un outil standardisé mis d'acquérir du matériel de l'échantillon concerné, et d'améliorer la comparabilité des données entre les études futures.

Introduction

Les structures de la colonie complexes des animaux très sociaux sont maintenus grâce à l'interaction d'une caste de reproduction, et une caste d'aide de typiquement travailleurs non-croisements avec des comportements différents de la tâche sociale. Dans les différentes catégories de travailleurs, des adaptations physiologiques spécifiques permettent des comportements de soins de sib distinctes, et sont également liés à des différences de durée de vie extrêmes. Les abeilles et les rats-taupes représentent modèles animaux les mieux développés pour étudier comment la socialité est liée à des motifs de l'accélération, négligeable ou inversé vieillissement ^1-3.

Dans les colonies d'abeilles, une seule reine de ponte est assisté par des milliers de travailleurs qui tendent le couvain, le fourrage pour la nourriture, et de s'engager dans la garde, la thermorégulation ou comportements d'hygiène ^4. Parmi ces travailleurs sont les butineuses très courte durée de vie, nourrices avec intermédiaire, et l'hiver (diutinus) abeilles avec une durée de vie plus longue. Les individus, cependant, ne sont pas liées de façon permanente à une certaine wode type rker, mais afficher une ontogenèse du comportement souple: ils changent de comportement de la tâche sociale à l'autre («castes temporelles»). Abeilles Callow peuvent changer à couvain tendant nourrices, qui a finalement peut changer à la recherche de nourriture à l'extérieur. Cependant, les abeilles inexpérimenté de nidification peuvent aussi se transformer en abeilles d'hiver la plus longue durée de vie, et les butineuses de courte durée peuvent même revenir en infirmières généralement de plus longue durée. Les travailleurs avec une extrême (abeilles d'hiver) et intermédiaire (nourrices) durée de vie ont bien développé production et de stockage organes alimentaires avec des ressources abondantes - par opposition à butineuses de courte durée (examinés dans ^1,5). Cependant, que la réglementation de la durée de vie individuelle va au-delà de simples changements dans l'équilibre d'une personne ressource est suggéré par les recherches sur une protéine de jaune, qui a des fonctions adaptées divers dans la non-reproduction travailleur caste, comme la production de gelée ^6, contrôle hormonal ^7, immunitaire ⁸ et anti-oxydant défense ^9.

Les modèles de fbaisse unctional (sénescence) des disparités miroir de la durée de vie chez les travailleurs, établie pour olfactif, et aussi pour d'autres fonctions cérébrales ou motrices ^10-13. Plus précisément, la baisse significative de la fonction d'apprentissage après seulement deux semaines de recherche de nourriture correspond à une progression de la mortalité similaire dans butineuses ^14, par opposition à l'absence de baisse détectable (sénescence négligeable) des abeilles ¹⁵ hiver longue durée de vie.

Pour identifier les empreintes moléculaires du vieillissement souple, nous avons adapté paradigmes expérimentaux établis qui permettent de surveiller et de manipuler des transitions de type vieillissement ^8,16,17. Expérience 1 détails la façon d'obtenir des échantillons dans lesquels les effets de l'âge chronologique et comportements sociaux spécifiques de type travailleur sur le vieillissement peuvent être séparés. Expérience 2 décrit le renversement des butineuses avec accélérées dans les nourrices avec la dynamique de vieillissement ralentis. Expérience 3 propose une approche pour sonder les effets de la sénescence cellulaire par anatomical quantification d'un biomarqueur établi pour le vieillissement cellulaire (lipofuscine) ^18.

Protocole

Une. Le découplage de la sénescence âge chronologique

Cette section décrit la configuration des colonies de la double cohorte, qui consistent d'une cohorte d'individus identifiés qui partagent le même âge chronologique («cohorte d'âge unique") et une cohorte d'abeilles nid. Les personnes âgées de même de la cohorte d'âge unique finiront par se séparer en différents types de travailleurs ayant des dynamiques du vieillissement - ce sont les nourrices avec des abeilles butineuses ralenti et avec le déclin fonctionnel accéléré. Toutes les procédures sont décrites pour une colonie expérimentale. Nous vous conseillons cependant, d'effectuer des expériences pour au moins deux répétitions colonie de sorte que les effets de la colonie peuvent être contrôlés pour (deux répliquée-conception).

1. Préparation des boîtes de ruche pour les colonies de la double cohorte: Préparez une boîte régulière de ruche qui reçoit deux peignes alimentaires avec du miel, un autre peigne alimentaire avec du pollen, et deux rayons vides. Assurez-vous de trouver une reine fécondée ainsi qu'une colonie de donateurs de plus de 3000abeilles nid. Les deux seront introduits plus tard (1.3).
2. L'obtention et le marquage des individus avec l'âge chronologique similaire: Recueillir peignes avec couvain operculé qui est sur ​​le point d'émerger. Pour une répétition s'attendre à recevoir des peignes avec un total de 3000-5000 cellules de couvain. Pour chaque répétition utiliser une quantité équilibrée de couvain d'au moins trois sources différentes ruches pour éviter les distributions asymétriques de génotypes maternels (origine ruche).
   1. Placez couvain dans un incubateur réglé à 34 ° C avec 60-70% d'humidité relative. Assurez-vous de stocker des peignes de telle manière que couvain naissant ne peut pas s'échapper.
   2. Laissez les abeilles sortent pendant deux jours et marquent ces abeilles avec une petite étiquette de peinture sur le thorax (par exemple POSCA Uni, Mitsubishi Pencil Co. Ltd). La marque de peinture permettra d'identifier les abeilles de la cohorte d'âge unique (jour de l'émergence), et de les distinguer des autres colonies répétés.
3. Mise en place d'une colonie de la double cohorte, qui comprend la cohorte de identified, les abeilles d'âge unique: Le jour de jeunes abeilles ont été marqués, recueillent environ 2500-3000 abeilles de nidification d'une colonie de donateurs (comparer l'article 1 dans la discussion.), et ajouter ces abeilles non marquées à la boîte de ruche qui a été préparé avant (voir l'étape 1.1). Les derniers individus constituent le nid d'abeille non identifié cohorte.
   1. Ajouter la reine, qui sera initialement limité à une cage de reine (disponible dans le commerce). Sceller la cage avec des bonbons comestible (par exemple Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Allemagne) pour faire ouvrières libèrent lentement la reine.
   2. Ajouter les abeilles nouvellement écloses et marqués, qui vont constituer la cohorte d'âge unique. Ces abeilles sont les individus ne marquées, et sont le groupe de discussion pour toutes les étapes suivantes.
4. Suivi recherche de nourriture apparition et butineuses marquage: Pour évaluer l'apparition et de la dynamique de la transition infirmière-fourrier dans la cohorte d'âge unique, de suivre l'évolution démographique de l'activité recherche de nourriture etrès autre jour pour chaque colonie. Commencer à compter les cinq jours suivant colonies ont été créées (Figure 1).
   1. Compter le nombre total d'abeilles revenant de recherche de nourriture des vols (chiffres d'entrée) à moins de 3 x 20 périodes d'observation min à heures fixes. Assurez-vous de ne pas compter les abeilles pendant les périodes de vols d'orientation (voir Discussion).
   2. Lorsque les chiffres d'entrée indiquent l'activité de recherche de nourriture considérable pour commencer (> 100 comptes d'entrée / jour), commencer butineuses marquage. Pour ce faire, les butineuses de la cohorte d'âge unique (individus marqués simples) reçoivent une deuxième marque de peinture au retour de leurs premiers vols de recherche de nourriture. Cette marque de peinture doit préciser le jour de la recherche de nourriture apparition, et permettra d'identifier plus tard l'âge de la recherche de nourriture pour chaque butineuse.
   3. Répétez marques quotidiennes jusqu'à ce qu'un nombre suffisant d'abeilles a été marqué. Pour estimer un nombre suffisant de butineuses marqués, s'attendre à un taux de récupération de plus de 5-10% après ces abeilles avaient été âgés, généralement après 14 jours dela recherche de nourriture.
5. Échantillonnage: Comme toutes les abeilles d'abord marquées ont un âge chronologique, groupes d'infirmières et de vieilles butineuses même âge peuvent être collectées simultanément, lorsque les butineuses ont butiné pour ≥ 14 jours.
   1. Simples nourrices marqués sont recueillies dans la ruche, et sont identifiés par des comportements de soins (alimentation et nettoyage des larves de têtes mises dans des cellules de couvain ouvert).
   2. Butineuses doubles marqués sont également recueillies dans la ruche avant le début de l'activité quotidienne la recherche de nourriture.
   3. Recueillir les abeilles dans des cages (tubes, boîtes) qui fournissent une ventilation suffisante, et garder sombre jusqu'à leur traitement ultérieur. Sinon, pour transcriptomique, protéomique épigénétique ou études, calées abeilles de congélation dans l'azote liquide. Collecter des numéros équilibré des individus de tous les groupes d'essai et de reproduire colonies.

2. Reprise des travailleurs avec Rapid de travailleurs avec le vieillissement ralentie par l'évolution démographique de la Ruche

Cette section détaille la façon dont la reprise de travailleurs avec un vieillissement accéléré (des butineuses) aux travailleurs avec le vieillissement ralenti (infirmières des abeilles) est effectuée. Cette inversion de comportement est induit, lorsque les butineuses face à un manque de nourrices, qui exercent normalement dans les soins du couvain. La procédure de réversion sera séparer une seule colonie répliquer dans deux ruches: une ruche avec la fraction infirmière d'abeille («infirmière-dérivé"), et une autre avec la fraction de butineuse ("butineuse dérivés"). Après inversion réussie, les symptômes possibles de plastique et de vieillissement inversé peuvent être étudiés dans la cohorte d'âge unique des travailleurs rétrocédés, les fouilleurs continue, continue nourrices et butineuses nouvellement recrutés. Comme avant, les abeilles identifiés de la cohorte d'âge unique, pas la cohorte des abeilles nid non identifiés, constituent le groupe de discussion expérimental.

1. Préparation: Répliquer ruches avec des infirmières (seul marqué) et butineuses (double marquée) sont mis à disposition comme décrit dans la section précédente. Assurez-vous de ne pas commencer la réversion de moins de 500 butineuses marqués par répétition colonie pour assurer la récupération suffisante après le retour a été achevée.
   1. Pour une identification sûre des groupes d'essai après l'inversion, il est essentiel que l'ensemble de la population de butineuses dans la ruche d'origine a été marqué avant de réversion. La procédure suivante est décrite pour une répliquée.
   2. La veille de la réversion, préparer un champ de ruche supplémentaire pour la ruche de butineuse dérivés (voir l'étape 1.1). Repérez les deux reines et deux cadres de couvain de ruches donateurs. Avant le transfert vers les colonies expérimentales balayer toutes les abeilles adultes de ces peignes. Une reine en cage (voir l'étape 1.3) et un couvain remplaceront reine et couvains dans la boîte de ruche d'origine. L'autre série de la reine et du couvain peigne sera utilisé le lendemain pour la nouvelle boîte de ruche. Répartition similaire de nouveaux cadres de couvain et les reines exotiques pour les deux, l'original et la nouvelle ruche est conseillé de s'assurer que les butineuses séparés et infirmières aura également l'expérience changé indices ruche ("odeur ruche").
2. Réversion: Dans la matinée, juste avant le retour, ajouter la reine en cage et le couvain à la nouvelle boîte qui recevra la fraction de butineuse dérivés. Attendez jusqu'à ce que l'heure de pointe de recherche de nourriture commence. Puis déplacez la colonie d'origine avec butineuses balisés et nourrices au moins 100 m de l'emplacement d'origine.
   1. À l'emplacement d'origine, mettre en place la nouvelle boîte pour la ruche de butineuse dérivé de couvain et de la reine seulement.
   2. Les butineuses vont quitter la boîte de ruche d'origine luxation, et de retourner à l'emplacement d'origine. Permettre aux butineuses pour revenir à l'emplacement d'origine pendant 2 heures pour atteindre à côté de la séparation complète de la population butineuse des abeilles nid.
   3. Ensuite, pour mettre fin à la séparation, fermer l'original, maintenant "infirmière dérivés" ruche, et transférer à un rucher à moins de 3 km.
3. Entretien ruche et suivi pour tâche sociale réussieinversion: Vérifiez les ruches expérimentales régulièrement pour la santé, couvain ouvert.
   1. Pendant les premiers jours après la manipulation de la colonie remplacer couvain sans surveillance et mort à réduire la charge pathogène potentiel.
   2. Pour valider inversion réussie au sein de la ruche de butineuse dérivés, prendre des photos de rayons de couvain avant l'introduction de ceux-ci, et à nouveau lorsque les peignes sont remplacés ou lorsque l'expérience de réversion est terminée (Figure 2). Zones de couvain précédemment non plafonné et ouvert avec, nichée en direct sont des marqueurs fiables de l'activité de soins infirmiers dans les colonies de butineuses dérivés.
4. Échantillonnage: effets physiologiques qui accompagnent inversion sociale peuvent être détectés 3-8 jours après butineuses et les infirmières ont été séparées.
   1. Nous vous conseillons d'échantillonnage tous les groupes d'essai, les travailleurs à-dire rétrocédés et butineuses poursuivies (ruche de butineuse dérivés), ainsi que les infirmières poursuivies et butineuses nouvellement recrutés (ruche infirmière dérivés) 8 jours après inversion est lancée.
   2. ColLect échantillons comme décrit dans l'étape 1.5.

3. Analyser travailleur de type Patterns de la sénescence cellulaire spécifique par quantification de Lipofuscin

Lipofuscine est un biomarqueur universel de la sénescence cellulaire. En tant que produit d'accumulation intrinsèque, autofluorescence spécifique de lipofuscine (émission _max = 530-650 nm) peut être utilisée pour la détection ^18.

1. Dissection et fixation: abeilles de froid sur la glace jusqu'à ce que immobile; supprimer et disséquer l'échantillon de tissu désiré.
   1. Transférer dans un fixateur (paraformaldéhyde 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate, PBS, pH 7,2) pour une incubation pendant une nuit à 4 ° C.
   2. Lavez échantillons 3 fois en PBS.
2. Transformation de tissus et de montage: Couper des échantillons de tissus en sections avec plus de 40 um d'épaisseur, par exemple en utilisant un microtome à lame vibrante, par exemple Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Allemagne).
   1. Pour la compensation, incuber les coupes de tissus nuit dans 30% de glycérol (PBS), et un autre 2 heures dans 50% de glycérol (PBS).
   2. Montez les sections sur des lames microscopiques dans 50% de glycérol (PBS). Pour sceau de stockage à long terme couvercle glisse avec le vernis à ongles.
3. acquisition de l'image: Pour détecter lipofuscine, nous vous conseillons d'utiliser un microscope confocal à balayage laser qui fournit des lignes laser avec λ = 514, 561nm ou similaire pour l'excitation, et la largeur de bande du détecteur fixé à 570-650 nm.
   1. Pour une meilleure identification de la lipofuscine, inclure un second canal, et faire un scan simultané à des spectres de longueur d'onde plus courte (excitation = 405 nm; émission = 410-450 nm). Le canal de longueur d'onde va révéler à la fois, la lipofuscine granulaire, mais aussi "fond" non spécifique en raison de la trachée autofluorescente et autres structures non granulaires. La deuxième, canal de longueur d'onde plus courte ne révèlera autofluorescence non spécifique, mais pas lipofuscine. Ainsi, l'identification de lipofuscine peut être faci Tated en comparant les signaux dans les deux canaux, avec un seul d'entre eux révéler les granules avec la fluorescence spécifique de la lipofuscine.
   2. Pour l'acquisition d'images à haute résolution utiliser un objectif avec un grossissement de 40X ou plus, et de préférence une ouverture numérique de 1,25 ou plus. Image de balayage cumule avec des dimensions d'environ 100 x 100 x 10 um ^3. Chaque échantillon individuel et le tissu doit être représenté par plusieurs piles d'images.
   3. Pour réduire les variations intra-individuelles et inter-individuelles causée par la variation technique, gardez toujours la puissance du laser et la constante de la sensibilité du détecteur.
   4. Pour réduire les biais par jour le jour les variations techniques numériser un nombre d'échantillons égal de tous les groupes de test dans chacune des plusieurs séances de balayage.
4. Traitement de l'image: Utilisez des logiciels avec des modules qui permettent de traitement avancé des piles d'images microscopiques, par exemple ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Etats-Unis,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Générer une projection maximale 2D pour chacune des piles d'images 3D.
   2. Appliquer un filtre de Gauss avec une taille de noyau modeste afin d'atténuer le bruit à haute fréquence, et de préserver des structures avec des dimensions de granules de lipofuscine.
   3. Fusionner les deux canaux de couleur pour faciliter l'identification de lipofuscine (voir l'étape 3.2).
5. Analyses Image: Assurez-vous que le sujet d'effectuer les étapes de quantification sera aveugle pour tester l'identité du groupe.
   1. Pour toutes les images, choisissez d'abord une région d'intérêt (ROI) qui couvre les structures concernées, et a des dimensions similaires à celles du ROI d'autres images.
   2. Ensuite, sélectionnez le nombre souhaité de granules de lipofuscine qui représentent chaque ROI. Lors de la sélection des granules de lipofuscine dans un retour sur investissement, l'application des règles suivantes sera de réduire le biais subjective.
      1. Choisissez un emplacement cohérent pour sélectionner la première granulationle. Cela peut être, par exemple, le bord le plus à gauche d'un retour sur investissement, et le granulé qui est plus proche du bord sera toujours le premier choix.
      2. Un après l'autre, les granules sont choisis qui sont le plus proche de la sélection précédente (à côté du voisin).
      3. Lorsque vous choisissez le voisin, se déplacer que dans un sens, par exemple que la recherche à droite de la sélection précédente. Cette règle empêche que la sélection est dominé par des groupes occasionnels de granules denses.
      4. Lorsque la sélection est terminée, déterminer la taille de chaque particule de la lipofuscine en exposant et en mesurant la surface des granules respectif. Utilisez tests statistiques appropriés pour comparer les individus des différents groupes de test.

Résultats

sections 1 et 2 du Protocole détail comment les groupes de tests peuvent être obtenus à étudier les attributs de l'accélération, ralenti et inversés vieillissement dans les colonies avec une seule cohorte d'âge. Pour contrôler la différenciation de type travailleur qui accompagne l'ontogenèse normale, nous avons évalué les chiffres butineuses («dénombrements d'entrée») pour 6 colonies (figure 1, comparer section 1). Les graphiques montrent que le changement considérable...

Discussion

Nous adoptons ici approches décrites précédemment ^{8,16,17,19,20,} et les intégrer dans un seul flux de travail qui facilitera l'étude de vieillissement souple chez les abeilles. Notre objectif est de fournir aux scientifiques qui sont novices dans ce domaine avec un outil normalisé fixé pour obtenir du matériel de l'échantillon concerné, et à améliorer la reproductibilité expérimentale entre différentes équipes de recherche. Bien que nos procédures sont simplifiées et ne nécessitent ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000