Obtenção de amostras com retardado, acelerado e invertida Envelhecimento no Modelo Bee Mel

Resumo

Em trabalhadores da abelha do mel, o envelhecimento depende de comportamentos sociais, em vez de idade cronológica. Aqui nós mostramos como trabalhador-tipos com padrões muito diferentes de envelhecimento podem ser obtidas e analisadas para a senescência celular.

Resumo

Sociedades de animais altamente sociais apresentam grandes diferenças expectativa de vida entre os indivíduos intimamente relacionados. Entre os insetos sociais, a abelha é o melhor modelo estabelecido para estudar como plasticidade na expectativa de vida e envelhecimento é explicado por fatores sociais.

A casta dos trabalhadores das abelhas inclui abelhas enfermeira, que tendem a ninhada, e as abelhas forrageiras, que coletam néctar e pólen. Os trabalhos anteriores mostraram que as funções cerebrais e desempenho de vôo senesce mais rapidamente em forrageiras que em enfermeiros. No entanto, as funções do cérebro pode se recuperar, quando forrageiras voltar às tarefas de enfermagem. Tais padrões de senescência funcional acelerada e reverteu estão ligadas a níveis alterados de recursos metabólicos, a alterações na abundância de proteínas e função imunológica. Vitelogenina, uma proteína da gema com funções adaptadas no controle hormonal e de defesa celular, pode servir como um importante elemento regulador em uma rede que controla as diferentes dinâmicas de envelhecimento em trabalhadores.

Aqui nós descrevemos como o surgimento de enfermeiros e forrageiras podem ser monitorados, e manipulado, incluindo a reversão de forrageiras geralmente de curta duração para os enfermeiros de vida mais longa. Nossos resultados representativos mostram como indivíduos com idade cronológica semelhante diferenciar em forrageiras e abelhas de enfermagem em condições experimentais. Nós exemplificar como reversão do comportamento de forrageiras de volta para enfermeiros pode ser validado. Por último, que mostram como diferentes senescência celular pode ser avaliada pela medição da acumulação de lipofuscina, um biomarcador universal de senescência.

Para estudar os mecanismos que podem ligar as influências sociais e envelhecimento plasticidade, este protocolo fornece uma ferramenta padronizada definida para adquirir material de amostra relevante, e para melhorar a comparabilidade dos dados entre os estudos futuros.

Introdução

As estruturas complexas colônia de animais altamente sociais são mantidas através da interação de uma casta reprodutiva e uma casta de ajudante tipicamente trabalhadores não-reprodutores com diferentes comportamentos de tarefa social. Nos diferentes trabalhadores, adaptações fisiológicas específicas permitir comportamentos de cuidados sib distintos, e também estão ligados às diferenças tempo de vida extremas. As abelhas e os ratos-toupeira representam os modelos animais mais bem desenvolvidos para estudar como a sociabilidade está ligada a padrões de aceleração, insignificante ou revertida envelhecimento ^1-3.

Em colônias de abelhas, uma única rainha de postura é assistido por milhares de trabalhadores que tendem a ninhada, forragem para alimentar, e se envolver em guarda, termorregulação ou comportamentos de higiene ^4. Entre esses trabalhadores são as forrageiras extremamente curta duração, abelhas enfermeira com intermediário, e de inverno (diutinus) abelhas com longos tempos de vida. Os indivíduos, no entanto, não são permanentemente ligado a uma certa wotipo rker, mas exibir uma ontogenia comportamental flexível: eles mudam de um comportamento tarefa social para outro ("castas temporais"). Abelhas Callow pode mudar a ninhada tendendo abelhas enfermeira, que eventualmente pode mudar para forrageamento fora. No entanto, as abelhas ninho inexperiente também pode se transformar em abelhas de inverno de vida mais longa, e forrageiras de curta duração pode até mesmo reverter em enfermeiros tipicamente de vida mais longa. Trabalhadores com extrema (abelhas de inverno) e intermediário (abelhas enfermagem) têm vida útil bem desenvolvido de produção e armazenamento de alimentos órgãos com recursos abundantes - ao contrário de forrageiras de curta duração (revisada em ^1,5). No entanto, que a regulação da vida indivíduo vai além simples mudanças no equilíbrio dos recursos de um indivíduo é sugerida por pesquisas sobre uma proteína da gema, que tem diversas funções adaptadas na casta trabalhador não-reprodução, tais como a produção de geléia ^6, controle hormonal ^7, imune ⁸ e anti-oxidante de defesa ^9.

Padrões de fdeclínio unctional (senescência) disparidades espelho expectativa de vida entre os trabalhadores, estabelecido para olfativo, e também para outras funções motoras do cérebro ou ^10-13. Especificamente, a redução significativa da função de aprendizagem após apenas duas semanas de procura de alimentos corresponde a uma progressão de mortalidade semelhante em forrageiras ^14, ao contrário da falta de redução detectável (senescência negligenciável) em abelhas de longa vida de inverno ^15.

Para identificar as impressões digitais moleculares do envelhecimento flexível adaptamos paradigmas experimentais estabelecidas que permitem monitorar e manipular transições do tipo de envelhecimento ^8,16,17. Experimento 1 detalhes como obter amostras em que os efeitos da idade cronológica e comportamentos sociais específicos do tipo trabalhador sobre o envelhecimento podem ser separadas. Experimento 2 descreve a reversão de forrageiras com acelerados em abelhas enfermeira com dinâmica de envelhecimento mais lento. Experimento 3 fornece uma abordagem para efeitos da senescência celular sondagem por anatomical quantificação de um biomarcador estabelecido para o envelhecimento celular (lipofuscina) ^18.

Protocolo

1. A dissociação Senescence de idade cronológica

Esta seção descreve a instalação de colônias de coorte duplas, que consistem em um grupo de indivíduos identificados que compartilham a mesma idade cronológica ("faixa etária single") e um grupo de abelhas ninho. Indivíduos com Mesmas do único grupo etário acabará por separar-se em diferentes tipos de trabalho com diferentes dinâmicas de envelhecimento - estas são as abelhas enfermeira com abelhas diminuiu e forrageiras com declínio funcional acelerado. Todos os procedimentos são descritos de uma colónia experimental. Aconselhamos, no entanto, para realizar experimentos, pelo menos, dois colônia replica para que os efeitos da colônia pode ser controlado por (-design-dois repetição).

1. Preparar caixas de colméia para as colônias duplas de coorte: Prepare uma caixa normal colméia que recebe dois pentes de alimentos com mel, outro pente de alimentos com o pólen, e dois pentes vazios. Certifique-se de localizar uma rainha acasalou, bem como uma colônia de doadores com mais de 3.000abelhas ninho. Ambos serão introduzidos mais tarde (1.3).
2. Obtenção e marcação indivíduos com idade cronológica semelhante: Colete favos com criação selada que está prestes a emergir. Para uma réplica esperar para coletar pentes com um total de 3.000-5.000 células de cria tampado. Para cada replicar usar uma quantidade equilibrada de ninhada de pelo menos três fontes diferentes de colméia para evitar distribuição heterogênea de genótipos maternos (origem colméia).
   1. Coloque favos numa incubadora a 34 ° C, com 60-70% de humidade relativa. Certifique-se de armazenar pentes de tal forma que a ninhada emergente não pode escapar.
   2. Vamos abelhas surgir por dois dias e marcar essas abelhas com uma pequena tag pintura no tórax (por exemplo Uni Posca, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). A marca de tinta vai permitir identificar as abelhas da faixa etária única (dia da emergência), e para distingui-las de outras colônias idênticas.
3. Configurar uma colônia coorte duplo, que inclui o grupo de identified, abelhas idade único: No dia abelhas jovens foram marcados, coletar cerca de 2.500-3.000 abelhas ninho de uma colônia de doadores (compare seção 1 em Discussão.), e adicionar essas abelhas não marcado para a caixa de colméia que foi preparado antes (ver Passo 1.1). As últimas pessoas vão constituir a não identificado ninho de abelha coorte.
   1. Adicionar a rainha, o que será inicialmente confinado a uma gaiola rainha (disponível comercialmente). Selar a gaiola com doces comestíveis (por exemplo Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Alemanha) para fazer abelhas operárias liberam lentamente a rainha.
   2. Adicione as abelhas recém-emergidas e marcados, que constituirão o único grupo etário. Essas abelhas são os indivíduos apenas marcadas, e são o grupo de foco para todas as etapas a seguir.
4. Monitoramento forrageamento início e marcação forrageiras: Avaliar aparecimento e dinâmica da transição enfermeira-forager na única faixa etária, acompanhar o desenvolvimento demográfico da atividade de forrageamento emuito outro dia para cada colônia. Comece contando cinco dias após as colónias foram estabelecidas (Figura 1).
   1. Contar o número total de abelhas que retornam de forrageamento vôos (contagens de entrada) dentro de 3 x 20 min períodos de observação em horários fixos. Certifique-se de não contar abelhas durante os períodos de vôos de orientação (ver Discussão).
   2. Quando a contagem de entrada indicam atividade de forrageamento considerável para começar (> 100 contagens de entrada / dia), iniciar a marcação forrageiras. Para fazê-lo, Forrageiras da coorte de idade único (indivíduos marcados individuais) receber uma segunda marca de tinta em cima do retorno de seus primeiros vôos de forrageamento. Esta marca de tinta vai especificar o dia de início de forrageamento, e permitirá identificar mais tarde a idade de forrageamento para cada forrageira.
   3. Repetir marcações diárias até que um número suficiente de abelhas tem sido marcado. Para estimar um número suficiente de forrageiras marcadas, esperar uma taxa de recuperação de não mais de 5-10% após estas abelhas foram idade, geralmente após 14 dias deforrageamento.
5. Amostragem: Uma vez que todas as abelhas inicialmente marcadas têm uma idade cronológica semelhante, os grupos pareados por idade dos enfermeiros e forrageiras antigos podem ser coletados simultaneamente, quando forrageiras têm forragearam por ≥ 14 dias.
   1. Abelhas Solteiro enfermeira marcados são coletadas dentro da colméia, e são identificados pelo comportamento de enfermagem (alimentação e limpeza de larvas com cabeças de colocar para baixo em células de cria abertas).
   2. Duplo forrageiras marcadas também são coletadas dentro da colméia antes do início da atividade diária de forrageamento.
   3. Colete as abelhas em gaiolas (tubos, caixas) que fornecem ventilação suficiente, e manter escuro até posterior processamento. Alternativamente, para transcriptomic, epigenética ou estudos de proteômica, encaixe diretamente abelhas congelamento em nitrogênio líquido. Colete números equilibrados de indivíduos de todos os grupos de teste e replicar colônias.

2. Reversão dos Trabalhadores com rápida para Trabalhadores com o envelhecimento retardado por mudança da Hive Demografia

Esta seção detalha como a reversão de trabalhadores com envelhecimento acelerado (forrageiras) aos trabalhadores com o envelhecimento retardado (abelhas enfermeira) é executada. Tal inversão de comportamento é induzido, quando forrageiras experimentar uma falta de abelhas enfermeira, que normalmente se envolver nos cuidados ninhada. O procedimento de reversão irá separar uma única colônia replicar-se em duas seções: uma colméia com a fração enfermeira abelha ("enfermeira-derivado"), e outro com a fração forager ("forager derivados"). Após a reversão bem sucedida, possíveis sintomas de plástico e envelhecimento revertido pode ser estudado na faixa etária única com os trabalhadores revertidos, Forrageiras continuada, continuando abelhas enfermagem e forrageiras recrutados. Como antes, as abelhas identificadas da faixa etária única, e não o grupo de abelhas ninho não identificados, constituem o grupo focal experimental.

1. Preparação: Replicar colmeias com enfermeiros (único marcado) e forrageiras (duplo marcado) são disponibilizados conforme descrito na seção anterior. Certifique-se de não começar a reversão com menos de 500 forrageiras marcadas por repetição colônia para garantir a recuperação suficiente após a reversão foi concluída.
   1. Para a identificação segura de grupos de teste após a reversão, é fundamental que toda a população forrageira na colméia original foi marcado antes de reversão. O procedimento a seguir é descrito por uma réplica.
   2. Um dia antes de reversão, preparar uma caixa colméia adicional para a colmeia derivados de forager (veja o passo 1.1). Localize duas rainhas e dois favos de colmeia doadores. Antes da transferência para as colônias experimentais afastar todas as abelhas adultas destes pentes. Uma rainha enjaulado (veja o passo 1.3) e um pente ninhada irá substituir rainha e favos de cria na caixa de colméia de origem. O outro conjunto de rainha e ninhada pente será utilizado no dia seguinte para a nova caixa de colméia. Similar alocação de novos favos de cria e rainhas alienígenas para ambos, o original ea nova colméia é aconselhável ter certeza de que forrageiras separados e enfermeiras vai igualmente experiência mudou pistas Hive ("cheiro colméia").
2. Reversão: Na parte da manhã, pouco antes da reversão, adicione a rainha enjaulado e favos de cria para a nova caixa que receberá a fração proveniente-forager. Aguarde até que o horário de pico de forrageamento começa. Em seguida, passar a colônia original com forrageiras marcadas e abelhas enfermeira pelo menos 100 m de distância do local original.
   1. No local original, configure a nova caixa para a colmeia derivados de forager com ninhada e só rainha.
   2. Foragers vai deixar a caixa de colméia originais deslocado, e volte para o local original. Permitir forrageiras para voltar à posição original, durante 2 horas, a fim de alcançar a seguinte para completar a separação da população forrageira de abelhas do ninho.
   3. Então, para finalizar a separação, fechar o original, agora "enfermeira-derivada" colméia, e transferi-lo para um apiário pelo menos 3 km.
3. Hive manutenção e monitoramento de tarefa social bem-sucedidainversão: Verifique as colméias experimentais regularmente para saudável, ninhada aberto.
   1. Durante os primeiros dias após a manipulação colônia substituir ninhada autônoma e morto para reduzir a carga potencial patógeno.
   2. Para validar a reversão bem sucedida dentro da colméia derivados de saqueadores, tirar fotos de favos de cria antes da sua introdução, e novamente quando pentes são substituídos ou quando o experimento de reversão estiver concluído (Figura 2). Áreas com ninhada anteriormente não nivelada e com aberto, ninhada ao vivo são marcadores confiáveis ​​de atividade de enfermagem nas colônias derivadas de forrageiras.
4. Amostragem: Efeitos fisiológicos que acompanham inversão social, pode ser detectado 3-8 dias depois de forrageiras e enfermeiros foram separados.
   1. Aconselhamos amostragem todos os grupos de teste, ou seja, os trabalhadores revertidos e forrageiras continuadas (colmeia derivados de forager), bem como contínuas enfermeiros e forrageiras recém-recrutados (colmeia derivados de enfermeira) 8 dias após a reversão é iniciado.
   2. ColLECT amostras, conforme descrito no passo 1.5.

3. Analisando Trabalhador tipo Padrões Senescência celular específica pela quantificação de lipofuscina

A lipofuscina é um biomarcador universal de senescência celular. Como uma intrínseca acúmulo do produto, autofluorescência específico de lipofuscina (emissão _máxima = 530-650 nm) pode ser usado para a detecção de ^18.

1. Dissecção e fixação: abelhas Frio no gelo até imóvel; remover e dissecar a amostra de tecido desejado.
   1. Transferir para o fixador (4% de paraformaldeído em tampão fosfato salino, PBS, pH 7,2) por incubação durante a noite a 4 ° C.
   2. Lavar as amostras 3 vezes com PBS.
2. Processamento de tecidos e montagem: Corte amostras de tecido em seções com mais de 40 m de espessura, por exemplo, utilizando um micrótomo lâmina vibrando, por exemplo, Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Alemanha).
   1. Para compensação, incubar cortes de tecido durante a noite em 30% de glicerol (PBS), e outra de 2 horas em 50% de glicerol (PBS).
   2. Monte seções sobre lâminas microscópicas em 50% de glicerol (PBS). Para vedação de armazenamento a longo prazo lamínulas com unha polonês.
3. A aquisição de imagens: Para detectar lipofuscina, sugerimos o uso de um microscópio confocal de varredura a laser que fornece linhas de laser com λ = 514, 561nm ou similar para a excitação, e com a largura de banda detector ajustado para 570-650 nm.
   1. Para uma melhor identificação de lipofuscina, incluir um segundo canal e fazer uma varredura simultânea em espectros menor comprimento de onda (excitação = 405 nm; emissão = 410-450 nm). O canal de comprimento de onda mais longo irá revelar tanto, lipofuscina granular, mas também não específica "amarelo" devido a traquéia autofluorescent e outras estruturas não-granulares. O segundo, mais curto canal de comprimento de onda só vai revelar autofluorescência inespecífico, mas não lipofuscina. Assim, a identificação de lipofuscina pode ser faci tated comparando os sinais de ambos os canais, sendo que apenas um deles revelando os grânulos com fluorescência específica lipofuscina.
   2. Para a aquisição de imagens de alta resolução usar uma objetiva com ampliação de 40X ou superior, e de preferência uma abertura numérica de 1,25 ou superior. Digitalizar imagem empilhamentos com dimensões de cerca de 100 x 100 x 10 m ^3. Cada amostra individual e tecido tem que ser representado por várias pilhas de imagens.
   3. Para reduzir a variação intra-individual e inter-individual causado pela variação técnica, sempre manter a potência do laser e constante sensibilidade do detector.
   4. Para reduzir o viés por dia a dia variações técnicas analisar números de amostras iguais de todos os grupos de teste em cada uma das várias sessões de digitalização.
4. Processamento de imagem: Use pacotes de software com módulos que permitem o processamento avançado de pilhas de imagens microscópicas, por exemplo ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA dos Estados Unidos,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Gerar uma máxima projecção 2D de cada uma das pilhas de imagens em 3D.
   2. Aplicar um filtro de Gauss com um tamanho modesto do kernel, a fim de atenuar o ruído de alta freqüência, e para preservar as estruturas com dimensões de grânulos de lipofuscina.
   3. Mesclar os dois canais de cores para facilitar a identificação de lipofuscina (veja o passo 3.2).
5. Analisa Image: Certifique-se de que o sujeito executar os passos de quantificação será cego para testar a identidade do grupo.
   1. Para todas as imagens, primeiro seleccionar uma região de interesse (ROI) que cobre as estruturas relevantes, e tem dimensões semelhantes às da ROI a partir de outras imagens.
   2. Em seguida, selecione o número desejado de grânulos de lipofuscina que representam cada ROI. Ao selecionar grânulos de lipofuscina dentro de uma ROI, a aplicação das seguintes regras vão reduzir o viés subjetivo.
      1. Escolha um local consistente para a seleção do primeiro granule. Este pode ser, por exemplo, a aresta mais à esquerda de uma ROI, e o grânulo que está mais próxima da aresta será sempre a primeira selecção.
      2. Um após o outro, os grânulos são escolhidos que estão mais próximos da seleção anterior (vizinho).
      3. Ao escolher o próximo vizinho, mover-se apenas em uma direção, por exemplo, pesquisar apenas o direito da seleção anterior. Esta regra impede que a seleção é dominada por grupos ocasionais de grânulos densamente.
      4. Quando a seleção estiver completa, avaliar o tamanho de cada partícula de lipofuscina, destacando e medir a respectiva área de grânulos. Use testes estatísticos apropriados para comparar indivíduos dos diferentes grupos de teste.

Resultados

Seções 1 e 2 do Protocolo de detalhes como grupos de teste pode ser obtido para estudar atributos acelerado, desacelerou e inverteu o envelhecimento em colônias com uma única faixa etária. Para monitorar o tipo de trabalhador diferenciação que acompanha a ontogenia normal, avaliada a contagem de forrageiras ("contagens de entrada") por 6 colônias (Figura 1, comparar seção 1). Os gráficos mostram que a mudança considerável de enfermeira para o estado forager geralmente não é obse...

Discussão

Nós aqui adotar previamente descrita aproxima ^{8,16,17,19,20,} e integrá-los em um único fluxo de trabalho que irá facilitar a estudar o envelhecimento flexível em abelhas. Nosso objetivo é fornecer aos cientistas que são novatos neste campo com uma ferramenta padronizada definida para obter material de amostra relevante, e para melhorar a reprodutibilidade experimental entre as diferentes equipas de investigação. Enquanto os nossos procedimentos são simplificados e não requerem equipamento especial,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000