קבלת דגימות עם מואט, מואצת והפוך הזדקנות של דבורת דבש הדגם

Summary

בפועלי דבורת דבש, הזדקנות תלויה בהתנהגויות חברתיות ולא על גיל כרונולוגי. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשיג עובד סוגים עם דפוסי הזדקנות שונים מאוד ונותחו להזדקנות תאית.

Abstract

אגודות בעלי החיים חברתיים מאוד וכוללות הבדלי תוחלת חיים עצומים בין יחידים הקשורים באופן הדוק. בקרב חרקים חברתיים, דבורת הדבש היא המודל הטוב ביותר שהוקם במטרה ללמוד כיצד פלסטיות בתוחלת חיים והזדקנות מוסברת על ידי גורמים חברתיים.

כת העובד של דבורי דבש דבורים כוללת אחות, אשר נוטים להרהר, ודבורים בוזזים, אשר אוספים צוף ואבקת פרחים. העבודות קודמות הראו כי תפקודי מוח וביצועי טיסה להזדקן במהירות רבה יותר במלקטי מזון מאשר באחיות. עם זאת, תפקודי מוח יכולים להתאושש, כאשר מלקטי מזון לחזור למשימות סיעוד. דפוסים כאלה של הזדקנות מואצת ופונקציונלית ההפוכה צמודים לרמות משאבי חילוף חומרים שהשתנו, לשינויים בשפע חלבון ואת תפקוד מערכת החיסון. Vitellogenin, חלבון חלמון עם פונקציות מותאמות בבקרה הורמונלית והגנה תאית, עשוי לשמש כאלמנט רגולטורים מרכזי ברשת ששולטת בדינמיקת ההזדקנות שונה בעובדים.

כאן אנו מתארים כיצד הופעתם של אחיות ומלקטי מזון יכול להיות במעקב, ומניפולציות, ובם ההיפוך ממלקטי מזון קצר בדרך כלל לאחיות אורך חיים גדולות יותר. תוצאות הנציג שלנו להראות כיצד אנשים עם גיל כרונולוגי דומה להתמיין למלקטי מזון ודבורים אחות תחת תנאי ניסוי. אנו מדגימים כיצד ניתן תוקף היפוך התנהגותיות ממלקטי מזון בחזרה לאחיות. לאחרונה, אנו מראים כיצד שונים הזדקנות תאית יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת ההצטברות של lipofuscin, סמן ביולוגי אוניברסלי של הזדקנות.

ללימוד מנגנונים העשויים לקשר את ההשפעות חברתיות והזדקנות פלסטיות, פרוטוקול זה מספק כלי סטנדרטי שנקבע לרכישת חומר מדגם רלוונטי, וכדי לשפר את יכולת השוואת נתונים בין מחקרים עתידיים.

Introduction

מבני המושבה המורכבים של בעלי חיים חברתיים מאוד נשמרים באמצעות האינטראקציה של כת רבייה, וכת עוזר של כלל עובדים הלא כפול עם התנהגויות משימה חברתית שונות. בפועלים השונים, התאמות פיסיולוגיות ספציפיות לאפשר התנהגויות טיפול SIB מובהקות, וגם קשורות להבדלי תוחלת חיים קיצוניים. דבורי דבש וחפרפרות מייצגים את המודלים של בעלי החיים הטובים ביותר שפותחו כדי ללמוד איך sociality קשור לדפוסי מואצים, זניח או הפוך הזדקנות ^1-3.

במושבות דבורי דבש, מלכת הטלה אחת נעזרת באלף עובדים שנוטים להרהר, ללקט מזון, ולעסוק בשמירה, ויסות חום או התנהגויות היגיינה ^4. בין העובדים אלה מלקטי מזון קצרים מאוד, דבורי אחות עם ביניים, ודבורים בחורף (diutinus) עם תוחלת החיים הארוכים ביותר הם. אנשים, לעומת זאת, לא באופן קבוע מחויבים מסוים ווrker סוג, אבל להציג ontogeny התנהגותיים גמיש: הם משתנים ממשימת התנהגות חברתית אחד למשנו ("קסטות זמניות"). דבורי קאלו יכולים לשנות לדבורי אחות להרהר בטיפול, שסופו של דבר עשוי להשתנות לליקוט מזון בחוץ. עם זאת, דבורי קן חסר ניסיון יכולים גם להפוך לדבורים בחורף ארוך חיים, ומלקטי מזון קצר מועד יכול אפילו לחזור לאחיות בדרך כלל אורך חיים גדולים יותר. עובדים עם קיצוניות (דבורים בחורף) ואורך חיים בינוניים (דבורי אחות) פיתחו היטב איברי ייצור ואחסון מזון עם משאבים עצומות - בניגוד למלקטי מזון קצר מועד (הנסקרת ב ^1,5). עם זאת, שהרגולציה של תוחלת חיים בודדות חורגת שינויים פשוטים באיזון המשאבים של פרט שהוצע על ידי מחקר על חלבון חלמון, שבה יש פונקציות מותאמות מגוונות בכת העובד שאינו מתרבה, כגון ייצור ריבת ^6, בקרה הורמונלית ^7, חיסוניים ⁸ ונוגד חמצון להגנה ^9.

דפוסים של fירידת unctional (הזדקנות) פערי תוחלת חיים מראה בקרב עובדים, כפי שנקבע על חוש הריח, וגם לתפקודי מוח או מנוע אחרים ^10-13. באופן ספציפי, הירידה המשמעותית בתפקוד למידה רק לאחר שבועיים של ליקוט תואמת התקדמות תמותה דומה במלקטי מזון ^14, בניגוד לחוסר ירידה לזיהוי (הזדקנות זניחה) בדבורים בחורף ארוכים, חי ^15.

כדי לזהות את טביעות האצבעות מולקולריות של הזדקנות גמישה שהותאמנו פרדיגמות ניסוי קבעו כי נאפשר לניטור וטיפול במעברי הזדקנות מסוג ^8,16,17. להתנסות פרטים 1 איך להשיג דגימות שבו ניתן להפריד את ההשפעות של גיל כרונולוגי והתנהגויות חברתיות מסוימות עובד מסוג על הזדקנות. ניסוי 2 מתאר את ההיפוך של מלקטי מזון עם מואצים לתוך דבורי אחות עם דינמיקת הזדקנות מואטת. ניסוי 3 מספק גישה לחיטוט השפעות של הזדקנות תאית על ידי anatomicaכימות ליטר של סמן ביולוגי שהוקם להזדקנות תאים (lipofuscin) ^18.

Protocol

1. Decoupling הזדקנות מגיל כרונולוגי

סעיף זה מתאר את ההתקנה של מושבות עוקבה כפולות, שמורכבות מקבוצה של אנשים שזוהו שחולקים את אותה גיל כרונולוגי ("קבוצת גיל אחת") וקבוצה של דבורי קן. אנשים בגילים של אותה קבוצת גיל אחת סופו של דבר להפריד לעובד-סוגים שונים עם דינמיקת הזדקנות שונה - כל אלה הם דבורי אחות עם דבורי האטה ובוזזים עם ירידה תפקודית מואצת. כל ההליכים מתוארים למושבה אחת ניסיונית. אנו ממליצים, עם זאת, לבצע ניסויים לפחות שתי מושבה משכפל כך ניתן לשלוט בהשפעות שהמושבה ל( שני לשכפל את עיצוב).

1. הכנת קופסות כוורת למושבות כפולות עוקבה: הכן תיבה אחת רגילה כוורת שמקבלת שני מסרקי מזון עם דבש, מסרק מזון אחר עם אבקה, ושני מסרקים ריקים. ודא כדי לאתר מלכה הזדווגו כמו גם מושבה תורם עם יותר מ 3,000דבורי קן. שניהם יושקו מאוחר יותר (1.3).
2. קבלת וסימון אנשים עם גיל כרונולוגי דומה: לאסוף את המסרקים עם אפרוחים של אטום שעומד לצאת. ללשכפל אחד מצפה לאסוף מסרקים עם סך של 3,000-5,000 תאי קינון כתרים. עבור כל לשכפל להשתמש בכמות מאוזנת של גוזלים מלפחות שלושה מקורות כוורת שונים, כדי למנוע הפצות מוטות של גנוטיפים אימהיים (מקור כוורת).
   1. הנח סורקה להרהר בחממה מוגדרת 34 ° C עם 60-70% לחות יחסית. הקפד לאחסן את המסרקים בצורה כזאת, כי גוזלים מתעוררים לא יכולים לברוח.
   2. בואו דבורים לצאת ליומיים ולסמן דבורים אלה עם תג צבע קטן על בית החזה (למשל אוני POSCA, מיצובישי העיפרון ושות בע"מ). סימן הצבע יאפשר זיהוי הדבורים של עוקבה אחת הגיל (יום ההופעה), וכדי להבדיל ביניהם לבין מושבות לשכפל אחרות.
3. הקמת מושבה עוקבה כפולה, הכוללת את הקבוצה שליdentified, דבורים יחיד גיל: ביום דבורים צעירים סומנו, אוספים אודות 2,500-3,000 דבורי קן ממושבת תורם (השוו סעיף 1 בדיון.), ולהוסיף דבורים לא מסומנים אלה לתיבת הכוורת שהוכנה לפני (ראה צעד 1.1). אנשים אלה האחרונים יהוו מחזור דבורת קן לא מזוהה.
   1. הוסף את המלכה, אשר יהיו תחילה מוגבלת לכלוב מלכה (זמין באופן מסחרי). לאטום את הכלוב עם ממתקים אכילים (למשל Apifonda, Südzucker AG, מנהיים / Ochsenfurt, גרמניה) כדי להפוך את הדבורים פועל לשחרר את המלכה באיטיות.
   2. הוסף את הדבורים יצאו זה עתה ומסומן, אשר יהווה את קבוצת גיל אחת. דבורים אלה הם רק האנשים מסומנים, והם קבוצת המיקוד לכל השלבים הבאים.
4. ניטור ליקוט תחילת וסימון מלקטי מזון: על מנת להעריך את ההופעה ואת הדינמיקה של מעבר אחות לבוזז בקבוצת גיל אחת, לפקח על הפיתוח הדמוגרפי של דואר פעילות ליקוטיום אחר לכל מושבה. מתחיל לספור חמישה ימים לאחר המושבות הוקמו (איור 1).
   1. לספור את המספר הכולל של דבורים חוזרים מליקוט טיסות (ספירות כניסה) בתוך 3 x 20 תקופות תצפית דקות בזמנים קבועים. הקפד לא לספור דבורים בתקופות של טיסות נטייה (ראה דיון).
   2. כאשר ספירת כניסה מצביעה על פעילות ליקוט ניכרת להתחיל (> 100 ספירת כניסה / יום), מתחיל סימון מלקטי מזון. לשם כך, מלקטי מזון של העוקבה אחת הגיל (יחידים מסומנים יחיד) יקבלו סימן צבע שני כשחזרו מהטיסות הליקוט הראשונות שלהם. סימן צבע זה לציין את יום תחילת ליקוט, ויאפשר מאוחר יותר כדי לזהות את גיל ליקוט מזון עבור כל בוזז.
   3. חזור על סימוני יום עד מספר מספיק של דבורים כבר מסומן. להערכת מספר מספיק של מלקטי מזון מסומנים, מצפה שיעור אחזור של לא יותר מ 5-10% אחרי הדבורים הללו היו בגילים, בדרך כלל לאחר 14 ימיםחיפוש אחר מזון.
5. דגימה: מאז כל הדבורים בתחילה סימנו גיל כרונולוגי דומה, קבוצות לפי גילים של אחיות ומלקטי מזון ישנים יכולות להיות שנאספו בו זמנית, כאשר מלקטי מזון שחפשו מזון ל≥ 14 ימים.
   1. דבורי אחות בולטים יחיד נאספים בתוך הכוורת, ומזוהים על ידי התנהגות סיעוד (האכלה וניקוי של זחלים עם ראשים הניחו בתאי קינון פתוחים).
   2. מלקטי מזון מסומנים זוגי גם נאספים בתוך הכוורת לפני הפעילות יומית ליקוט מתחילה.
   3. איסוף דבורים בכלובים (צינורות, תיבות) המספקים אוורור מספיק, ולשמור את החושך עד עיבוד נוסף. לחלופין, לtranscriptomic, אפיגנטיים או לימודי proteomic, ישירות להצמיד דבורי הקפאה בחנקן נוזלי. לאסוף מספרים מאוזנים של אנשים מכל קבוצות המבחן ולשכפל את המושבות.

2. היפוך של עובדים עם ראפיד לעובדים עם הזדקנות האטה על ידי שינוי דמוגרפיה של הכוורת

פרטים בסעיף זה כיצד ההיפוך מעובדים עם הזדקנות מואצת (מלקטי מזון) לעובדים עם הזדקנות מואטת (דבורי אחות) מתבצע. היפוך התנהגותיים כגון מושרה, כאשר מלקטי מזון חווים חוסר דבורי אחות, אשר בדרך כלל לעסוק בטיפול להרהר. ההליך חזרה יפריד מושבה אחת לשכפל לשתי כוורות: כוורת אחת עם שבר דבורת אחות ("כנגזרת של אחות"), ועוד אחד עם חלק קטן הבוזז ("כנגזרת של בוזז"). לאחר היפוך מוצלח, סימפטומים אפשריים של פלסטיק והזדקנות הפוכה ניתן ללמוד בקבוצת גיל אחת עם עובדים חזרו, מלקטי מזון ממשיכים, דבורי אחות ממשיכים ומלקטי מזון גויס לאחרונה. כמו בעבר, דבורים מזוהים של העוקבה אחת הגיל, לא הקבוצה של דבורי קן לא מזוהים, מהווים קבוצת המיקוד הניסיונית.

1. הכנה: לשכפל כוורות עם אחיות (מסומן יחיד) ומלקטי מזון (כפול מסומן) נעשים זמין כפי שתואר בסעיף הקודם. הקפד לא להתחיל חזרה עם פחות מ 500 מלקטים מזון מסומנים למושבה לשכפל כדי להבטיח שליפה מספיק לאחר חזרה הושלם.
   1. לזיהוי בטוח של קבוצות מבחן אחרי היפוך זה קריטי, כי כל האוכלוסייה הבוזזת בכוורת המקורית סומנה מעל לפני חזרה. ההליך הבא מתואר ללשכפל אחד.
   2. היום לפני ההחזרה, להכין תיבה אחת נוספת כוורת לכוורת נגזר הבוזזת (ראה שלב 1.1). אתר שתי מלכות ושני מסרקים להרהר מכוורות תורם. לפני העברה למושבות הניסיוניות לצחצח את כל הדבורים הבוגרים ממסרקים אלה. מלכה אחת בכלוב (ראה שלב 1.3) ומסרק להרהר אחד יחליפו מסרקי מלכה ולהרהר בתיבת הכוורת המקורית. הקבוצה אחרת של מסרק מלכה ולהרהר תשמש למחרת לתיבת הכוורת החדשה. הקצאה דומה של מסרקים חדשים להרהר ומלכות זרות לשניהם, את המקור ואת הכוורת החדשה מומלץ לוודא כי מלקטי מזון ואחות נפרדיםים יהיה שווה ניסיון השתנה רמזי כוורת ("ריח כוורת").
2. חזרה: בבוקר, ממש לפני ההחזרה, מוסיף את המלכה בכלוב והמסרק להרהר לתיבה החדשה, שתקבל את החלק יחסי הנגזר בוזז. חכה עד לפעם ליקוט השיא מתחילה. לאחר מכן להעביר את המושבה המקורית עם מלקטים מזון מסומנים ודבורים אחות 100 לפחות מ 'מהמיקום המקורי.
   1. במיקום המקורי, להגדיר את התיבה החדשה לכוורת נגזר בוזזת עם אפרוחים ומלכה בלבד.
   2. מלקטי מזון יעזבו את תיבת הכוורת המקורית שיצאה מהמקום, ואת הראש חזרה למיקום המקורי. לאפשר מלקטי מזון כדי לחזור למיקום המקורי עבור שעה 2 על מנת להשיג הבא כדי להשלים את ההפרדה מהאוכלוסייה הבוזזת מדבורי קן.
   3. ואז, כדי לסיים את ההפרדה, לסגור את המקור, החברה "כנגזרת של אחות" כוורת, ולהעביר אותו למכוורת לפחות 3 ק"מ משם.
3. תחזוקת כוורת וניטור למשימה חברתית מוצלחתהיפוך: בדוק את הכוורות הניסיוניות באופן קבוע לגוזלים בריאים, פתוחים.
   1. בימים הראשונים לאחר מניפולציה המושבה להחליף גוזלים ללא השגחה ומתים כדי להפחית את עומס הפתוגן פוטנציאלי.
   2. כדי לאמת את ההיפוך מוצלח בתוך הכוורת נגזר בוזזת, לצלם תמונות של מסרקים להרהר לפני החדרת אלה, ושוב כאשר מסרקים מוחלפים או כאשר הניסוי חזרה הושלם (איור 2). אזורים עם אפרוחים של הסירו את המכסה בעבר ועם אפרוחים של פתוחים, חיים הם סמנים אמינים של פעילות סיעוד במושבות שמקורם בוזזת.
4. דגימה: תופעות פיזיולוגיות המלוות את ההיפוך חברתי יכולות להיות מזוהות על 3-8 ימים לאחר מלקטי מזון ואחיות הופרדו.
   1. אנו מייעצים דגימה כל קבוצות הבדיקה, עובדים חזרו כלומר מלקטי מזון וממשיך (כוורת נגזר בוזזת), כמו גם אחיות ממשיכות ומלקטי מזון חדש שגויס (כוורת נגזרת אחות) 8 ימים לאחר ההיפוך הוא יזמה.
   2. Colדגימות lect כמתואר בשלב 1.5.

3. ניתוח דפוסי הזדקנות תאית ספציפית לעובד מסוג ידי כימות של lipofuscin

Lipofuscin הוא סמן ביולוגי אוניברסלי של הזדקנות תאית. כמוצר הצטברות פנימי, autofluorescence הספציפי של lipofuscin _{(מקסימום} פליטה = 530-650 ננומטר) יכול לשמש לזיהוי ^18.

1. נתיחה וקיבעון: דבורי צ'יל על קרח עד ללא תנועה, להסיר ולנתח את דגימת הרקמה הרצויה.
   1. העבר למקבעים (paraformaldehyde 4% בפוספט שנאגרו מלוח, PBS, pH 7.2) לדגירת הלילה ב 4 ° C.
   2. לשטוף דגימות 3 פעמים ב-PBS.
2. עיבוד רקמות והרכבה: חותכים דגימות רקמה למקטעים עם לא יותר מ 40 מיקרומטר עובי, למשל באמצעות microtome רוטט להב, למשל לייקה VT 1000S (לייקה Biosystems, Nussloch, גרמניה).
   1. לסליקה, דגירה סעיפי רקמות הלילה בגליצרול 30% (PBS), ועוד 2 שעות בגליצרול 50% (PBS).
   2. הר סעיפים בשקופיות מיקרוסקופיות בגליצרול 50% (PBS). לחותם אחסון לטווח ארוך תלושי לכסות עם לק.
3. רכישת תמונה: כדי לזהות lipofuscin, אנו מציעים באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר, המספק קווי לייזר עם λ = 514, 561nm או דומה לעירור, ועם רוחב פס הגלאי מוגדר 570-650 ננומטר.
   1. לזיהוי טוב יותר של lipofuscin, כולל ערוץ שני, ולעשות סריקה בו זמנית בספקטרום אורך גל קצר יותר (עירור = 405 ננומטר; פליטה = 410-450 ננומטר). הערוץ באורך הגל הארוך יותר יגלה שניהם, lipofuscin הפרטני, אלא גם "רקע" נוקב בשל קנה הנשימה autofluorescent ומבנים שאינם פרטניים אחרים. הערוץ באורך הגל השני, קצר יותר רק יגלה autofluorescence הנוקב, אבל לא lipofuscin. לכן, זיהוי lipofuscin יכול להיות הוא מסייע tated על ידי השוואת האותות בשני הערוצים, ורק אחד מהם חושפים את הגרגרים עם הקרינה ספציפית lipofuscin.
   2. לרכישת תמונות ברזולוציה גבוהה להשתמש אובייקטיבית עם 40X הגדלה או גבוהה יותר, ועדיף צמצם מספרי של 1.25 או גבוהים יותר. תמונת סריקת ערימות עם ממדים של כ -100 x 100 x 10 מיקרומטר ^3. כל דגימה בודדת ורקמות יש להיות מיוצגת על ידי ערימות של תמונות מרובות.
   3. כדי להפחית וריאציה התוך אישית והבין אישית הנגרמת על ידי וריאציה טכנית, תמיד לשמור על כוח לייזר ומתמיד רגישות גלאי.
   4. כדי להפחית את ההטיה על ידי יום ליום וריאציות טכניות לסרוק מספרי מדגם שווים של כל הקבוצות במבחן בכל אחד ממספר המפגשים בסריקה.
4. עיבוד תמונה: השתמש בחבילות תוכנה עם מודולים המאפשרים עיבוד מתקדם של ערימות תמונה מיקרוסקופיות, למשל ImageJ (מכוני בריאות הלאומיים של ארה"ב, בתסדה, מרילנד, ארה"ב,gej.nih.gov / ij / "= היעד" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. צור היטל מרבי 2D לכל אחת מערימות תמונת 3D.
   2. להחיל מסנן גאוס עם גודל ליבה צנוע כדי להחליש רעש בתדר גבוה, וכדי לשמר את המבנים עם ממדים של גרגרי lipofuscin.
   3. מיזוג שני ערוצי הצבע כדי להקל על זיהוי של lipofuscin (ראה שלב 3.2).
5. תמונת מנתח: ודא כי הנושא ביצוע צעדי הכימות יהיה עיוור כדי לבדוק את זהות קבוצה.
   1. לכל התמונות, לבחור ראשון באזור של עניין (ROI) המכסה את המבנים הרלוונטיים, ויש לו ממדים דומים כמו ROIs מתמונות אחרות.
   2. לאחר מכן, בחר את המספר הרצוי של גרגירי lipofuscin המייצגים את כל החזר על השקעה. בעת בחירת גרגרי lipofuscin בתוך החזר על השקעה, היישום של הכללים הבאים יפחית הטיה הסובייקטיבית.
      1. בחר מיקום עקבי לבחירת granu הראשונהle. זה יכול להיות, למשל, בקצה השמאלי ביותר של החזר על השקעה, והגרגר שהוא הקרוב ביותר לקצה תמיד יהיה הבחירה הראשונה.
      2. אחד אחרי השני, גרגרים נבחרים, כי הם הקרובים ביותר לבחירה הקודמת (השכן).
      3. כאשר בוחר את השכן, לנוע רק בכיוון אחד, למשל חיפוש נכון רק מהבחירה הקודמת. כלל זה מונע כי הבחירה נשלט על ידי מדי פעם אשכולות של גרגירים צפופים.
      4. כאשר הבחירה הושלמה, להעריך את גודלו של כל חלקיק lipofuscin ידי חלוקה לרמות ומדידת שטח הגרגר המתאים. השתמש בבדיקות סטטיסטיות מתאימות כדי להשוות אנשים מקבוצות הבדיקה השונות.

תוצאות

סעיפי 1 ו -2 לפרוטוקול פירוט כיצד ניתן להשיג קבוצות מבחן ללמוד תכונות של מואץ, האטו והתהפכו הזדקנות במושבות עם קבוצת גיל אחת. כדי לפקח על בידול עובד מהסוג שמלווה את ontogeny הנורמלי שאנחנו הערכנו ספירות בוזזות ("ספירת כניסה") במשך 6 מושבות (איור 1, השווה סעיף 1). ?...

Discussion

אנחנו כאן לאמץ בעבר תאר גישות ^{8,16,17,19,20,} ולשלב אותם לתוך זרימת עבודה אחת שתאפשר לימוד הזדקנות גמישה בדבורי דבש. המטרה שלנו היא לספק למדענים כי הם טירון בתחום זה עם כלי סטנדרטי מוגדר להשיג חומר מדגם רלוונטי, וכדי לשפר את שחזור ניסיוני בקרב צוותי מחקר שונים. בעוד שהנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000