المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

Summary

نحن راثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين في مختلف المناصب المستهدفة في GPCRs وتظهر براعة المجموعة azido في تطبيقات مختلفة. وتشمل هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من النوع من الاختزال، ومواقع محددة من التعديل bioorthogonal GPCRs مع علامة الببتيد حاتمة أو التحقيق الفلورسنت.

Abstract

لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للG-البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) يشير المجمعات، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتقديم تحقيقات إعلامية أو التسميات في المستقبلات التي أعرب عنها التي لا التشويش على وظيفة مستقبلات. كنا العنبر التكنولوجيا رامزة لقمع وراثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في العديد من المناصب المستهدفة في GPCRs أعرب heterologously في خلايا الثدييات. ويتضح براعة المجموعة azido هنا في التطبيقات المختلفة لدراسة GPCRs في البيئة الخلوية المحلية أو في ظل ظروف solubilized المنظفات. الأولى، ونحن يبرهن على وجود خلية مقرها استهداف التكنولوجيا photocrosslinking لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من حيث النوع من الاختزال crosslinked صغيرة جزيء يجند المسمى التريتيوم لترميز وراثيا حمض azido الأمينية. نحن ثم إثبات التعديل في مواقع محددة من GPCRs من قبل bioorthogonal شتاودينغر-Bertozzi ربط REACنشوئها يستهدف مجموعة azido باستخدام المشتقات الفوسفين. نناقش استراتيجية عامة لاستهداف علامات الببتيد حاتمة للبروتينات غشاء أعرب في الثقافة والكشف عنها باستخدام نهج يستند ELISA خلية كاملة. أخيرا، وتبين لنا أن AZF-GPCRs يمكن الموسومة بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. المنهجيات التي تمت مناقشتها هي عامة، في أن يتمكنوا من حيث المبدأ يمكن تطبيقها على أي موقف الأحماض الأمينية في أي أعربت النوع من الاختزال لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.

Introduction

تشمل Heptahelical G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) والفصيلة من البروتينات الغشاء ديناميكية للغاية التي تتوسط إشارات خارج الخلية الهامة والمتنوعة. في النموذج الكلاسيكي، ويقترن تنشيط مستقبلات مع التغيرات متعلق بتكوين التي يسببها يجند. ^{1، 2} وقد وفرت التطورات الأخيرة في علم الأحياء الهيكلي للGPCRs البصيرة كبير على الآليات الجزيئية للإشارات عبر الغشاء. ^3-5 ومع ذلك، ولكي نفهم بدقة أكبر الكيميائية آلية الوظيفية والهيكلية للديناميات النوع من الاختزال الإشارات، لا بد من أدوات نهج لدمج تحقيقات الجزيئية والكيميائية بالمعلومات لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.

تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تكييفها طريقة لموقع تحديدا إدخال غير الحكومية أو الحد الأدنى تحقيقات إقلاق إلى المستقبلات التي أعرب عنها على أساس الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAA) الطفرات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع رائدة من قبل شولتز وجoworkers. ⁶ ونحن الأمثل منهجية الطفرات UAA لتحقيق التعبير ذات الإنتاجية العالية ونظام الطفرات للبروتينات مثل GPCRs، التي يصعب التعبير عنها في أكثر الأنظمة الأخرى مغاير من خلايا الثدييات. باستخدام القامع المهندسة متعامد الحمض الريبي النووي النقال وتطورت أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال الزوج مخلقة لUAA محددة، قدمنا ​​موقع UAAs تحديدا في GPCRs الهدف التعبير عنها. إدماج الناجح لUAAs، ف الاسيتيل-L-ألانين (ACF)، فقد ثبت ف بيروكسايد-L-ألانين (BzF)، وف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في GPCRs نموذجنا - رودوبسين والبشرية CC مستقبلات chemokine، CCR5. ^{7، 8}

من حيث المبدأ، وهي UAA يمكن ترميز وراثيا في أي موقف داخل تسلسل البروتين وهذه الخاصية هي أداة لا تقدر بثمن البيوكيميائية، لأنها تتيح احد كودون مسح وGPCR الهدف. ونحن نركز هنا على وجه التحديد على براعة من UAA، ايه زد اف، التي لديها رد الفعل عزيالقيام شاردة. بالإضافة إلى بمثابة الأشعة تحت الحمراء (IR) التحقيق فريدة من نوعها، ^{8، 9} ايه زد اف يمكن أيضا أن تكون بمثابة photoactivatable عبر رابط نتيجة للتفاعل مع الأمينات الأولية المجاورة أو الهيدروجين الأليفاتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجموعة azido خاملة بيولوجيا المشاركة بصفة انتقائية مقبض الكيميائية في التفاعلات وضع العلامات bioorthogonal. نحن هنا تقديم أمثلة توضح التطبيقات المفيدة التأسيس في مواقع محددة من AZF في GPCRs، مثل photocrosslinking تستهدف فخ مجمع مستقبلات يجند، وتعديل GPCRs بواسطة bioorthogonal علامات حاتمة واستراتيجيات وضع العلامات الفلورية.

وقد استخدمت الكواشف Photoactivatable لدراسة النظم البيولوجية منذ 1960s. ⁽¹⁰⁾ وفي هذه الفترة، تم الإبلاغ عن وفرة من التجارب يشابك مستقبلات يجند لدراسة المجمعات النوع من الاختزال، ومعظمها ينطوي على استخدام بروابط photoaffinity ^{11، 12} ومع ذلك، فإن هذه تطبيقات تقتصر من الناحية الفنية، لأنها تحتاج اليهاالتوليف (ه) من بروابط تحمل مجموعة يشابك. ^13-15 وعلاوة على ذلك، مع شاردة crosslinker في يجند، فإنه يمثل تحديا لتحديد موقع تشعبي على النوع من الاختزال. إدخال موقع تحديدا الجماعات photocrosslinking كما UAAs إلى بروتينات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع هو النهوض قيمة ^{16، 17} طورنا تقنية photocrosslinking التعرف على واجهة ملزمة للمستقبلات التي تشارك في تشكيل مجمع مستقبلات يجند في الخلايا الحية من خلال إدخال مجموعات عطوب بالضوء في GPCRs ^{18، 19} نحن هنا وصف بروتوكول تجريبي وطريقة تحليل البيانات لتطبيق هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد موقع ملزمة ليجند جزيء صغير، maraviroc معالج بالتريتيوم، على CCR5. تستفيد هذه الطريقة على تقدير دقيق للمقبض المشعة على يجند، بالإضافة إلى الإبقاء على التركيبة الكيميائية الأم ليجند.

التقنيات المعتمدة مضان دعم فهم دقيق لأساس الهيكلية للتنشيط مستقبلات عن طريق التحقيق مباشرة بتكوين الدولة من مستقبلات ^{20، 21} ومع ذلك، وتقنيات امتلاك المرونة اللازمة لإدخال العلامات الفلورية في GPCRs هي موقع على وجه التحديد محدودة. ونحن مهتمون في توظيف استراتيجيات التعديل الكيميائي لتيسير كشف bioorthogonal واحدة جزيء (SMD) من النوع من الاختزال المجمعات الإشارة. يمكن ²² المجموعة azido المشاركة في كيمياء bioorthogonal مثل شتاودينغر-Bertozzi ربط، ^{23، 24} خالية من النحاس وروجت سلالة أزيد- إضافة حلقية آلكاين (SpAAC) ²⁵ والمحفزة النحاس وأزيد آلكاين إضافة حلقية (CuAAC) ²⁶ ونحن نركز هنا على ربط رد فعل شتاودينغر-Bertozzi التي تنطوي على ردة فعل معينة بين أزيد والفوسفين. ونحن لشرح استخدام اثنين من المشتقات الفوسفين مختلفة، مترافق إلى حاتمة الببتيد (FLAG الببتيد) أو تسمية الفلورسنت(فلوريسئين) لتحقيق تعديل في مواقع محددة من GPCRs.

نحن الأمثل سابقا الظروف لوضع العلامات الخاصة بكل موقع من رودوبسين ايه زد اف المتغيرات باستخدام التركيب البلوري للأشعة السينية والمحاكاة الديناميكية لاختيار المواقع المستهدفة التي هي المذيبات يتعرض ^{27، 28} ونحن أيضا يتضح جدوى لتحقيق وضع العلامات خالية من الخلفية بواسطة شتاودينغر- Bertozzi ربط ²⁹ نظهر هنا للإجراءات العامة المستخدمة لتحقيق وضع العلامات الفلورية من مستقبلات المنظفات solubilized الذي يجمد على مصفوفة immunoaffinity وبعد ذلك تصور من قبل مضان في هلام. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن على تمديد مفيدة عن هذه الاستراتيجية ووضع العلامات لتحديد مواقف قابلة للوضع العلامات على مستقبلات الهيكل غير معروف، CCR5. ويتم ذلك من يستخدم إستراتيجية علامات الببتيد حاتمة المستهدفة التي تعتمد على تعديل bioorthogonal من AZF-النوع من الاختزال المتغيرات في شكل شبه عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا. هذا ³⁰طريقة يستغل متعددة الخطوات خصائص الكشف عن ELISA سطح الخلية لرصد الأحداث ووضع العلامات.

المنهجيات نناقش هنا هي عامة ومن حيث المبدأ يمكن تطبيقه على أي النوع من الاختزال تدمج مع ايه زد اف باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. في البروتوكولات المعروضة هنا نحن بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير خلايا الثدييات مستقبلات تدمج مع UAAs مثل ايه زد اف باستخدام طريقة غير طبيعية من الأحماض الأمينية الطفرات وتطبيقاتها اللاحقة لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للGPCRs.

Protocol

1. التأسيس الوراثية موقع معين من الأحماض الأمينية غير طبيعي في GPCRs

1. الحفاظ على خلايا HEK293T في DMEM (4.5 غرام / لتر من الجلوكوز، 2 مم الجلوتامين) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
2. بالنقل الخلايا نمت لالتقاء 60-80٪ في لوحة 10 سم باستخدام Lipofectamine زائد كاشف.
   1. إلى 750 ميكرولتر DMEM، إضافة 10 ميكرولتر كاشف زائد، 3.5 ميكروغرام من [كدنا] النوع من الاختزال (pMT4. رو أو pcDNA 3.1. CCR5) التي تحتوي على العنبر وقف رامزة في الموضع المطلوب، 3.5 ميكروغرام من الحمض الريبي النووي النقال القامع كدنا] (pSVB.Yam) و 0.35 ميكروغرام من متحولة الأمينية أسيل الحمض الريبي النووي النقال مخلقة [كدنا] لف azido-L-ألانين (pcDNA.RS). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أداء أيضا ترنسفكأيشن مماثلة باستخدام وزن النوع من الاختزال كدنا] (لا تحتوي على وقف كودون العنبر) لتكون بمثابة السيطرة. إضافة هذا الخليط إلى 750 ميكرولتر من DMEM مع 17 ميكرولتر Lipofectamine. بعد توازنه 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجلبالحجم الإجمالي إلى 4 مل.
   2. تطبيق وسائل الاعلام نضح في 10 سم لوحة، وخليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا، والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي. بعد 4-6 ساعة، تكملة الخلايا مع 4 مل DMEM تحتوي على 20٪ FBS و 1 ملي ايه زد اف.
3. في اليوم التالي، واستبدال وسائط النمو مع DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف.
4. خلايا الحصاد 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لتحليل التعبير أو الشروع في إجراءات photocrosslinking أو وضع العلامات الموضحة في المقاطع التالية.
   1. تأكيد التعبير عن العنبر متحولة النوع من الاختزال في وجود UAA في وسائل الإعلام النمو. ونحن نفعل ذلك من خلال الكشف طخة مناعية الغربية. ليز بيليه خلية في 1٪ (ث / ت) دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 XG وطاف حل في إطار الحد من الظروف التي كتبها SDS-PAGE. نقل إلى غشاء PVDF وإجراء تحليل لطخة مناعية للكشف عن كامل طول مستقبلات التعبير باستخدام ال³¹ ه 1D4 خريطة موقع (مركز زراعة الخلايا الوطني)، الذي يعترف حاتمة هندسيا في C-محطة من مستقبلات.

2. تعيين موقع ملزم يجند طريق المستهدفة Photocrosslinking

1. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ووسائل الإعلام نضح من الخلايا واستبدالها مع 4 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). العودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. resuspend الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى أنبوب فالكون. أجهزة الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة لخلايا بيليه ونضح طاف.
3. resuspend الكرية خلية في التخزين المؤقت محلول الملح 1X هانك تحتوي على 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، 0.2٪ BSA ويجند معالج بالتريتيوم في تشبع تركيز ملزمة لطول المطلوب من الوقت ودرجة الحرارة لضمان تشكيل مستقبلات يجند المعقدة.
4. نقل تعليق خلية إلى 24 أو 96 جيدا جيدا لوحة لتنشيط ضوئي من 365 نانومتر في ايه زد اف (مثل استخدام الأشعة فوق البنفسجية مصباح) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. Maintaiن لوحة على الجليد لتجنب التدفئة العينة وتحلل الخلية.
5. نقل الخلايا إلى أنبوب إيبندورف، أجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه، وإزالة طاف، والشروع في التحليل. ويمكن تخزين الكريات في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
6. resuspend والكريات خلية في تحلل العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DDM، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 ومثبطات الأنزيم البروتيني. بعد حضانة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي المحللة خلية لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج، ونقل طاف لأنبوب جديد.
7. إضافة خريطة موقع 1D4-2B sepharose و الراتنج لطاف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لimmunopurify النوع من الاختزال باستخدام المهندسة C-محطة 1D4 خريطة موقع حاتمة. اليوم التالي تغسل حبات عدة مرات مع العازلة تحلل. عينات أزل مع 1٪ SDS عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع اهتزاز.
8. نقل جزء من شاطف إلى 15 مل قارورة تحتوي على السائل التلألؤ والاعتماد على عداد التلألؤ بيتا لقياس كمية ملزمة محددة من يجند معالج بالتريتيوم إلى عشرةه مستقبلات.
9. حل المتبقية 1D4 ماب شاطف تنقيته بواسطة معيار الكهربائي للهلام. نستخدم 4-12٪ هلام SDS-PAGE ثم نقل شبه جافة لغشاء PVDF لimmunoblotting. نحن تشمل أيضا حارة مع معيار البروتين سلم لتوجيه التقريب البصري من الوزن الجزيئي.
   1. منع غشاء PVDF مع الحليب 5٪ في المخزن TBS تحتوي على 0.05٪ توين 20. بحث الغشاء لتأكيد كامل طول مستقبلات التعبير مع 1D4 ماب تليها HRP، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية.
   2. علاج مع تعزيز لمعان كيميائي (ECL) كاشف وفضح غشاء لتصوير الإشعاع الذاتي لتصور فيلم العصابات.
10. قطع الغشاء بشفرة حلاقة لفصل كل حارة العينة، تليها قطع عند علامات محددة الوزن الجزيئي. نقل شرائح الغشاء إلى قارورة تحتوي على السائل التلألؤ. تحديد كمية التريتيوم في كل جزء الغشاء عن طريق عد على عداد بيتا التلألؤ.
11. تحديد إيجابيةphotocrosslink مع الكشف عن التريتيوم في الكتلة الجزيئية واضح يساوي مجموع تلك من النوع من الاختزال ويجند.

3. استهدفت توصيف حاتمة وخلية السطح انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)

1. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا مع 1 مل برنامج تلفزيوني 1X ويعرض للتريبسين مع 1 مل 0.25٪ التربسين لمدة 3 دقائق. تكملة مع 9 مل DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف. الخلايا resuspend وحساب كثافة الخلية. نستخدم عدادة الكريات القياسية.
2. قبل علاج، واضحة من أسفل لوحة 96 جيدا عالية ملزم مع 100 مل من 0.01 ملغ / مل بولي-D-يسين لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرارا مع برنامج تلفزيوني 1X والهواء الجاف.
3. لوحة 200 ميكرولتر من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في مناطق ذات كثافة من 6 × ⁰⁴ حتي 08 أكتوبر × 10 ⁴ خلية / جيدا لوحة 96 جيدا والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
4. اليوم التالي إعداد الخلايا لوصفها. بلطف يغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / جيد برنامج تلفزيوني 1X رس إزالة أي ايه زد اف تحتوي على وسائط النمو. ضمان بقاء الخلايا الالتزام، على سبيل المثال، باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم ^{2 + 2 +} والمغنيسيوم.
5. إعداد 50-200 ميكرومتر FLAG-triarylphosphine وضع العلامات الكاشف في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني من مخزون الحفاظ على 5-20 ملم في برنامج تلفزيوني. تطبيق 60 مل إلى كل بئر (في ثلاث نسخ لكل متحولة العنبر) والعودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات. الحفاظ على مجموعة من الآبار دون علاج التسمية في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني. وتشمل أيضا التحكم بالوزن النوع من الاختزال للمقارنة مع المتغيرات AZF-النوع من الاختزال.
6. غسل الخلايا 3 مرات مع 100 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة، BB (1X PBS، 0.5٪ BSA)، لإزالة التسمية غير المتفاعل تماما.
7. تطبيق 100 ميكرولتر / جيد من 4٪ بارافورمالدهيد (أعدت من الأسهم 16٪ في برنامج تلفزيوني 1X) إلى الخلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل ثلاث مرات مع BB.
8. تنفيذ معيار بروتوكول ELISA سطح الخلية للكشف عن مستقبلات مستقبلات صفت والتعبير. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ل1.5 ساعة على الجليد تليها الثانويةالحضانة tibody في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
   1. إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة FLAG M2 الأجسام المضادة (مثل 1:2،000 التخفيف من الأجسام المضادة المحرز في BB) للكشف عن FLAG الببتيد حاتمة من FLAG-triarylphosphine وضع العلامات كاشف. كما بحث غير تسمية الآبار تعامل على أنها سيطرة سلبية. إضافة لمكافحة CCR5 2D7 (نستخدم 1:500 تمييع) الأجسام المضادة لمجموعة منفصلة من الآبار لتحديد وزن أو AZF-النوع من الاختزال التعبير سطح الخلية.
   2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع BB، واحتضان مع 100 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية (1:2،000 التخفيف).
   3. غسل خلايا بعناية خمس مرات مع BB. إضافة 50 ميكرولتر العازلة الكشف: Amplex الأحمر، 20 ملي H ₂ O _2، برنامج تلفزيوني 1X (نسبة 1:10:90)، واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع البيانات الطيفية على مضان متعددة كذلك قارئ لوحة في _السابق λ = 530 _م وλ = 590.

4. Bioorthogonal الفلورسنت وصفها من GPCR

1. ليز10 ⁷ خلايا تحصد معربا عن بالوزن أو AZF-رودوبسين المتغيرات في 1 مل الانحلالية العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DM، 50 ملي HEPES أو تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 مم CaCl ₂ ومثبطات الأنزيم البروتيني ل1 ساعة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة، وجمع الكسر طاف.
2. إضافة 100 ميكرولتر 1D4-MAB الراتنج sepharose و 2B لالتقاط مستقبلات باستخدام المهندسة C محطة 1D4 حاتمة. احتضان لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية. غسل الراتنج ثلاث مرات مع 0.1٪ (ث / ت) في DDM 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.3.
3. إضافة 0.1 ملي فلوريسئين-الفوسفين في إجمالي حجم 0،3-0،5 مل لتسمية مستقبلات يجمد على مصفوفة immunoaffinity (1D4-MAB sepharose و 2B). احتضان لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي وإزالة طاف. غسل الراتنج لإزالة التسمية غير المتفاعل.
4. أزل مستقبلات المسمى مع العازلة 100 مل شطف تحتوي على 0.1٪ (ث / ت) DDM و 0.33 ملغ / مل ببتيد تساعي (C9 الببتيد ضد حاتمة 1D4)في 2 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.0 قبل الحضانة على الجليد لمدة 1 ساعة.
5. لحل عينات صفت من قبل SDS-PAGE تحت ظروف الحد. غسل المواد الهلامية لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني ومن ثم تصور وسم ايه زد اف-النوع من الاختزال بواسطة مضان في هلام. على سبيل المثال، استخدام الماسح الضوئي مضان مبائر مع 488 نانومتر طول الموجة الليزر للكشف عن مستقبلات تعديل مع فلوريسئين.

النتائج

استخدمنا منهجية الطفرات الأحماض الأمينية غير طبيعي للموقع تحديدا تقديم تحقيقات الجزيئية إلى النوع من الاختزال باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. المخطط في الشكل 1 يحدد الخطوات البارزة لمنهجية وتطبيقات مختلفة من دمج UAA تنوعا، ف azido-L-ألانين (ايه زد ا...

Discussion

نحن هنا وصف منهجية قوية لإدراجها في مواقع محددة من التحقيق على رد الفعل، ايه زد اف، في GPCRs وإظهار ثلاثة تطبيقات مفيدة من هذه الأداة لدراسة بنية وديناميات GPCRs. لدينا وسيلة لموقع تحديدا دمج UAAs تلتف مشكلة أساسية مع استراتيجية بديلة تقوم على وصفها كيميائيا ^{32، 33} أو رب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials