Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Resumo

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Resumo

Para facilitar os estudos estruturais e dinâmicas de G do receptor acoplado à proteína (GPCR) de sinalização complexos, novas abordagens são necessários para introduzir sondas informativas ou etiquetas em receptores expressos que não perturbam a função do receptor. Usamos âmbar tecnologia de supressão de codões para codificar geneticamente o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina (AZF) em várias posições orientadas nos GPCRs heterologamente expressos em células de mamíferos. A versatilidade do grupo azido é aqui ilustrado em diferentes aplicações para estudar GPCRs no seu ambiente celular nativo, ou sob condições de detergentes solubilizadas. Em primeiro lugar, nós demonstramos uma tecnologia de foto-reticulação com base nas células-alvo para identificar os resíduos no bolso de ligação ao ligando de GPCR em que um marcado com trítio pequena molécula ligante é reticulado com um ácido azido-amino geneticamente codificado. Nós, então, demonstrar a modificação específica do site de GPCRs pelo bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligadura reaçãoção que tem como alvo o grupo azido utilização de derivados de fosfina. Discute-se uma estratégia geral para o alvo de marcação de péptidos com epitopo das proteínas de membrana expressos em cultura e a sua detecção usando uma abordagem baseada em ELISA de célula inteira. Finalmente, mostra-se que AZF-GPCRs pode ser marcado selectivamente com sondas fluorescentes. As metodologias são discutidos em geral, na medida em que podem, em princípio, ser aplicada a qualquer posição do aminoácido em qualquer expressa GPCR para interrogar os complexos de sinalização activas.

Introdução

Heptahelical receptores acoplados à proteína (GPCRs) compreendem uma superfamília de proteínas de membrana altamente dinâmicos que medeiam sinais extracelulares importantes e diversas. No paradigma clássico, a activação do receptor é acoplada com alterações conformacionais induzidas pelo ligando. ^{1, 2} avanços recentes em biologia estrutural dos GPCRs têm fornecido uma visão significativa sobre os mecanismos moleculares da sinalização transmembrana. ^3-5 No entanto, para compreender com maior precisão o químico mecanismo funcional e dinâmica estrutural de sinalização GPCR, um kit de ferramentas de abordagens é necessária para incorporar sondas moleculares e químicas informativos para interrogar complexos de sinalização ativos.

Para este fim, nós adaptamos um método para o site especificamente introduzir não ou minimamente sondas perturbadores em receptores expressos com base no aminoácido não natural mutagênese (SAU), utilizando tecnologia de supressão de âmbar códon anteriormente iniciada por Schultz e coworkers. ⁶ Nós optimizado a metodologia mutagénese UAA para alcançar uma expressão de alto rendimento e um sistema de mutagénese de proteínas, tais como os GPCRs, que são difíceis de expressar em células de mamífero do que outros sistemas mais heterólogos. Usando um supressor de engenharia ortogonal tRNA e evoluiu aminoacil-tRNA sintetase par para uma SAU específica, local especificamente introduzido UAAs em GPCRs alvo expressas. A incorporação bem sucedida de UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (AcF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), e p-azido-L-fenilalanina (AZF) foi demonstrada no nosso modelo GPCRs - rodopsina e humano receptor de quimiocina CC, CCR5. ^{7, 8}

Em princípio, um UAA podem ser geneticamente codificado em qualquer posição dentro da seqüência de proteínas e esta propriedade é uma ferramenta bioquímica inestimável, pois permite que um único códon de varredura de um GPCR alvo. Nós nos focamos especificamente sobre a versatilidade da UAA, AZF, que tem um azi reativafazer metade. Além de servir como um (IR) da sonda original de infravermelhos, ^{8, 9} AZF pode também servir como um agente de ligação cruzada por fotoactivável reagir com aminas primárias ou hidrogénios alifáticos vizinhos. Além disso, o grupo azido biologicamente inertes podem participar como pega química seletiva em reações de rotulagem bioorthogonal. Aqui apresenta-se exemplos que ilustram as aplicações úteis de incorporação específica do local de AZF em GPCRs, tais como o fotocruzamento alvo para interceptar um complexo receptor-ligando, e a modificação dos GPCRs por marcação de epitopo bioorthogonal e estratégias de marcação fluorescente.

Fotoactiváveis ​​reagentes foram utilizados para estudar sistemas biológicos desde os anos 1960. ¹⁰ Neste período, uma abundância de experiências de reticulação ligando-receptor foram relatados para estudar os complexos de GPCR, a maioria dos quais envolve a utilização de ligantes de fotoafinidade ^{11, 12} No entanto, estes. aplicações são tecnicamente limitados, uma vez que require a síntese de ligandos que possuem um grupo de reticulação ^13-15. Além disso, com a porção de agente de ligação cruzada no ligando, isto é difícil de identificar a localização da ligação transversal na GPCR. Site-especificamente a introdução de grupos de fotorreticulação como UAAs em proteínas utilizando o codão âmbar tecnologia de supressão é um avanço valioso ^{16, 17.} Desenvolvemos uma técnica de foto-reticulação para identificar a interface de ligação a um receptor que está envolvida na formação de um complexo receptor-ligando em vivo através da introdução de grupos de células em fotolábeis GPCRs. ^{18, 19} Aqui, descrevemos o protocolo experimental e método de análise de dados para aplicar esta tecnologia fotorreticulação alvo para identificar o local de ligação de um ligando de molécula pequena, maraviroc tritiada, em CCR5. Este método aproveita a quantificação exacta do identificador radioactivo no ligando, para além de manter a estrutura química nativa do ligando.

Técnicas baseadas em fluorescência apoiar a compreensão precisa da base estrutural da activação do receptor por sondando directamente o estado conformacional do receptor. ^{20, 21} No entanto, as técnicas que possuem a flexibilidade de introduzir marcadores fluorescentes em GPCRs local especificamente são limitados. Estamos interessados ​​em empregar estratégias de modificação química bioorthogonal para facilitar a detecção de moléculas individuais (SMD) de GPCR complexos de sinalização. ²² O grupo azido podem participar químicas bioorthogonal como Staudinger-Bertozzi ^{ligadura, 23, 24} azida-promovido-deformação sem cobre cicloadição alcino (SpAAC) ²⁵ e azida-alcino cicloadição catalisada por cobre (CuAAC). ²⁶ Nós nos focamos na reação ligadura Staudinger-Bertozzi, que envolve a reação específica entre uma azida e uma fosfina. Nós demonstramos a utilização de dois derivados diferentes de fosfina, conjugados com um péptido epitopo (péptido FLAG) ou uma etiqueta fluorescente(F luoresceína) para conseguir a modificação específica do local de GPCRs.

Nós já otimizada as condições para a rotulagem específica do site da rodopsina AZF variantes usando a estrutura de cristal de raio-X e simulações dinâmicas para escolher os locais alvo que são expostos solvente. ^{27, 28} Também ilustrou a viabilidade de alcançar rotulagem sem fundo por Staudinger- bertozzi ligadura. ²⁹ Demonstramos aqui o procedimento geral empregue para alcançar marcação fluorescente de um receptor de detergente solubilizado que é imobilizado sobre uma matriz de imunoafinidade e posteriormente visualizados por fluorescência em gel. Além disso, nós demonstramos uma extensão útil sobre esta estratégia de rotulagem para identificar posições passíveis de rotulagem em um receptor de estrutura desconhecida, CCR5. Esta é levada a cabo usando uma estratégia de marcação péptido epitopo específico, que se baseia na modificação bioorthogonal de AZF-GPCR variantes em um formato semi-alto rendimento com base em células. ³⁰ Estemétodo explora as propriedades de detecção multi-passo de um ELISA da superfície celular para monitorar eventos de rotulagem.

As metodologias que discutimos aqui são gerais e, em princípio, pode ser aplicado a qualquer GPCR incorporado com AZF usando o âmbar códon tecnologia de supressão. Nos protocolos apresentados aqui pormenorizadamente as etapas envolvidas na expressão das células de mamíferos de receptores incorporados com UAAs como AZF utilizando o método de mutagénese de aminoácido não natural e seus pedidos subsequentes para facilitar os estudos estruturais e dinâmicas de GPCRs.

Protocolo

1. Site-specific Constituição genética de Unnatural Aminoácidos em GPCRs

1. Manter células HEK293T em DMEM (4,5 g / L de glicose, glutamina 2 mM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C numa atmosfera de _{CO2 a} 5%.
2. Transfectar as células cultivadas a 60-80% de confluência numa placa de 10 cm usando o reagente Lipofectamine Plus.
   1. Para 750 mL de DMEM, adicionar 10 ul de reagente Bonés, 3,5 ug de cDNA de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contendo o codão de terminação âmbar, numa posição desejada, 3,5 ug de ARNt supressor de cDNA (pSVB.Yam) e 0,35 ug de mutante cDNA ARNt sintetase amino-acilo para o p-azido-L-fenilalanina (pcDNA.RS). Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Também realizar uma transfecção semelhante utilizando o peso de GPCR de cDNA (que não contém um codão de terminação âmbar) para servir como um controlo. Adicionar esta mistura de 750 ul de DMEM com 17 ul de Lipofectamina. Depois de equilibrar 15 min à temperatura ambiente, levar avolume total de 4 ml.
   2. Aspirar media em 10 cm de placa, aplica mistura de transfecção às células, e regresso a 37 ° C em 5% de _CO2. Após 4-6 hr, complementar células com 4 ml de DMEM contendo 20% de FBS e AZF 1 mM.
3. No dia seguinte, substituir o meio de crescimento por DMEM contendo 10% de FBS e AZF 0,5 mM.
4. Células colheita de 48 horas após a transfecção, para analisar a expressão ou prosseguir com os procedimentos fotoreticulação ou rotulagem descritos nas seções seguintes.
   1. Confirmar a expressão do mutante de âmbar de GPCR, na presença de SAU nos meios de crescimento. Fazemos isso através da detecção immunoblot ocidental. Lise do sedimento celular em 1% (w / v) de dodecil-β-D-maltósido (DDM) em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM durante 1 hora a 4 ° C. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g e resolver o sobrenadante em condições redutoras, por SDS-PAGE. Transfira para uma membrana de PVDF e realizar análise immunoblot para detectar a expressão do receptor de corpo inteiro usando ªe 1D4 mAb (Cell National Culture Center), que reconhece um epitopo de engenharia na extremidade C-terminal do receptor ^31.

2. Traçando um local de ligação do ligando Usando alvejado fotoreticulação

1. 48 horas após a transfecção, a mídia aspirado a partir de células e substituir com 4 ml 1x tampão fosfato (PBS). E volta a 37 ° C durante 15 min.
2. Ressuspender as células com PBS 1x e transferir para um tubo Falcon. Centrifugar a 1500 rpm durante 2 min para sedimentar as células e aspiração do sobrenadante.
3. Ressuspender o sedimento celular em Solução Salina Tamponada de Hank 1x contendo 20 mM de HEPES, pH 7,5, BSA a 0,2% e do ligando tritiado a concentração de saturação de ligação para o comprimento necessário de tempo e temperatura, para assegurar a formação do complexo receptor-ligando.
4. Transferência da suspensão de células para uma de 24 poços ou 96 poços por placa de fotoactivação da AZF a 365 nm (por exemplo, utilizar uma lâmpada de UV-A) durante 15 min a 4 ° C. Manutenn a placa em gelo para evitar o aquecimento da amostra e lise celular.
5. Transferência das células para um tubo de Eppendorf, centrífuga para sedimentar as células, remove-se o sobrenadante e proceder à análise. Os peletes podem ser armazenadas a -20 ° C para uso futuro.
6. Ressuspender as pelotas de células em tampão de lise contendo 1% (w / v) de DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 e os inibidores da protease. Após a incubação de 1 hora a 4 ° C, centrifugar o lisado celular durante 10 min a 16.000 x g, e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
7. Adicionar resina 2B mAb 1D4-sefarose para o sobrenadante e incubar durante a noite a 4 ° C para o GPCR immunopurify utilizando o terminal C de mAb 1D4 epitopo engenharia. No dia seguinte, lavar as esferas várias vezes com tampão de lise. Amostras eluir com 1% de SDS a 37 ° C durante 1 hora com agitação.
8. Transfira uma porção do eluente a um frasco contendo 15 ml de fluido de cintilação e contar num contador de cintilação beta para quantificar a quantidade de ligação específica do ligando titulado para poe do receptor.
9. Resolver o restante 1D4 mAb eluente purificado por eletroforese em gel padrão. Usamos um gel de 4-12% SDS-PAGE e depois transferência semi-seca para uma membrana de PVDF para imunoblotting. Nós também incluímos uma pista com escada proteína padrão para orientar aproximação visual de peso molecular.
   1. Bloquear a membrana PVDF com leite a 5% em tampão TBS contendo 0,05% de Tween-20. Sondar a membrana para confirmar a expressão do receptor de comprimento completo com o mAb 1D4, seguido por anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com HRP.
   2. Tratou-se com reagente de quimioluminescência aumentada (ECL) e expor a membrana a película de auto-radiografia para visualizar as bandas.
10. Cortar a membrana com uma lâmina de barbear para separar cada pista de amostra, seguindo-se o corte em marcadores com pesos moleculares específicos. Transferir os segmentos de membrana para frascos contendo líquido de cintilação. Quantificar a quantidade de trítio em cada segmento de membrana por contagem num contador de beta-cintilação.
11. Identificar o positivophotocrosslink com a detecção de trítio na massa molecular aparente igual à soma do que do GPCR e o ligando.

3. Alvejado Epitope Tagging e Superfície Celular ligada ao ensaio imunoenzimático (ELISA)

1. 24 horas pós-transfecção, lavar as células com 1 ml de PBS 1x e trypsinize com 1 ml de tripsina a 0,25% durante 3 min. Suplemento com 9 ml de DMEM contendo 10% de FBS e AZF 0,5 mM. Ressuspender as células e contar a densidade celular. Usamos um hemocitômetro padrão.
2. Pré-tratar uma chapa de fundo claro, de ligação de alta, de 96 poços com 100 ml de 0,01 mg / ml de poli-D-lisina por poço. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, lavar várias vezes com PBS 1x e ar seco.
3. Placa de 200 ul das células transfectadas a uma densidade de 6 x ^4-8 outubro ⁴ x 10 células / poço para a placa de 96 poços e regresso a 37 ° C em 5% de _CO2.
4. No dia seguinte, preparar células para a rotulagem. Lavar suavemente três vezes com 100 ul / poço de PBS 1x to remover qualquer AZF contendo meio de cultura. Assegurar que as células permanecem aderidas, por exemplo, através da utilização de PBS contendo Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
5. Prepare 50-200 mM FLAG-triarilfosfína reagente rotulagem em 1x HBSS / PBS a partir de um estoque mantido em 5-20 mM em PBS. Aplicar 60 ml a cada poço (em triplicado para cada mutante âmbar) e regresso a 37 ° C durante 30 minutos a 4 horas. Manter um conjunto de poços sem tratamento rótulo em 1x HBSS / PBS. Também incluem um controle de peso GPCR para comparar com variantes AZF-GPCR.
6. Lavar as células 3 vezes com 100 ul / poço de tampão de bloqueio, BB (1x PBS, BSA a 0,5%), para remover marcador que não reagiu completamente.
7. Aplicar 100 l / poço de paraformaldeído a 4% (preparada a partir de um estoque de 16% em PBS 1x) para as células. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Lavar três vezes com BB.
8. Realizar protocolo ELISA superfície celular padrão para detectar receptor marcado e expressão do receptor. Incubar com anticorpo primário durante 1,5 horas em gelo, seguido de um derivadotibody incubação à temperatura ambiente durante 1 hora.
   1. Adicionar 100 ul de anticorpo anti-FLAG M2 (por exemplo, diluição de 1:2.000 de anticorpos feitas no BB) para detectar o péptido FLAG epitopo do reagente de marcação FLAG-triarilfosfina. Sonda também não rótulo poços tratados como controle negativo. Adicionar anti-CCR5 2D7 (usamos uma diluição de 1:500) do anticorpo a um conjunto separado de poços para determinar em peso ou AZF-GPCR expressão na superfície celular.
   2. Lave as células três vezes com BB, e incubar com 100 uL de anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com HRP (1:2000 diluição).
   3. Lavar cuidadosamente as células cinco vezes com o BB. Adicionar 50 ul de tampão de detecção: Amplex Red, 20 mM H ₂ O _2, 1x PBS (proporção 1:10:90) e incubar 15 min a temperatura ambiente. Coletar dados espectrais em um multi-leitor de placas bem fluorescência em λ _ex = 530 e λ _em = 590.

4. Bioorthogonal Labeling fluorescentes de um GPCR

1. Lyse10 ⁷ células colhidas que expressam em peso ou AZF-rodopsina variantes em 1 ml de tampão de solubilização, contendo 1% (w / v), MS, HEPES 50 mM ou Tris-HCl, pH 6,8, NaCl 100 mM, _CaCl2 1 mM e inibidores de protease para uma hr a 4 ° C. Centrifuga-se o lisado celular a 15000 x g durante 10 minutos e recolher a fracção sobrenadante.
2. Adicionar 100 uL de mAb 1D4-resina de Sepharose 2B para capturar o receptor utilizando o terminal C 1D4 epitopo engenharia. Incubar durante 12 horas a 4 ° C. Lava-se a resina três vezes com 0,1% (w / v) DDM em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,3.
3. Adicionar 0,1 mM de fluoresceína-fosfina em um volume total de 0,3-0,5 mL de rotular receptor imobilizado na matriz de imunoafinidade (1D4-mAb Sepharose 2B). Incubar durante 12 horas à temperatura ambiente. Centrífuga e remover o sobrenadante. Lava-se a resina para remover marcador que não reagiu.
4. Eluir o receptor marcado com 100 ml de tampão de eluição contendo 0,1% (w / v) de DDM e 0,33 mg / ml de nonapéptido (C9 péptido contra o epitopo de 1D4)em tampão de fosfato 2 mM, pH 6,0, por incubação em gelo durante 1 hr.
5. Resolve amostras marcadas por SDS-PAGE sob condições redutoras. Lavar géis brevemente em PBS e, em seguida, visualizar rotulagem de AZF-GPCR por fluorescência em gel. Por exemplo, uso de um scanner de fluorescência confocal a laser com um comprimento de onda de 488 nm para a detecção do receptor modificado com fluoresceína.

Resultados

Utilizamos a metodologia de mutagênese aminoácido não natural para o site especificamente introduzir sondas moleculares em um GPCR usando o âmbar códon tecnologia de supressão. O esquema da Figura 1 esboça os passos salientes da metodologia e os vários pedidos de incorporar o versátil UAA, p-azido-L-fenilalanina (AZF), para GPCRs. Expressão da AZF-GPCRs em células de mamíferos permite fotoreticulação alvejado a ligantes, e marcação peptídeo epítopo ou modificações fluorescen...

Discussão

Descrevemos aqui uma metodologia robusta para incorporação site-specific de uma sonda reativa, AZF, em GPCRs e demonstrar três aplicações úteis deste instrumento para estudar a estrutura ea dinâmica de GPCRs. Nosso método para o site especificamente incorporar UAAs contorna um problema fundamental com uma estratégia alternativa baseada na rotulagem quimicamente ^{32, 33} ou anexar photocrosslinkers ³⁴ para um único mutante cisteína acessível. Embora, químicos que têm como alvo grupos tio...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials