Ottenere campioni con rallentato, accelerato e invertito l'invecchiamento in Honey Bee Modello

Riepilogo

In lavoratori api, l'invecchiamento dipende comportamenti sociali piuttosto che su età cronologica. Qui vi mostriamo come operaio-tipo con modelli molto diversi di invecchiamento possono essere ottenuti e analizzati per senescenza cellulare.

Abstract

Società di animali altamente sociali presentano grandi differenze di durata della vita tra gli individui strettamente correlati. Tra gli insetti sociali, l'ape è il miglior modello istituito per studiare come la plasticità della durata della vita e l'invecchiamento è spiegata da fattori sociali.

La casta dei lavoratori delle api mellifere comprende api nutrici, che tendono la covata, e bottinatrici, che raccolgono il nettare e polline. Il lavoro precedente ha dimostrato che le funzioni cerebrali e le prestazioni di volo senesce più rapidamente in bottinatrici che in infermieri. Tuttavia, le funzioni cerebrali possono recuperare, quando bottinatrici tornano a compiti di cura. Tali modelli di senescenza accelerata funzionale e rovesciato sono legati al mutamento livelli di risorse metaboliche, alterazioni proteina abbondanza e funzione immunitaria. Vitellogenina, una proteina tuorlo con funzioni adatte a controllo ormonale e difesa cellulare, può servire come un importante elemento regolatore in una rete che controlla le diverse dinamiche di invecchiamento nei lavoratori.

Qui si descrive come l'emergere di infermieri e raccoglitori possono essere monitorati, e manipolato, compresa l'inversione di raccoglitori in genere di breve durata in infermieri più longevo. I nostri risultati rappresentativi mostrano come gli individui con età cronologica simili si differenziano in bottinatrici e le api nutrici in condizioni sperimentali. Noi rappresentiamo come inversione comportamentale da bottinatrici torna agli infermieri può essere convalidato. Infine, mostriamo come i diversi senescenza cellulare può essere valutata misurando l'accumulo di lipofuscina, un biomarcatore universale della senescenza.

Per studiare i meccanismi che possono collegare influenze sociali e l'invecchiamento plasticità, questo protocollo fornisce uno strumento standardizzato di acquisire materiale campione significativo, e di migliorare la comparabilità dei dati tra gli studi futuri.

Introduzione

Le strutture complesse colonia di animali altamente sociali sono mantenuti attraverso l'interazione di una casta riproduttiva e una casta aiutante di tipicamente lavoratori non per la riproduzione di diversi comportamenti di attività sociale. Nei diversi lavoratori, specifici adattamenti fisiologici consentono comportamenti di cura sib distinte, e sono anche legate alle differenze di durata della vita estreme. Le api da miele e ratti talpa rappresentano i modelli animali più sviluppati per studiare come socialità è legata a modelli di accelerazione, trascurabile o invertita invecchiamento ^1-3.

Nelle colonie api, una regina sola deposizione delle uova è assistita da migliaia di lavoratori che tendono la covata, foraggio per il cibo, e di impegnarsi in guardia, termoregolazione o comportamenti di igiene ^4. Tra questi lavoratori sono estremamente breve durata bottinatrici, api nutrici con rialzato, e in inverno (diutinus) api con durata di vita più lunga. Individui, tuttavia, non sono legati in via permanente un certo worker-tipo, ma visualizzare un ontogenesi comportamentale flessibile: cambiano da un comportamento missione sociale ad un altro ("caste temporali"). Api Callow possono cambiare a covata tendente api nutrici, che alla fine può cambiare foraggiamento di fuori. Tuttavia, le api imberbe nido possono anche trasformarsi in api invernali più longevi e raccoglitori di breve durata può anche tornare in infermieri in genere più longeve. Lavoratori con estrema (le api invernali) ed intermedio (api nutrici) durata della vita sono ben sviluppati di produzione e stoccaggio di alimenti organi con le risorse abbondanti - al contrario di raccoglitori di breve durata (recensiti ^1,5). Tuttavia, che il regolamento di vita individuale va al di là dei semplici cambiamenti nel bilanciamento delle risorse di un individuo è suggerito da una ricerca su una proteina tuorlo, che ha diverse funzioni adattate nel non-riproduzione lavoratore casta, come la produzione di gelatina ^6, controllo ormonale ^7, immune ⁸ e antiossidante difesa ^9.

Modelli di fdeclino unzion (senescenza) disparità specchio durata della vita tra i lavoratori, come stabilito per olfattivo, e anche per altri cerebrali funzioni di motore o ^10-13. In particolare, il significativo declino della funzione di apprendimento dopo solo due settimane di foraggiamento corrisponde a una progressione di mortalità simile a bottinatrici ^14, in contrasto con la mancanza di declino rilevabile (senescenza trascurabile) in api lunga durata invernali ^15.

Per identificare le impronte molecolari dell'invecchiamento flessibile abbiamo adattato paradigmi sperimentali consolidati che consentono di monitorare e manipolare l'invecchiamento di tipo transizioni ^8,16,17. Esperimento 1 dettagli su come ottenere campioni in cui gli effetti dell'età cronologica e lavoratore-tipo specifici comportamenti sociali in materia di invecchiamento possono essere separati. Esperimento 2 descrive l'inversione di raccoglitori con accelerati in api nutrici con dinamiche di invecchiamento rallentato. Esperimento 3 fornisce un approccio per sondare gli effetti della senescenza cellulare da parte anatomical quantificazione di un biomarcatore stabilito per l'invecchiamento cellulare (lipofuscina) ^18.

Protocollo

1. Il disaccoppiamento senescenza da cronologico Età

Questa sezione descrive la configurazione delle colonie doppie di coorte, che consistono in una coorte di individui identificati che condividono la stessa età cronologica ("coorte di età single"), e un gruppo di api nido. Stesse individui di età della coorte singolo età alla fine si separano in diversi operai tipi con diverse dinamiche di invecchiamento - queste sono le api infermiere con le api rallentato e falciatrici con il declino funzionale accelerato. Tutte le procedure sono descritte per una colonia sperimentale. Si consiglia, comunque, di effettuare esperimenti per almeno due colonia di replica in modo che gli effetti colonie possono essere controllati per (due-replica-design).

1. Preparazione caselle dell'alveare per le colonie doppia coorte: Preparare una scatola normale alveare che riceve due pettini alimentari con miele, un altro pettine cibo con polline e due pettini vuote. Assicurarsi di individuare una regina accoppiata così come colonia donatore con più di 3.000api nido. Entrambi saranno introdotti più tardi (1.3).
2. Ottenere e marcatura individui con età cronologica simile: raccogliere favi di covata sigillato che sta per emergere. Per una replica aspettare di raccogliere pettini con un totale di 3.000-5.000 celle di covata innevate. Per ogni replica utilizzare una quantità equilibrata di covata da almeno tre fonti diverse alveare per evitare distribuzioni asimmetriche di genotipi materni (origine alveare).
   1. Mettere favi di covata in un incubatore a 34 ° C con il 60-70% di umidità relativa. Assicurati di memorizzare pettini in modo tale che covata emergente non può sfuggire.
   2. Lasciate le api emergono per due giorni e segnare queste api con una piccola etichetta vernice sul torace (ad esempio Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). Il marchio di vernice consentirà identificare le api della coorte di età singolo (giorno della nascita), e per distinguerle dalle altre colonie replicate.
3. Impostazione di una doppia colonia di coorte, che comprende la coorte di identified, api età singoli: Il giorno giovani api sono stati contrassegnati, raccolgono circa 2.500-3.000 nido api da una colonia donatore (cfr. la sezione 1 in discussione.), e aggiungere queste api non marcati alla casella di alveare che è stato preparato in precedenza (cfr. punto 1.1). Le ultime persone costituiranno il non identificato nido ape coorte.
   1. Aggiungere la regina, che sarà inizialmente limitata ad una gabbia regina (disponibile in commercio). Sigillare la gabbia con la caramella commestibile (ad esempio Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Germania) per rendere api operaie rilasciano lentamente la regina.
   2. Aggiungere le api recentemente emerse e segnalate, che costituiranno la coorte singolo età. Queste api sono gli individui solo segnalati, e sono il focus group per tutti i seguenti passaggi.
4. Monitoraggio foraggiamento insorgenza e marcatura falciatrici: Per valutare l'insorgenza e la dinamica della transizione infermiere-raccoglitore nella coorte singolo dell'età, monitorare lo sviluppo demografico delle attività di foraggiamento emolto altro giorno per ogni colonia. Inizia a contare cinque giorni dopo le colonie sono stati istituiti (Figura 1).
   1. Contare il numero totale delle api bottinatrici di ritorno da voli (conteggi ingresso) nel raggio di 3 x 20 min periodi di osservazione in orari stabiliti. Assicuratevi di non contare le api durante i periodi di voli di orientamento (vedi discussione).
   2. Quando conta ingresso indicano una notevole attività di foraggiamento per iniziare (> 100 conteggi ingresso / giorno), inizio marcatura raccoglitori. Per farlo, raccoglitori della coorte di età singolo (singoli individui segnalati) ricevono un secondo segno di vernice al ritorno dai loro primi voli di foraggiamento. Questo marchio vernice specificare il giorno di foraggiamento esordio, e permetterà di identificare più tardi all'età di foraggiamento per ogni raccoglitore.
   3. Ripetere le marcature al giorno fino a quando è stato segnato un numero sufficiente di api. Per stimare un numero sufficiente di raccoglitori marcati, si aspettano un tasso di recupero non superiore al 5-10% dopo queste api erano stati invecchiati, in genere dopo 14 giorni diforaggiamento.
5. Campionamento: Poiché tutte le api inizialmente indicate con un età cronologica simile, gruppi di pari età di infermieri e vecchi raccoglitori possono essere raccolti simultaneamente, quando raccoglitori hanno foraged per ≥ 14 giorni.
   1. Singole api nutrici segnalati sono raccolti all'interno dell'alveare, e sono identificati da un comportamento di cura (alimentazione e pulizia delle larve con teste di mettere giù in celle di covata aperte).
   2. Bottinatrici doppi marcati sono raccolti anche all'interno dell'alveare prima dell'inizio attività quotidiana di foraggiamento.
   3. Raccogliere le api in gabbie (tubi, scatole) che forniscono una sufficiente ventilazione, e tenere buio fino ulteriore elaborazione. In alternativa, per trascrittomica, epigenetico o studi di proteomica, scatto direttamente api congelamento in azoto liquido. Raccogliere un numero equilibrato di persone provenienti da tutti i gruppi di test e replicare colonie.

2. Storno Lavoratori con Rapid per i lavoratori con l'invecchiamento rallentato da Modifica del Hive Demografia

Questa sezione spiega come viene effettuata l'inversione di lavoratori con invecchiamento accelerato (bottinatrici) per i lavoratori con l'invecchiamento rallentato (api nutrici). Tale inversione comportamentale è indotta, quando raccoglitori sperimentano la mancanza di api nutrici, che normalmente impegnano nella cura covata. La procedura di reversione separerà una singola colonia replicare in due arnie: un alveare con la frazione infermiera ape ("nurse-derivato"), e un altro con la frazione raccoglitore ("raccoglitore di derivazione"). Dopo l'inversione di successo, possibili sintomi di plastica e invertito l'invecchiamento possono essere studiate della coorte di età unico con i lavoratori ritornati, bottinatrici continui, continui api nutrici e raccoglitori di nuova assunzione. Come prima, le api identificati della fascia di età unica, non la coorte di api nido non identificati, costituiscono il focus group sperimentale.

1. Preparazione: Replicare alveari con infermieri (singolo segnato) e raccoglitori (doppia segnato) siano messi a disposizione, come descritto nella sezione precedente. Assicuratevi di non cominciare ritorno con meno di 500 segnati raccoglitori per replica colonia per garantire il recupero sufficiente dopo l'inversione è stata completata.
   1. Per l'identificazione sicura dei gruppi di test dopo l'inversione è fondamentale che l'intera popolazione raccoglitore nell'alveare originale è stata segnata prima di ritorno. La seguente procedura è descritta per una replica.
   2. Il giorno prima di reversione, preparare una scatola aggiuntiva alveare per l'alveare raccoglitore di derivazione (vedere il punto 1.1). Individuare due regine e due favi di covata da alveari donatori. Prima del trasferimento alle colonie sperimentali spazzare via tutte le api adulte da questi pettini. Una regina in gabbia (vedi punto 1.3) e una covata pettine sostituiranno regina e covata pettini nella scatola alveare originale. L'altra serie di regina e covata pettine verrà utilizzato il giorno successivo per la nuova casella alveare. Attribuzione simili di nuovi favi di covata e regine aliene per entrambi, l'originale e il nuovo alveare si consiglia di assicurarsi che raccoglitori separati ed infermieras sarà ugualmente un'esperienza cambiato spunti dell'alveare ("odore alveare").
2. Reversion: Al mattino, poco prima della reversione, aggiungere la regina in gabbia e il pettine covata per la nuova casella che riceverà la frazione raccoglitore di derivazione. Attendere fino a quando inizia l'ora di punta foraggiamento. Quindi spostare la colonia originale con bottinatrici segnalati e api nutrici almeno 100 metri di distanza dalla posizione originale.
   1. Alla posizione originale, impostare la nuova casella per l'alveare raccoglitore di derivazione con covata e unica regina.
   2. Raccoglitori potranno lasciare la casella alveare originale lussata, e tornate alla posizione originale. Consentire bottinatrici per tornare alla posizione originale per 2 ore al fine di raggiungere il prossimo per completare la separazione della popolazione raccoglitore dalle api nido.
   3. Poi, di interrompere la separazione, chiudere l'originale, ora "nurse-derivato" alveare, e trasferirlo in un apiario di almeno 3 km di distanza.
3. Manutenzione Hive e monitoraggio per il successo della missione socialeinversione: Controllare gli alveari sperimentali regolarmente per un sano, covata aperta.
   1. Durante i primi giorni dopo la manipolazione colonia sostituire covata incustodito e morti per ridurre il carico potenziale patogeno.
   2. Per convalidare l'inversione di successo all'interno dell'alveare forager-derivato, scattare foto di favi di covata prima della loro introduzione, e di nuovo quando pettini vengono sostituiti o quando l'esperimento reversione è completato (Figura 2). Le aree con covata precedentemente ridotti e con aperta, covata dal vivo sono indicatori affidabili di attività infermieristica in colonie falciatrici-derivati.
4. Campionamento: Effetti fisiologici che accompagnano l'inversione sociale possono essere rilevati 3-8 giorni dopo bottinatrici e infermieri sono stati separati.
   1. Consigliamo campionamento tutti i gruppi di test, vale a dire i lavoratori ritornati e raccoglitori corrente (alveare raccoglitore-derivati), così come gli infermieri continuative e raccoglitori di nuova assunzione (alveare infermiere-derivato) 8 giorni dopo è iniziata l'inversione.
   2. Colcampioni del SELECT come descritto al punto 1.5.

3. Analizzando operaio-tipo modelli specifici senescenza cellulare da Quantificazione del Lipofuscina

Lipofuscina è un biomarcatore universale di senescenza cellulare. Come prodotto accumulo intrinseca, autofluorescenza specifico di lipofuscina (emissione _max = 530-650 nm) può essere utilizzato per il rilevamento ^18.

1. Dissezione e fissazione: api Raffreddare su ghiaccio, fino immobili; rimuovere e sezionare il campione di tessuto desiderato.
   1. Trasferire in fissativo (paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato, PBS, pH 7,2) per incubazione overnight a 4 ° C.
   2. Lavare i campioni 3 volte in PBS.
2. Processazione dei tessuti e il montaggio: Tagliare campioni di tessuto in sezioni con non più di 40 micron di spessore, ad esempio utilizzando un microtomo lama vibrante, ad esempio Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Germania).
   1. Per compensazione, incubare sezioni di tessuto durante la notte nel 30% glicerolo (PBS), e un altro 2 ore nel 50% glicerolo (PBS).
   2. Montare sezioni su vetrini microscopici in 50% glicerolo (PBS). Per la guarnizione conservazione a lungo termine di copertura scivola con lo smalto.
3. Acquisizione delle immagini: Per rilevare lipofuscina, si consiglia di utilizzare un microscopio confocale a scansione laser che fornisce le linee laser con λ = 514, 561nm o simili per l'eccitazione, e con la banda rilevatore mettemmo a 570-650 nm.
   1. Per una migliore identificazione di lipofuscina, includere un secondo canale, e fare una scansione simultanea di spettri d'onda più corta (di eccitazione = 405 nm, emissione = 410-450 nm). Il canale lunghezza d'onda rivelerà entrambi, lipofuscina granulare, ma anche non specifico "background" a causa della trachea autofluorescenti e altre strutture non granulari. Il secondo, il canale di lunghezza d'onda più corta solo rivelerà autofluorescenza non specifico, ma non lipofuscina. Così, l'identificazione lipofuscina può essere faci tated confrontando i segnali in entrambi i canali, con uno solo di essi rivelando i granuli di lipofuscina fluorescenza specifica.
   2. Per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione utilizza un obiettivo con ingrandimento 40X o superiore, e preferibilmente una apertura numerica di 1.25 o superiore. Immagine Scan pile con dimensioni di circa 100 x 100 x 10 micron ^3. Ogni singolo campione e il tessuto deve essere rappresentato da più stack di immagine.
   3. Per ridurre la variabilità intra-individuale e inter-individuale causato dalla variazione tecnica, tenere sempre la potenza del laser e costante sensibilità del rivelatore.
   4. Per ridurre i pregiudizi da giorno per giorno varianti tecniche scansione numero di campioni pari di tutti i gruppi di test in ciascuna delle diverse sessioni di scansione.
4. Elaborazione delle immagini: utilizzare pacchetti software con moduli che consentono l'elaborazione avanzata di stack di immagini microscopiche, ad esempio ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / IJ / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Generare una sporgenza massima 2D per ciascuna delle pile di immagini 3D.
   2. Applicare un filtro Gauss con una dimensione modesta kernel per attenuare il rumore ad alta frequenza, e di preservare le strutture con dimensioni di granuli di lipofuscina.
   3. Unire entrambi i canali dei colori per facilitare l'identificazione della lipofuscina (vedi punto 3.2).
5. Analisi Image: Assicurarsi che il soggetto di eseguire le operazioni di quantificazione sarà cieco per verificare l'identità del gruppo.
   1. Per tutte le immagini, prima di scegliere una regione di interesse (ROI) che copre le strutture competenti, e ha dimensioni simili a quelle del ROI da altre immagini.
   2. Quindi selezionare il numero desiderato di granuli di lipofuscina che rappresentano ogni ROI. Quando si seleziona granuli di lipofuscina all'interno di una ROI, l'applicazione delle seguenti regole ridurrà parzialità soggettiva.
      1. Scegliere una posizione coerente per la selezione del primo GranuLe. Questo può essere, per esempio, il bordo più a sinistra di una ROI, e il granulo che è più vicino al bordo sarà sempre la prima selezione.
      2. Uno dopo l'altro, granuli sono scelti, che sono più vicini alla selezione precedente (vicino di casa).
      3. Quando si sceglie il vicino, muoversi solo in una direzione, ad esempio, solo la ricerca di destro dalla selezione precedente. Questa regola impedisce che la selezione è dominato da gruppi occasionali di granuli densamente.
      4. Quando la selezione è completata, valutare la dimensione di ogni particella lipofuscina delineando e misurando la rispettiva area granulo. Utilizzare appropriati test statistici per confrontare individui dei diversi gruppi sperimentali.

Risultati

Sezioni 1 e 2 del protocollo dettaglio come gruppi di prova possono essere ottenuti per studiare attributi di accelerazione, rallentato e invertito invecchiamento in colonie con un unico gruppo di età. Per monitorare lavoratore-tipo di differenziazione che accompagna l'ontogenesi normale abbiamo valutato conta falciatrici ("conta ingresso") per 6 colonie (Figura 1, confronta sezione 1). I grafici mostrano che il cambiamento considerevole dal infermiera allo stato raccoglitore non è in ge...

Discussione

Noi adottiamo qui descritto in precedenza si avvicina ^{8,16,17,19,20,} e integrarli in un unico flusso di lavoro che faciliterà lo studio dell'invecchiamento flessibile di api mellifere. Il nostro obiettivo è quello di fornire agli scienziati che sono alle prime armi in questo campo con uno strumento standardizzato di avere materiale campione significativo, e per migliorare la riproducibilità sperimentale tra i diversi gruppi di ricerca. Mentre le nostre procedure sono semplificate e non richiedono attre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000