ハニービーモデルの老化、減速し加速し、逆に試験片を得た

要約

ミツバチの労働者では、高齢化が社会的行動ではなく生活年齢に依存します。ここでは、非常に異なる加齢パターンを持つ労働者のタイプが取得され、細胞の老化を分析する方法を示しています。

要約

高度に社会的な動物の社会は密接に関連し、個人間の広大な寿命の違いを備えています。社会性昆虫の中では、ミツバチが寿命や老化における可塑性が社会的要因によって説明される方法を研究するための最良の確立されたモデルです。

ミツバチの労働者階級は、蜜や花粉を集めるひなを傾向がある看護師蜂、および飼料収穫機蜂が含まれています。以前の研究は、脳機能と飛行性能は看護師に比​​べて飼料収穫機でより急速に老化することを示している。飼料収穫機が看護業務に戻すしかし、脳機能は、回復することができます。加速され、逆に機能的な老化のようなパターンは、タンパク質存在量の変化に免疫機能に、変更された代謝資源のレベルにリンクされています。ビテロゲニン、ホルモン制御および細胞防御における適応機能を備えた卵黄タンパク質は、労働者に別の高齢化のダイナミクスを制御し、ネットワーク内の主要な調節要素として機能することができる。

ここでは、看護師や飼料収穫機の出現を監視し、かつ長寿命の看護師に、通常短命の飼料収穫機からの逆転を含め、操作する方法について説明します。当社の代表的な結果は、同様の暦年齢と個人は実験条件の下で飼料収穫機や看護師の蜂に分化する方法を示しています。我々は戻って看護師への飼料収穫機からの行動の逆転を検証する方法を例示している。最終我々は、細胞老化は、リポフスチンの蓄積は、老化の普遍的バイオマーカーを測定することによって評価することができる異なる方法を示している。

社会的な影響をリンクすることができるメカニズムを研究し、可塑性をエージングのために、このプロトコルは、関連するサンプル材料を取得するように設定され標準化されたツールを提供し、将来の研究の間のデータ比較可能性を改善する。

概要

高度に社会的な動物の複雑なコロニーの構造は、生殖カーストとの相互作用によって維持されており、様々な社会的なタスクの動作と、典型的には、非再生労働者のヘルパーカースト。別の労働者では、特定の生理学的適応は、個別のSIBケア行動を可能にし、また極端な寿命の違いにリンクされています。ミツバチとモルラットは社会性の加速、無視できるか^{、1〜3老化}逆転のパターンにリンクされているか調べるために最善の発達した動物モデルを表しています。

ミツバチコロニーでは、単一の産卵女王は、食品用のひな、飼料の傾向が数千人の労働者によって支援され、ガード、体温調節や衛生的な行動⁴に従事。これらの労働者の中で最も長い寿命と非常に短寿命の飼料収穫機、中間体と看護師の蜂、冬（diutinus）蜂です。個人は、しかし、恒久的にWO、あるにバインドされていませんrker型が、柔軟性のある行動個体発生を表示する：彼らは（「時間カースト」）を別の社会的なタスクの動作から変更してください。キャロウミツバチは、最終的には外部の採餌に変更されることがあり、看護師蜂を、傾向ひなに変更することができます。しかし、キャロウの巣のミツバチも最長寿命の冬のハチに変身することができ、かつ短命の飼料収穫機であっても、通常より長い寿命の看護師に戻すことができます。極端な（冬の蜂）と中間体（看護師の蜂）の寿命を持つ労働者が豊富なリソースとよく発達した食料生産および貯蔵器官を持っている- ^（1,5に概説されている）、短命飼料収穫機とは対照的である。しかし、個々の寿命の調節は、個々のリソースバランスの簡単な変更を超えていることは、ゼリーの生産^6、ホルモン制御^7、免疫などの非再生ワーカーカーストに多様な適応機能を備えてい卵黄タンパク質、研究によって示唆されている⁸および抗酸化防御^9。

Fパターン労働者の間で、嗅覚のために確立され、また他の脳や運動機能のためunctional下落（老化）、ミラーの寿命格差^10月13日 。長寿命の冬の蜂¹⁵で検出可能な減少（無視できる老化）の欠如とは対照的に、具体的には、採餌のわずか2週間後の学習機能の大幅な減少は、飼料収穫機¹⁴で同様の死亡率の進行と一致します。

柔軟な老化の分子指紋を識別するために、我々は^8,16,17のエージングタイプの遷移を監視し、操作を可能に確立された実験パラダイムに適応。暦年齢と高齢化に関する作業員型特異的社会的行動の影響を分離することができるサンプルの入手方法1の詳細を実験する。実験2が遅く老化ダイナミクスと看護婦の蜂へと加速した飼料収穫機の逆転を説明しています。実験3はanatomicaによる細胞老化の影響をプロービングするためのアプローチを提供しています細胞の老化（リポフスチン^）18のための確立されたバイオマーカーのL定量化。

プロトコル

1。暦年齢から老化をデカップリング

このセクションでは、同じ暦年齢（「未婚年齢集団」）と、巣のミツバチのコホートを共有する識別された個人の集団で構成され、二重コホートコロニーのセットアップについて説明します。未婚年齢コホートの同じ高齢者は、最終的には別の高齢化ダイナミクスと異なる労働者のタイプに分離する - これらは加速機能低下で減速し、飼料収穫ミツバチと看護婦の蜂です。すべての手順は、1実験コロニーに記載されている。我々は、コロニーの効果が（二反復設計）のために制御することができるように複製する少なくとも二つのコロニーのための実験を​​行ったが、助言する。

1. ダブルコホートコロニーハイブボックスの準備：1、通常のハイブ蜂蜜を2食品の櫛を受けボックス、花粉と他の食品くし、および2の空の櫛を準備します。 3,000人以上と交配女王だけでなく、ドナー植民地を見つけることを確認してください巣のミツバチ。どちらも、（1.3）後で紹介します。
2. 同じような生活年齢を持つ個人の入手方法およびマーキング：出現しようとしている密封されたひなに櫛を収集します。 1複製のために3,000〜5,000キャップひなのセルの合計で櫛を集めることを期待しています。それぞれについて、母親の遺伝子型（ハイブ起源）の歪んだ分布を回避するために、少なくとも三つの異なるハイブ源からひなのバランスのとれた量を使用して複製します。
   1. 60〜70パーセントの相対湿度を34℃に設定したインキュベーター内ひな櫛を配置します。新興ひなを免れることはできないような方法で櫛を保管してください。
   2. ミツバチが2日間出てみようと胸郭（ 例えばユニPOSCA、三菱鉛筆株式会社）に小さなペンキタグでこれらのミツバチをマーク。ペンキマークは未婚年齢コホート（出現の日）のミツバチを特定できるようになり、その他の複製コロニーと区別するために。
3. 私のコホートが含まれて二重コホートコロニーをセットアップdentified、未婚年齢の蜂：日に若いミツバチがマークされているが、参照してください（（。議論ではセクション1と比較されたい）、そして前に準備したハイブボックスにこれらのマークされていないミツバチを追加ドナーコロニーからの約2,500〜3,000巣のミツバチを集めるステップ1.1）。後者の人々は、正体不明の巣のハチのコホートを構成する。
   1. 最初は女王ケージ（市販品）に限定される女王を追加します。働き蜂がゆっくりと女王を解放するために食用キャンディー（ 例えば Apifonda、SüdzuckerAG、マンハイム/オクセンフルト、ドイツ）でケージを封印。
   2. 未婚年齢集団を構成する新規に登場し、マークされたミツバチを追加します。これらのハチは、マークされた個人であり、以下のすべてのステップのためのフォーカスグループである。
4. 発症を採餌し、飼料収穫機のマーキングモニタリング：発症と未婚年齢コホートにおける看護師への飼料収穫機の移行動態を評価するために、採餌活動eの人口統計開発を監視各コロニーのために非常に先日。コロニーが設立された後の5日間（ 図1）のカウントを開始する。
   1. 一定時間で3×20分間の観察期間内の航空券（入場カウント）採餌から戻っハチの総数をカウントします。 （説明を参照）配向便の期間中にハチをカウントしないようにしてください。
   2. 入場数は（> 100入学カウント/日）を開始するために、かなりの採餌活動を示している場合には、飼料収穫機のマーキングを開始。そのためには、未婚年齢コホート（シングルマーク個人）の飼料収穫機は、最初の採餌便から復帰後第ペンキマークを受ける。この塗料マークは発症を採餌の日を指定し、後で各飼料収穫のための採餌年齢を識別することができます。
   3. ミツバチ十分な数のマークが付けられているまで毎日マーキングを繰り返します。これらのハチは、典型的には14日後に、熟成させた後にマーク飼料収穫の十分な数を推定するため、これ以上の5〜10％以上の回収率を期待する採餌。
5. サンプリング：すべての最初にマークされたミツバチが、同様の暦年齢を持っているので飼料収穫機が≥14日間採食しているときには、看護師や古い飼料収穫の年齢をマッチさせたグループは、同時に収集することができます。
   1. 単一のマークされた看護婦の蜂が巣箱内に収集され、看護行動（オープンひな細胞に置く頭と幼虫の摂食とクリーニング）によって識別されます。
   2. 毎日の採餌活動が始まる前に、二重マーク飼料収穫もハイブ内で収集されます。
   3. 十分な換気を提供するケージ（チューブ、箱）でミツバチを収集し、さらなる処理まで暗く保つ。代わりに、トランスクリプトーム、エピジェネティックやプロテオミクス研究のために、直接液体窒素中で凍結ミツバチスナップ。すべてのテストグループから個人のバランスの取れた数値を収集し、コロニーを複製する。

2。ハイブの人口統計の変更によって遅く加齢に伴って労働者に迅速な労働者の逆転

このセクションが遅く、加齢に伴う労働者に促進老化（飼料収穫機）（看護師蜂）との労働者からの反転が行われている方法について説明します。飼料収穫機は、通常のひなのケアに携わる看護師のミツバチの不足が発生した場合、このような行動の逆転は、誘導される。復帰の手順は、単一のコロニーを分離する2つのじんましんに複製：看護師の蜂画分（「看護師由来」）、および飼料収穫機画分（「飼料収穫由来」）を持つ別の1と1ハイブを。成功した反転後、プラスチックの可能性症状と高齢化が反転すると元に戻り、労働者、継続的な飼料収穫、継続的な看護師の蜂や新入飼料収穫機で未婚年齢コホートで研究することができる。以前のように、一つの年齢層ではなく、正体不明の巣のミツバチの集団の識別されたハチは、実験的なフォーカスグループを構成している。

1. 準備：看護師とのじんましん（シングルマーク）と飼料収穫機（ダブルマーク）を複製、前のセクションで説明したように利用できるようになります。復帰が完了した後に十分な取得を確実にするために複製コロニーあたり500未満とマーク飼料収穫機での復帰を開始しないようにしてください。
   1. 反転後のテストグループを安全に識別のためには、元のハイブ全体飼料収穫機の人口は、復帰前にオフにマークされていることが重要です。以下の手順は、1つのレプリケートに記載されている。
   2. 復帰前日に、飼料収穫機由来のハイブの1の追加のハイブボックス（ステップ1.1参照）を準備します。クイーン、ドナーハイブから2ひな櫛の位置を確認します。実験コロニーへの転送前に、これらのとさかからすべての大人のハチを離れて磨く。一ケージ女王（ステップ1.3を参照）、1ひなコームは、オリジナルハイブボックスに女王とひな櫛に置き換えられます。女王とひなコムの他のセットは、新しいハイブボックスの次の日に使用されます。両方、オリジナルと新しいハイブがいることを確認することをお勧めしますための新しいひな櫛とエイリアンクイーンの同じような配分に分離飼料収穫機や看護師Sも同様に経験がハイブ合図（「ハイブ臭い」）を変更します。
2. 復帰：午前中だけ復帰する前に、飼料収穫機由来の割合を受け取る新しいボックスにケージ女王とひなコムを追加します。ピーク採餌時間が開始されるまで待ちます。そして、少なくとも100メートル離れて元の位置からマークされた飼料収穫機や看護師の蜂、元植民地を移動します。
   1. 元の場所に、ひなのみ女王と飼料収穫由来ハイブの新しいボックスを設定します。
   2. 飼料収穫機は脱臼オリジナルハイブボックスをオンのままにし、元の場所に戻って向かいます。飼料収穫機は巣のミツバチからの飼料収穫機の人口の分離を完了するために、次へを達成するために2時間を元の場所に戻ることができます。
   3. その後、分離を終了するために、オリジナルの、今 "看護師由来の「ハイブを閉鎖し、少なくとも3キロ離れて養蜂場に移す。
3. 成功社会的タスクのハイブの保守お ​​よび監視反転：健康、オープンひなのために定期的に実験的なじんましんを確認してください。
   1. コロニー操作後の最初の日の間に潜在的な病原体の負荷を軽減するために、無人、死んだひなを交換してください。
   2. コームを交換したとき、または復帰実験が完了したときに飼料収穫由来ハイブ内で成功し逆転を検証するには、（ 図2）、再びこれらを導入する前にひなの櫛の写真を撮る、と。以前に上限なしのひなと、オープン、ライブひなとの領域は飼料収穫由来コロニーでの看護活動の信頼性の高いマーカーである。
4. サンプリング：社会的な反転に伴う生理学的効果は3-8日飼料収穫機や看護後に検出することができる分離した。
   1. 我々は、すべての試験群、 すなわち逆戻り労働者と継続的な飼料収穫機（飼料収穫由来ハイブ）だけでなく、逆転が開始された8日後の継続看護師や、新たに採用さ飼料収穫機（看護師由来ハイブ）をサンプリング助言。
   2. コルステップ1.5で説明したようにセレクトサンプル。

3。リポフスチンの定量化によって労働者タイプ特異的細胞老化のパターンを分析する

リポフスチンは、細胞老化の普遍的なバイオマーカーである。真性累積生成物として、リポフスチンの特異的自己蛍光（発光_最大 = 530から650 nm）を¹⁸検出のために使用することができる。

1. 切開および固定：動かまで氷上チルミツバチが、削除して、所望の組織標本を解剖する。
   1. 4℃で一晩のインキュベーションのために、固定液中（pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水、PBS中4％パラホルムアルデヒド）を転送する
   2. PBS中のサンプル3回洗浄します。
2. 組織処理および取付け：振動刃ミクロトーム、 例えばライカバーモント1000S（ライカバイオシステムズ、ボック、ドイツ）を使用して、例えば、それ以上40μm以下の厚さのセクションに組織サンプルをカットします。
   1. クリアリングのために、30％のグリセロール（PBS）中で一晩組織切片をインキュベートし、50％グリセロール（PBS）中の別の2時間。
   2. 50％グリセロール（PBS）に、顕微鏡スライド上のセクションをマウントします。長期保存のためのシールカバーはマニキュアでスリップ。
3. 像取得：リポフスチンに検出するために、私たちはλ= 514、561nm又は励起ための同様のレーザラインを与えるレーザー走査焦点顕微鏡で使用することをお勧めし、検出器の帯域幅は570から650程度に設定して。
   1. リポフスチンのよりよい識別のために、第二のチャネルが含まれ、より短い波長のスペクトル（励起= 405nmで、発光= 410から450ナノメートル）での同時スキャンを実行する。より長い波長チャネルの両方、リポフスチン顆粒を明らかにするだけでなく、自家蛍光による気管および他の非グラニュラ構造への非特異的な「バックグラウンド」であろう。第二の、より短い波長チャネルは非特異的自己蛍光を明らかにではなく、リポフスチンう。このように、リポフスチン識別は設備などが可能いずれか一方だけがリポフスチン特定の蛍光を顆粒を明らかにして、両方のチャネルの信号を比較することでtated。
   2. 高解像度の画像を取得するために40Xの倍率以上、1.25以上、好ましくは開口数を有する対物レンズを使用する。スキャン画像は、約^{100×100×10〜3}の寸法のスタック。すべての個々の組織サンプルは、複数の画像スタックによって表されなければならない。
   3. 技術的変動に起因する個体内および個体間のばらつきを低減するために、常にレーザパワーと検出器の感度を一定に保つ。
   4. 日日々の技術的な変化によって偏りを減らすために、いくつかのスキャンの各セッションのすべてのテストグループの等しいサンプル数をスキャンします。
4. 画像処理：顕微鏡画像スタックの高度な処理を可能モジュールとソフトウェアパッケージを使用して、例えばImageJの（健康、ベセスダ、メリーランド州、米国の米国の国立研究所、gej.nih.gov / ijは/ "ターゲット=" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/）。
   1. 3次元画像スタックのそれぞれについて最大2D投影を生成する。
   2. 高周波ノイズを減衰させる、及びリポフスチン顆粒の寸法を有する構造を維持するために、適度なカーネルサイズを有するガウスフィルタを適用する。
   3. リポフスチンの識別を容易にするために、両方の色チャネルをマージする（ステップ3.2参照）。
5. 画像分析：定量化の手順を実行して、被験者がテストグループIDに盲目になることを確認してください。
   1. 全ての画像について、まず、関連する構造をカバーし、他の画像からのROIと同様の寸法を有し、関心領域（ROI）を選択します。
   2. その後、各ROIを表すリポフスチン顆粒の希望する番号を選択します。 ROI内のリポフスチン顆粒を選択する場合は、次の規則の適用は、主観的なバイアスを減らすことができます。
      1. 最初granuを選択するための一貫性のある場所を選択ル。これは、例えば、ROIの最左端とすることができ、縁部に最も近い顆粒は、常に最初の選択であろう。
      2. 続々は、顆粒は前の選択（次の隣）に最も近いものが選択される。
      3. 次の隣を選択する際に、唯一の前の選択から右の検索たとえば、一方向のみに移動する。この規則は、選択が高密度に充填された顆粒の時折のクラスタによって支配されることを防ぐことができます。
      4. 選択が完了すると、それぞれの顆粒領域を概説し、測定することにより、各リポフスチン粒子の大きさを評価する。別のテストグループの個人を比較するために、適切な統計的検定を使用してください。

結果

試験群は加速し、減速し、単一の年齢層を有するコロニーの老化を逆の属性を研究するために得ることができるどのようなプロトコルのセクション1と2に詳細。我々は（ 図1、セクション1と比較されたい）6コロニーについて飼料収穫機のカウント（「入学カウント」）を評価し、正常な個体発生に伴う労働者タイプの分化を監視します。グラフは、個人が10日以上経過した前に、...

ディスカッション

ここでは、前述の^{8,16,17,19,20に}近づく採用し、ミツバチに柔軟な老化を研究容易にする単一のワークフローに統合する。我々の目的は、関連するサンプル材料を得るために標準化された設定ツールを使用してこのフィールドの初心者である科学者を提供し、異なる研究チーム間の実験的再現性を改善することである。私たちの手順が簡略化されており、それ以前の説明（実施例⁸

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000