La obtención de especímenes con desacelerado, acelerado y Invertida Envejecimiento en la abeja de la miel Modelo

Resumen

En los trabajadores de abejas, el envejecimiento depende de los comportamientos sociales, más que en la edad cronológica. Aquí se muestra cómo se pueden obtener y se analizó la senescencia celular trabajadores-con tipos muy diferentes patrones de envejecimiento.

Resumen

Sociedades de animales altamente sociales cuentan con grandes diferencias de vida útil entre individuos estrechamente relacionados. Entre los insectos sociales, la abeja de la miel es el mejor modelo establecido para estudiar cómo la plasticidad en la vida útil y el envejecimiento se explica por factores sociales.

La casta de obreras de las abejas melíferas incluye las abejas nodrizas, que tienden la cría y abejas para cosechadoras de forraje, que recogen el néctar y el polen. Trabajos anteriores han demostrado que las funciones del cerebro y el rendimiento de vuelo envejecen más rápidamente en los cazadores-recolectores que en las enfermeras. Sin embargo, las funciones del cerebro pueden recuperar, cuando recolectoras vuelven a sus tareas de enfermería. Estos patrones de senescencia funcional acelerada y revirtió están vinculados a los niveles modificados de recursos metabólicos, alteraciones en la abundancia de proteínas y la función inmune. La vitelogenina, una proteína de la yema con funciones adaptadas en el control hormonal y de defensa celular, puede servir como un elemento regulador importante en una red que controla las diferentes dinámicas de envejecimiento de los trabajadores.

A continuación se describe la forma en la aparición de las enfermeras y los cazadores-recolectores se puede controlar, y manipulado, incluyendo la reversión de cazadores-recolectores normalmente de corta duración en las enfermeras de vida más larga. Nuestros resultados representativos muestran cómo los individuos con edad cronológica similares diferencian en cazadores-recolectores y las abejas nodrizas, en condiciones experimentales. Ejemplificamos cómo reversión del comportamiento de los cazadores-recolectores de nuevo a las enfermeras puede ser validado. Última, mostramos cómo los diferentes senescencia celular se puede evaluar mediante la medición de la acumulación de lipofuscina, un biomarcador universal de la senescencia.

Para el estudio de los mecanismos que pueden vincular las influencias sociales y el envejecimiento de la plasticidad, este protocolo constituye un instrumento estandarizado establecido para adquirir material de la muestra correspondiente, y para mejorar la comparabilidad de los datos entre los estudios futuros.

Introducción

Las complejas estructuras de colonias de animales altamente sociales se mantienen a través de la interacción de una casta reproductiva, y una casta de ayudante normalmente los trabajadores no se reproduzcan con las diferentes conductas de tarea social. En los diferentes trabajadores, las adaptaciones fisiológicas específicas permiten a los comportamientos de cuidado sib distintas, y también están vinculados a las diferencias de vida útil extremas. Las abejas y las ratas topo representan los modelos animales más desarrollados para estudiar cómo la sociabilidad está vinculada a patrones de aceleración, insignificante o invertido envejecimiento ^1-3.

En las colonias de abejas de miel, una sola reina que pone huevos con la asistencia de miles de trabajadores que tienden a las crías, buscar comida, y participar en la vigilancia, la termorregulación o comportamientos de higiene ^4. Entre estos trabajadores son los recolectores extremadamente efímeras, las abejas nodrizas con intermedio, y el invierno (diutinus) esperanzas de vida más largas con las abejas. Los individuos, sin embargo, no están obligados permanentemente a cierto wotipo rker, pero mostrar una ontogenia conductual flexibles: se cambian de un comportamiento tarea social a otro ("castas temporales"). Abejas Callow pueden cambiar a la cría tendiendo las abejas nodrizas, que con el tiempo puede cambiar al forrajeo exterior. Sin embargo, las abejas nido inexperto también pueden transformarse en las abejas más longevos de invierno, y recolectores de corta duración, incluso puede volver a enfermeras típicamente de vida más larga. Trabajadores con extrema (las abejas de invierno) e intermedio (abejas nodrizas) vida han bien desarrollado de producción y almacenamiento de alimentos órganos con cuantiosos recursos - a diferencia de cazadores-recolectores de corta duración (revisado en ^1,5). Sin embargo, que la regulación de la vida útil individuo va más allá de simples cambios en el equilibrio de los recursos de un individuo es sugerido por la investigación sobre una proteína de la yema, que tiene diversas funciones adaptadas en el trabajador de castas no reproducir, como la producción de jalea de ^6, control hormonal ^7, inmune ⁸ y anti-oxidante defensa ^9.

Los patrones de fdisminución unctional (senescencia) disparidades espejo de vida útil entre los trabajadores, según lo establecido para olfativo, y también para otras funciones cerebrales o motoras ^10-13. Específicamente, la disminución significativa en la función de aprendizaje después de sólo dos semanas de forrajeo coincide con una progresión similar en la mortalidad de forraje ^14, en oposición a la falta de disminución detectable (senescencia insignificante) en de larga vida abejas de invierno ^15.

Para identificar las huellas dactilares moleculares del envejecimiento flexibles adaptamos paradigmas experimentales establecidos que permitan el seguimiento y la manipulación de las transiciones de tipo de envejecimiento ^8,16,17. Experimento 1 se detalla cómo obtener muestras en las que los efectos de la edad cronológica y de tipo trabajador conductas sociales específicas sobre el envejecimiento pueden separarse. Experimento 2 se describe la inversión de cazadores-recolectores con acelerados en las abejas nodrizas con dinámica de envejecimiento más lento. Experimento 3 se presenta un enfoque para probar los efectos de la senescencia celular por anatomical cuantificación de un biomarcador establecido para el envejecimiento celular (lipofuscina) ^18.

Protocolo

1. Desacoplamiento senescencia de Edad cronológica

En esta sección se describe la configuración de las colonias dobles de cohortes, que consisten en una cohorte de individuos identificados que comparten la misma edad cronológica ("grupo de edad único") y una cohorte de abejas nido. Los mismos individuos de edad de la cohorte de edad solo el tiempo se separan en diferentes tipos de trabajadores-con diferentes dinámicas de envejecimiento - estas son las abejas nodrizas con abejas desacelerado y cosechadoras de forraje con el declive funcional acelerada. Todos los procedimientos se describen, por una colonia experimental. Asesoramos, sin embargo, para realizar experimentos durante al menos dos réplicas de colonias para que los efectos de colonias pueden ser controlados para (dos replicados-diseño).

1. Preparación de las cajas de colmena para las colonias dobles cohorte: Prepare una caja regular colmena que recibe dos peines de alimentos con miel, otro peine de alimentos con el polen, y dos panales vacíos. Asegúrese de colocar una reina acoplado, así como una colonia de donantes con más de 3.000abejas nido. Ambos se introducirán más tarde (1.3).
2. Obtención y marcado individuos con edad cronológica similar: Recoger peines con cría sellada que está a punto de emerger. Para un replicado esperar para recoger peines con un total de 3.000-5.000 celdas de cría tapados. Para cada réplica utilizar una cantidad equilibrada de cría de al menos tres fuentes diferentes de la colmena para evitar distribuciones asimétricas de genotipos maternos (origen colmena).
   1. Coloque panales de cría en una incubadora a 34 ° C con una humedad relativa de 60-70%. Asegúrese de guardar los peines de tal manera que la colonia emergente no puede escapar.
   2. Deje que las abejas emergen durante dos días y marcan estas abejas con una pequeña etiqueta de la pintura en el tórax (por ejemplo Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). La marca de pintura permitirá la identificación de las abejas de la cohorte de edad solo (día de la emergencia), y para distinguirlos de otras colonias replicadas.
3. Configuración de una colonia cohorte doble, que incluye la cohorte de identified, abejas sola edad: En el día de las abejas jóvenes han sido marcados, recogen unos 2.500-3.000 abejas nido de una colonia de donantes (compare la sección 1 en la discusión.), y agregar estas abejas sin marcar a la caja de la colmena que fue preparado antes (ver paso 1.1). Estas últimas personas constituirán la cohorte de nido de abeja no identificado.
   1. Añadir a la reina, que se limitaba inicialmente a una jaula de la reina (disponible en el comercio). Selle la caja con dulces comestibles (por ejemplo Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Alemania) para que las abejas obreras liberan lentamente la reina.
   2. Añadir las abejas recién nacidas y marcados, los cuales constituirán el grupo de edad único. Estas abejas son los individuos sólo marcados, y son el grupo de enfoque para todos los pasos siguientes.
4. Monitoreo de forrajeo inicio y marcado recolectoras: Evaluar la aparición y la dinámica de la transición enfermera-recolector en el grupo de edad única, supervisará la evolución demográfica de la actividad de forrajeo de correomuy otro día para cada colonia. Empiece a contar cinco días después de colonias se establecieron (Figura 1).
   1. Cuente el número total de las abejas regresan de forrajeo vuelos (recuentos de entrada) a menos de 3 x 20 min períodos de observación a horas fijas. Asegúrese de no contar con las abejas durante los períodos de vuelos de orientación (ver Discusión).
   2. Cuando los conteos de entrada indican una considerable actividad de forrajeo de comenzar (> 100 cuentas de ingreso / día), comience marcando recolectoras. Para ello, Cosechadoras de forraje de la cohorte de edad única (individuos marcados individuales) reciben una segunda marca de pintura al regresar de sus primeros vuelos de forrajeo. Esta marca de pintura especificará el día de inicio de forrajeo, y permitirá identificar más tarde de la edad de forrajeo para cada recolector.
   3. Repita marcas diarias hasta que un número suficiente de abejas ha sido marcado. Para la estimación de un número suficiente de forraje marcados, esperar una tasa de recuperación de no más de 5-10% después de estas abejas habían sido envejecido, típicamente después de 14 días deforrajeo.
5. Muestreo: Desde todas las abejas marcadas inicialmente tienen una edad cronológica semejante, los grupos de la misma edad de las enfermeras y los recolectores de edad pueden ser recogidos de forma simultánea, cuando recolectores han alimentaban durante ≥ 14 días.
   1. Soltero abejas nodrizas marcadas se recogen dentro de la colmena, y se identifican por el comportamiento de enfermería (alimentación y limpieza de las larvas con las cabezas puestas en celdas de cría abiertos).
   2. Recolectores dobles marcados también se recogen dentro de la colmena antes de que comience la actividad diaria de forrajeo.
   3. Recoger las abejas en las jaulas (tubos, cajas) que proporcionan una ventilación suficiente, y mantener a oscuras hasta su posterior procesamiento. Alternativamente, para transcriptómica, epigenética o estudios proteómicos, snap directamente abejas congelación en nitrógeno líquido. Reunir un número equilibrado de personas de todos los grupos de prueba y replicar colonias.

2. Reversión de los trabajadores con rápido a los trabajadores con el envejecimiento frenado por los cambios demográficos de la Colmena

En esta sección se detalla cómo se lleva a cabo la reversión de los trabajadores con el envejecimiento acelerado (recolectores) a los trabajadores con el envejecimiento lento (abejas nodrizas). La reversión del comportamiento es inducida, cuando recolectores experimentan una falta de las abejas nodrizas, que normalmente se dedican a cuidado de las crías. El procedimiento de reversión se separará una sola colonia se replica en dos colmenas: una colmena con la fracción de abeja enfermera ("deriva-nurse"), y otro con la fracción forrajera ("derivados de recolector"). Después de la inversión de éxito, posibles síntomas de plástico y revirtió el envejecimiento pueden ser estudiados en el grupo de edad solo con los trabajadores revertidas, continuando recolectores, que continúan las abejas nodrizas y recolectores de nueva contratación. Al igual que antes, las abejas identificados de la cohorte de edad única, no la cohorte de abejas nido no identificados, constituyen el grupo de enfoque experimental.

1. Preparación: Replicar colmenas con las enfermeras (solo marcó) y forrajeras (doble marcado) se hacen disponibles como se describe en la sección anterior. Asegúrese de no iniciar la reversión con menos de 500 recolectores marcados por colonia réplica para garantizar la recuperación suficiente después de la reversión se ha completado.
   1. Para la identificación segura de los grupos de prueba después de la inversión es crucial que toda la población forrajera en la colmena original ha sido marcado antes de la reversión. El siguiente procedimiento se describe para un replicado.
   2. El día antes de la reversión, preparar una caja colmena adicional para la colmena forager derivados (véase el paso 1.1). Localice dos reinas y dos panales de cría de las colmenas de los donantes. Antes de la transferencia a las colonias experimentales quitar todas las abejas adultas de estos peines. Una reina enjaulada (véase el paso 1.3) y un panal de cría reemplazarán queen y panales de cría en la caja original de la colmena. El otro conjunto de la reina y la cría de peine que se utilizará el día siguiente para el nuevo cuadro de colmena. Asignación similar de nuevas panales de cría y las reinas exóticas para ambos, el original y se aconseja la nueva colmena para asegurarse de que cazadores-recolectores separados y enfermeras será igualmente experiencia cambiado las señales de las colmenas ("olor de la colmena").
2. Reversión: Por la mañana, justo antes de la reversión, agregue la reina enjaulada y el panal de cría para la nueva caja que recibirá la fracción forrajera derivada. Espere hasta que comience la temporada alta de forrajeo. A continuación, mueva la colonia original con recolectores marcados y las abejas nodrizas al menos 100 m de distancia de la ubicación original.
   1. En la ubicación original, configurar el nuevo cuadro de la colmena forager derivados con la cría y única reina.
   2. Foragers dejarán el cuadro de colmena original, dislocado, y regresar a la posición original. Permitir recolectoras para volver a la posición original durante 2 horas con el fin de lograr junto a la separación completa de la población recolectora de abejas nido.
   3. Entonces, para terminar la separación, cerrar el Original "derivada enfermera" colmena, y transferirlo a un colmenar, al menos, a 3 km.
3. Mantenimiento de la colmena y la supervisión de la tarea social exitosareversión: Compruebe las colmenas experimentales regularmente, cría abierta saludable.
   1. Durante los primeros días después de la manipulación colonia reemplazar cría desatendido y muerto para reducir el potencial de carga de patógenos.
   2. Para validar reversión exitosa dentro de la colmena forager derivados, tomar fotos de panales de cría antes de la introducción de estos, y de nuevo cuando peines sean sustituidos o cuando el experimento reversión se completa (Figura 2). Las áreas con cría previamente destapado y con abierta, cría en vivo son marcadores confiables de la actividad de enfermería en las colonias de cosechadoras de forraje derivado.
4. Muestreo: Efectos fisiológicos que acompañan a la inversión social, se pueden detectar 3-8 días después de cazadores-recolectores y las enfermeras se separaron.
   1. Aconsejamos a todos los grupos de pruebas de muestreo, es decir, los trabajadores revertidas y recolectores continuadas (colmena forager derivados), así como los continuos enfermeras y recolectores recién contratados (colmena enfermera derivados) 8 días después se inicia la reversión.
   2. Columnamuestras lect como se describe en el paso 1.5.

3. Análisis de tipo Trabajador Patrones senescencia celular específica por Cuantificación de lipofuscina

La lipofuscina es un biomarcador universal de la senescencia celular. Como un producto de la acumulación intrínseca, autofluorescencia específica de lipofuscina (emisión _máx = 530 a 650 nm) se puede utilizar para la detección de ^18.

1. La disección y fijación: las abejas se enfría en hielo hasta inmóvil; retirar y diseccionar a cabo la muestra de tejido deseado.
   1. Transferencia en fijador (4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato, PBS, pH 7,2) para la incubación durante la noche a 4 ° C.
   2. Lávese las muestras 3 veces en PBS.
2. Procesamiento de tejidos y de montaje: Cortar muestras de tejido en secciones con no más de 40 m de espesor, por ejemplo mediante el uso de un micrótomo cuchilla vibrante, por ejemplo, de Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Alemania).
   1. Para la limpieza, se incuban secciones de tejido durante la noche en 30% de glicerol (PBS), y otro 2 horas en 50% de glicerol (PBS).
   2. Montar secciones sobre portaobjetos de microscopio en 50% de glicerol (PBS). Para sellador para almacenamiento a largo plazo cubreobjetos con esmalte de uñas.
3. La adquisición de imágenes: Detectar lipofuscina, le sugerimos utilizar un microscopio confocal de barrido láser que proporciona líneas de láser con λ = 514, 561nm o similar para la excitación, y con el ancho de banda del detector pusimos a 570-650 nm.
   1. Para una mejor identificación de lipofuscina, incluir un segundo canal, y hacer una exploración simultánea en los espectros de longitud de onda más corta (excitación = 405 nm; emisión = 410 a 450 nm). El canal de longitud de onda más larga revelará tanto, lipofuscina granular, sino también "de fondo" no específica debido a la tráquea autofluorescent y otras estructuras no granulares. El segundo canal de longitud de onda más corta solamente revelará autofluorescencia inespecíficos, pero no lipofuscina. Así, la identificación de lipofuscina puede ser faci tated mediante la comparación de las señales en ambos canales, con sólo uno de ellos revelando los gránulos con lipofuscina fluorescencia específica.
   2. Para la adquisición de imágenes de alta resolución utiliza un objetivo con un aumento de 40X o superior, y preferiblemente una apertura numérica de 1,25 o superior. Imagen Scan apila con dimensiones de aproximadamente 100 x 100 x 10 m ^3. Cada muestra individual y el tejido tiene que ser representado por varias pilas de imágenes.
   3. Para reducir la variación intraindividual e interindividual causado por la variación técnica, mantener siempre la potencia del láser y de la sensibilidad del detector constante.
   4. Para reducir el sesgo por el día a día las variaciones técnicas escanear igual número de muestras de todos los grupos de prueba en cada una de las varias sesiones de exploración.
4. Procesamiento de imágenes: Utilice los paquetes de software con módulos que permiten el procesamiento avanzado de pilas de imágenes microscópicas, por ejemplo ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE.UU. Estados Unidos,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Generar una máxima proyección 2D para cada una de las pilas de imágenes en 3D.
   2. Aplicar un filtro de Gauss con un tamaño modesto núcleo para atenuar el ruido de alta frecuencia, y para preservar las estructuras con dimensiones de los gránulos de lipofuscina.
   3. Combinar los dos canales de color para facilitar la identificación de lipofuscina (véase el paso 3.2).
5. Analiza Imagen: Asegúrese de que el tema de realizar los pasos de cuantificación será ciego para probar la identidad de grupo.
   1. Para todas las imágenes, haga clic a la región de interés (ROI) que cubre las estructuras pertinentes, y tiene unas dimensiones similares a las del rendimiento de la inversión a partir de otras imágenes.
   2. A continuación, seleccione el número deseado de los gránulos de lipofuscina que representan cada ROI. Al seleccionar gránulos de lipofuscina dentro de un retorno de la inversión, la aplicación de las siguientes reglas reducirá el sesgo subjetivo.
      1. Elija un lugar consistente para la selección de la primera granulaciónle. Esto puede ser, por ejemplo, el borde más a la izquierda de un retorno de la inversión, y el gránulo que es más próxima al borde siempre será la primera selección.
      2. Uno tras otro, los gránulos de los escogidos que están más cerca de la selección anterior (vecino).
      3. Al elegir el vecino, moverse sólo en una dirección, por ejemplo, sólo buscar en la derecha de la selección anterior. Esta regla evita que la selección está dominado por grupos ocasionales de gránulos densos.
      4. Cuando se completa la selección, evaluar el tamaño de cada partícula lipofuscina con la descripción y la medición de la zona de gránulo respectiva. Utilice las pruebas estadísticas apropiadas para comparar individuos de los diferentes grupos de prueba.

Resultados

Secciones 1 y 2 del Protocolo de detalle cómo los grupos de prueba se pueden obtener a estudiar los atributos de aceleración, más lentos y revierten el envejecimiento en las colonias con una sola cohorte de edad. Para controlar la diferenciación de tipo de trabajo que acompaña a la ontogenia normal, se evaluó el recuento para cosechadoras de forraje ("puntajes de ingreso") para 6 colonias (Figura 1, compare la sección 1). Los gráficos muestran que un cambio considerable de la enfermera...

Discusión

Estamos aquí adoptamos anteriormente descrito se acerca ^{8,16,17,19,20,} e integrarlos en un único flujo de trabajo que facilitará el estudio del envejecimiento flexibles en las abejas de miel. Nuestro objetivo es proporcionar a los científicos que son novatos en este campo con una herramienta estandarizada establecido para obtener material de la muestra correspondiente, y para mejorar la reproducibilidad experimental entre los diferentes equipos de investigación. Mientras que nuestros procedimientos se si...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000