遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

要約

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。

要約

複合体シグナル伝達Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の構造的および動的研究を容易にするために、新しいアプローチは、受容体機能を撹乱しないで発現される受容体に有益なプローブ又は標識を導入するために必要とされる。我々は、遺伝的にエンコードにアンバーコドン抑圧技術を使用した非天然アミノ酸、異種哺乳動物細胞において発現されたGPCRの様々な標的位置でのp-アジド-L-フェニルアラニン（AZF）。アジド基の汎用性をネイティブな細胞環境や洗剤可溶化条件の下でのGPCRを研究するさまざまなアプリケーションで、ここに示されている。まず、トリチウム標識した小分子リガンドは、遺伝的にコードされたアジドアミノ酸に架橋されるGPCRのリガンド結合ポケット内の残基を同定するための細胞ベースの標的化光架橋技術を実証する。次に、バイオ直交シュタウディンガー·ベルトッツィライゲーションREACによるGPCRのサイト固有の変更を実証ホスフィン誘導体を用いたアジド基を標的たTiON。私たちは、全細胞ベースのELISA法を用いて標的ペプチドエピトープでの培養発現する膜タンパク質のタグ付けおよびその検出のための一般的な戦略を議論する。最後に、我々はAZF-GPCRが選択的蛍光プローブでタグ付けすることができることを示している。それらは原理的に活性なシグナル伝達複合体を調べるためにGPCRを発現したいずれかにおける任意のアミノ酸位置に適用することができるという点で論じ方法は、一般的である。

概要

ヘプタヘリカルGタンパク質共役受容体（GPCR）は、重要かつ多様な細胞外シグナルを媒介する高度に動的な膜タンパク質のスーパーファミリーを含む。古典パラダイムでは、受容体の活性化は、リガンド誘導性立体構造変化に連結されている^{。1は、GPCR}の構造生物学における²近年の進歩は膜貫通シグナル伝達の分子機構に重要な洞察を提供してきました^。3-5が、より高い化学的精度で理解する作用機序およびGPCRシグナル伝達の構造力学は、アプローチのツールキットは、活性なシグナル伝達複合体を調べるために有益な分子や化学プローブを組み込むことが必要である。

この目的のために、我々は、具体的には、部位以前シュルツとCによって開拓アンバーコドン抑制技術を使用して非または非天然アミノ酸に基づいて発現する受容体への侵襲摂動プローブ（UAA）突然変異誘発を導入する方法を適応さ^oworkers。6私たちは、このような哺乳動物の細胞以外のほとんどの異種系の中で表現するのが難しいのGPCRなどのタンパク質のための高収量発現および変異誘発システムを実現するために、UAA突然変異誘発法を最適化した。直交設計サプレッサーtRNAを使用して、特定のUAAのためのアミノアシルtRNA合成酵素のペアを進化させ、我々は部位特異的に発現される標的GPCRをでUAAsを導入しました。 UAAsの成功した組み込みは、p-アセチル-L-フェニルアラニン（ACF）に、p-ベンゾイル-L-フェニルアラニン（BZF）、およびp-アジド-L-フェニルアラニン（AZF）は、我々のモデルのGPCRにおいて実証されている-ロドプシンおよびヒトCCケモカイン受容体、CCR5 ^図7、図8

原理的には、UAAは、遺伝的にタンパク質配列内の任意の位置で符号化することができ、それは、標的GPCRの単一コドン走査を可能にするように、このプロパティは、貴重な生化学的ツールである。私たちは、反応性庵治を持つUAA、AZFの汎用性に特に焦点を絞り部分を行う。ユニークな赤外線（IR）プローブ^、8として機能することに加えて^、9 AZFはまた、隣接する第一級アミンまたは脂肪族の水素と反応して光架橋基として機能することができる。さらに、生物学的に不活性なアジド基は、バイオ直交標識反応における選択的化学ハンドルとして参加することができます。ここでは、そのようなトラップに目標と光架橋受容体 - リガンド複合体、およびバイオ直交エピトープ標識、蛍光標識ストラテジーによるGPCRの変更などのGPCRの中にAZFの部位特異的組み込みの有用な応用を説明するための例を紹介します。

光活性化試薬は、1960年代から生物学的システムを研究するために使用されてきた^。10この間、受容体-リガンド架橋実験の存在量は、光親和性リガンドの使用を含むほとんどがGPCR複合体を研究することが報告されている^。11、12しかし、これらの彼らはrequirなどのアプリケーションでは、技術的に限られている架橋性基を有する配位子の電子合成^。13-15また、リガンド中の架橋部分では、GPCR上の架橋の位置を特定するために挑戦している。部位特異的に抑制技術アンバーコドンを使用して蛋白質にUAAsとして光架橋基を導入することは、貴重な進歩です^。16、17我々は内受容体-リガンド複合体の形成に関与している受容体に結合界面を識別するために、光架橋技術を開発GPCRの中に光解離性基を導入することによって、細胞を生き^。18,19ここでは、小分子リガンドの結合部位、CCR5にトリチウム化マラビロックを識別するために、この標的化光架橋技術を適用するための実験プロトコルおよびデータ分析の方法を記載している。この方法は、天然のリガンドの化学構造を保持することに加えて、放射性リガンド上のハンドルの正確な定量化を利用する。

蛍光ベースの技術は、直接、受容体の立体配座状態をプローブすることによって受容体活性化の構造的基盤を正確に理解してサポートしています^{。20は、21しかし} 、GPCRの中に蛍光標識を導入する柔軟性を有する技術は部位特異的に限られている。我々は、GPCRのシグナル伝達複合体の単一分子検出（SMD）を容易にするために、バイオ直交化学修飾戦略を採用することに興味を持っている^。22アジド基は、シュタウディンガー·ベルトッツィライゲーション^、23、24銅を含まない株をプロモートアジドなどのバイオ直交化学反応に参加することができますアルキン環^{（SpAAC）25、}銅触媒によるアジド-アルキン環^{（CuAAC）。26}我々は、アジドとホスフィンとの間の特定の反応を含むシュタウディンガー·ベルトッツィライゲーション反応にここに焦点を当てています。我々は、ペプチドエピトープ（FLAGペプチド）または蛍光標識に結合つの異なるホスフィン誘導体の使用を示すGPCRのサイト固有の変更を達成するために（フルオレセイン）。

ロドプシンAZFの部位特異的標識が露出し、溶剤である標的部位を選択するためにX線結晶構造と動的シミュレーションを用いて変異体についての我々は以前の条件を最適化した^。27、28我々はまた、シュタウディンガー·バックグラウンドのないラベルを達成するための実現可能性を示すベルトッツィライゲーション^。29ここでは、免疫親和性マトリックス上に固定し、その後、ゲル内の蛍光により可視化された界面活性剤で可溶化受容体の蛍光標識を達成するために使用の一般的な手順を示しています。さらに、私たちは未知の構造、CCR5の受容体上の標識に適した位置を特定するため、このラベル戦略に関する有用な拡張を示しています。これはAZF-GPCRは、細胞ベースの半ハイスループット形式で変異体のバイオ直交修飾に依存している標的化ペプチド-エピトープタギング戦略を用いて行われる^。30本この方法は、標識事象を監視するために細胞表面ELISAの多段階検出特性を利用するものである。

我々はここで議論する方法論は一般的なものであり、原則的に抑制技術アンバーコドンを使用してAZFを組み込んだ任意のGPCRに適用することができます。我々の詳細を非天然アミノ酸突然変異誘発法を用いて、例えばAZFとしてUAAsとGPCRの構造的および動的な研究を促進するそれらの後続のアプリケーションに組み込まれた受容体の哺乳動物細胞発現に関与する工程、ここで提示されたプロトコルである。

プロトコル

1。 GPCRの中に非天然アミノ酸の部位特異的な遺伝子の組み込み

1. 5％CO ₂雰囲気中、37℃で10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した（グルコース、2mMのグルタミンを4.5g / L）DMEMにHEK293T細胞を維持する。
2. リポフェクトアミンプラス試薬を用いて、10cmのプレートで60〜80％コンフルエンスまで増殖させた細胞をトランスフェクトする。
   1. 750μlのDMEM中に、所望の位置にアンバー終止コドンを含む10μlのプラス試薬、GPCR cDNAの3.5μgの（pMT4. RhoのかをpcDNA 3.1。CCR5）、3.5サプレッサーtRNAのcDNA（pSVB.Yam）μgの0.35μgのを追加p-アジド-L-フェニルアラニン（pcDNA.RS）する変異アミノアシルtRNA合成酵素cDNAの。 15分間室温でインキュベートする。また、コントロールとして機能するように重量のGPCRのcDNA（アンバー終止コドンを含まない）を使用して同様のトランスフェクションを行う。 17μlのリポフェクタミンを含むDMEM750μlのこの混合物を追加します。室温で15分間平衡化した後、持参4ミリリットルの総量。
   2. 10-10cmプレート上の吸引メディアは、細胞へのトランスフェクション混合物を適用し、5％CO ₂雰囲気下で37℃に戻る。 4-6時間後、20％FBSおよび1mM AZFを含有する4ミリリットルDMEMで細胞を補充する。
3. 次の日、DMEM中10％FBSおよび0.5 mMのAZFを含有する増殖培地を交換してください。
4. 細胞を回収し、48時間トランスフェクション後、発現を解析するか、次のセクションで説明する光架橋または標識手続きに進みます。
   1. 増殖培地中のUAAの存在下でのGPCRアンバー変異体の発現を確認。我々は、ウェスタン免疫ブロット検出によってこれを行う。溶解液を4℃で1時間、20mMのトリス-HCl、pH7.5中の1％で細胞ペレット（w / v）のドデシル-β-D-マルトシド（DDM）、100mMのNaCl 16,000×gで溶解液を遠心分離し、SDS-PAGEにより、還元条件下で、上清を解決します。 PVDF膜に移し、目を用いて、完全長受容体の発現を検出するためのイムノブロット分析を行っ受容体のC末端に設計されるエピトープを認識するモノクローナル抗体E 1D4（国立細胞培養センター^）。31

2。ターゲット光架橋を使用して、リガンド結合部位のマッピング

1. 48時間のトランスフェクション後、細胞から吸引メディアと4ミリリットル1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と交換してください。 15分間37℃に戻ります。
2. 1X PBSで細胞を再懸濁し、ファルコンチューブに移す。細胞をペレットと上清を吸引する2分間1,500 rpmで遠心分離する。
3. 20mMのHEPES、pH7.5で、0.2％BSAおよび受容体 - リガンド複合体形成を確実にするために時間および温度の必要な長さの結合飽和濃度でトリチウム化したリガンドを含有する1×ハンクス緩衝塩類溶液中に細胞ペレットを再懸濁する。
4. 4℃で15分間（ 例えば、UVランプを使用して）365nmでAZFの光活性化のために、24ウェルまたは96ウェルプレートに細胞懸濁液を転送するMaintainは氷上でプレートを試料加熱及び細胞溶解を回避する。
5. エッペンドルフチュー​​ブに細胞を移し、遠心分離機、細胞をペレット上清を除去し、分析に進みます。ペレットは、将来の使用のために-20℃で保存することができる。
6. 1％（w / v）のDDM、20mMのトリス-HCl、pH7.5およびプロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 4℃で1時間のインキュベーション後、16,000×gで10分間、細胞溶解物を遠心分離し、上清を新しいチューブに移す。
7. 1D4モノクローナル抗体 - セファロース2B樹脂は上清に追加して設計され、C末端1D4のmAbエピトープを使用してGPCRを免疫精製するために4℃で一晩インキュベートする。翌日溶解緩衝液でビーズを数回洗浄する。振とうしながら1時間、37℃で1％SDSで溶出サンプル。
8. シンチレーション液を含有する15ミリリットルバイアルに溶出液の一部を移し、目にトリチウム化したリガンドの特異的結合の量を定量し、βシンチレーションカウンターで数える電子受容体である。
9. 標準的なゲル電気泳動により、残りの1D4モノクローナル抗体精製された溶離液を解決します。我々は、4〜12％SDS-PAGEゲルおよびイムノ用PVDF膜にして、半乾燥転送を使用しています。また、分子量を視覚的に近似を導くために、標準的なタンパク質ラダーとレーンが含まれています。
   1. 0.05％のTween-20を含むTBS緩衝液中の5％ミルクでPVDF膜をブロックする。 HRP結合抗マウスIgG二次抗体1D4 mAbと完全長受容体の発現を確認するために、膜をプローブ。
   2. 増強化学発光（ECL）試薬で処理し、バンドを可視化し、オートラジオグラフィーフィルムに膜を公開します。
10. 特定の分子量マーカーで切断し、その後、各サンプルレーンを分離するためにカミソリの刃を有する膜をカットします。シンチレーション液を含むバイアルに膜セグメントを転送します。ベータシンチレーションカウンターでカウントすることにより、各膜セグメント内のトリチウムの量を定量化する。
11. 正を識別GPCRとリガンドとの和に等しい見かけの分子量におけるトリチウムの検出を光架橋する。

3。エピトープタギングおよび細胞表面酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を標的化

1. 24時間のトランスフェクション後、1ミリリットル×PBSで細胞を洗浄し、3分間0.25％トリプシン1mlでトリプシン処理。 10％FBSおよび0.5 mMのAZFを含む9ミリリットルDMEMで補う。細胞を再懸濁し、細胞密度をカウントします。私たちは、標準的な血球計数器を使用しています。
2. ウェル当たりのポリ-D-リジン溶液は0.01mg / 100mlで高結合性、透明底96ウェルプレートの事前処置する。室温で30分間インキュベートし、1×PBSおよび空気乾燥で繰り返し洗浄する。
3. プレートトランスフェクトされた細胞を200μlの^4×10 6の密度で、 - 8×10 ⁴細胞/ウェルで96ウェルプレートに、5％CO ₂雰囲気中で37℃に戻る。
4. 翌日標識用細胞を調製。静かに100μl/ウェル1X PBS Tで3回洗浄OどんなAZF含む増殖培地を除去します。細胞は、例えば、のCa ^{2 +}およびMg ^{2 +を}含有するPBSを用いて、付着したままであることを確認してください。
5. PBS中で5月20日mMのに維持原液から1X HBSS / PBSに50〜200μmのFLAG-トリアリール標識試薬を準備します。 （各アンバー変異体のための三連で）を各ウェルに60ミリリットルを適用し、4時間まで30分、37℃に戻ります。 1×HBSS / PBS中のラベル処理をせずに井戸のセットを維持する。またAZF-GPCR変異型と比較する重量GPCRコントロールが含まれています。
6. よくブロッキングバッファーを100μl/で細胞を3回洗浄、BB（1×PBS、0.5％BSA）は、完全に未反応のラベルを削除します。
7. 細胞に100μl/ウェルの（1×PBS中16％ストックから調製した）を4％パラホルムアルデヒドを適用します。室温で20分間インキュベートする。 BBで3回洗浄する。
8. 標識受容体および受容体の発現を検出するために、標準的な細胞表面ELISAプロトコルを実行する。二AN続く氷上1.5時間一次抗体とインキュベートします1時間室温でtibodyインキュベーション。
   1. FLAG-トリアリール標識試薬のFLAGペプチドエピトープを検出するために、抗FLAG M2抗体（BBで行われた抗体の例 1:2,000希釈）を100μlを追加します。また、ネガティブコントロールとして非ラベル処理したウェルを探る。抗CCR5 2D7は、（我々は1:500希釈を使用）抗体重量やAZF-GPCR細胞表面発現を決定するために、井戸の別々のセットに追加します。
   2. BBで細胞を3回洗浄し、HRP結合抗マウスIgG二次抗体（1:2,000希釈）100μlでインキュベートする。
   3. 慎重に、BBで細胞を5回洗浄する。 50μlの検出緩衝液を追加しアンプレックスレッド、20mMのH ₂ O _{2、1×PBS（1:10:90}比）、室温で15分間インキュベートする。 _EMは 590 _=λEX = 530で蛍光マルチウェルプレートリーダー上のスペクトルデータを収集し、λ。

4。 GPCRのバイオ直交蛍光標識

1. 溶解するwtまたはAZF-ロドプシンが1％を含有する1ミリリットルの可溶化緩衝液中で変異（w / v）のDM、50mMのHEPESまたはTris-塩酸、pH 6.8、100mMのNaCl、1mMのCaCl ₂およびプロテアーゼ阻害剤の1を発現する10 ⁷採取した細胞4℃での時間10分間15,000×gで細胞溶解物を遠心分離し、上清画分を収集します。
2. 設計C末端1D4エピトープを使用して、受容体を捕捉するために、100μlの1D4-モノクローナル抗体セファロース2B樹脂を追加します。 4℃で12時間インキュベートする0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.3中の0.1％（w / v）のDDMで樹脂を3回洗浄する。
3. 免疫アフィニティーマトリックス（1D4-モノクローナル抗体セファロース2B）上に固定化された受容体を標識する0.3〜0.5ミリリットルの全容量0.1 mMのフルオレセイン - ホスフィンを追加します。室温で12時間インキュベートする。上清を遠心分離して除去します。未反応の標識を除去し、樹脂を洗浄します。
4. 0.1％を含む100mlの溶出緩衝液（w / v）のDDMおよび0.33 mg / mlのノナペプチド（1D4エピトープに対するC9ペプチド）で標識された受容体を溶出させる2 mMリン酸緩衝液中で、1時間氷上でインキュベートすることによりpHを6.0。
5. 還元条件下でSDS-PAGEによって標識されたサンプルを解決する。 PBSで簡単にゲルを洗った後、ゲル内蛍光によってAZF-GPCRのラベル付けを視覚化。例えば、フルオレセインで修飾体を検出するために、488 nmの波長のレーザー共焦点蛍光スキャナを使用。

結果

私たちは、部位特異的抑制技術コドン琥珀を使用して、GPCRに分子プローブを導入する非天然アミノ酸の変異導入方法論を採用。 図1の方式では、方法論の主要なステップとのGPCRに、汎用性のUAA、p-アジド-L-フェニルアラニン（AZF）を組み込む様々なアプリケーションの概要を説明します。哺乳動物細胞におけるAZF-GPCRの発現は、リガンドをターゲットに光架橋を可能にし、...

ディスカッション

我々のGPCRに、ここでは反応性プローブ​​、AZFの部位特異的組み込みのための強固な方法論を記述し、GPCRの構造やダイナミクスを研究するために、このツールの便利な3つのアプリケーションを示しています。部位特異的に本手法UAAsを組み込むには、化学的に^32、33をラベルまたは単一アクセス可能なシステイン変異体に光架橋^34を取り付けるに基づく代替戦略の基本的な問?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials