基因编码的分子探针来研究G蛋白偶联受体

摘要

在GPCR的各种目标的位置，我们基因编码的非天然氨基酸，对 - 叠氮基-L-苯丙氨酸，并显示在叠氮基团中的不同的应用程序的通用性。这些包括有针对性的光交联技术，以确定在一个G蛋白偶联受体的配体结合口袋的残基，和位点特异性生物正交的GPCR与肽表位标签或荧光探针的修饰。

摘要

以促进G蛋白偶联受体（GPCR）信号复合物的结构和动力学研究，新的方法需要引入翔实的探针或标记入表达的受体不扰乱受体的功能。我们使用琥珀密码子抑制技术，基因编码的非天然氨基酸， 对 -叠氮基-L-苯丙氨酸（AZF）在异源表达在哺乳动物细胞中的GPCR各种目标的位置。叠氮基的通用性是这里示出在不同的应用程序来研究G蛋白偶联受体在其天然细胞环境或洗涤剂溶解的条件下进行。首先，我们展示了基于细胞的靶向光交联技术，以确定在G蛋白偶联受体，其中一个氚标记的小分子配体交联到一种基因编码的叠氮基的氨基酸的配体结合口袋的残基。然后，我们通过生物正交的Staudinger-Bertozzi教授结扎反应表明G蛋白偶联受体的位点特异性修饰化用膦衍生物为目标的叠氮基。我们将讨论用于使用全细胞系的ELISA方法在培养及其检测表达的膜蛋白的靶向肽的表位标记的一般策略。最后，我们证明了AZF-G蛋白偶联受体可以选择性标记的荧光探针。讨论的方法是通用的，因为它们可以在原则上被应用到任何的任何氨基酸位置表示的GPCR来询问活性信号传导复合物。

引言

七螺旋G蛋白偶联受体（GPCR）包括高度动态的膜蛋白介导的重要和多样的细胞外信号的超家族。在古典范式，受体激活耦接配体诱导的构象变化^。1，在G蛋白偶联受体的结构生物学²最近的进步已经提供的跨膜信号转导的分子机制显著洞察力^。3-5然而，为了理解具有更大的化学精度的作用机理和G蛋白偶联受体信号传导的结构动力学，办法的工具包，需要把信息分子和化学探针审问积极信号复合体。

为此，我们适应的方法来位点特异性地引入基于非天然氨基酸（UAA）的诱变使用琥珀密码子之前由舒尔茨和c开创抑制技术非或最低限度地扰动探测到表达的受体oworkers ⁶我们优化了UAA诱变的方法来实现对蛋白质，如G蛋白偶联受体，它们是难以表达，在大多数的异源系统比哺乳动物细胞等的高产量表达和诱变系统。使用正交设计的抑制性tRNA和进化氨酰-tRNA合成酶对用于特定UAA，我们位点特异性地引入UAAs中表达靶GPCR的。 UAAs的成功的掺入， 对 -乙酰基-L-苯丙氨酸（ACF）， 对 -苯甲酰基-L-苯丙氨酸（BZF），和p-叠氮基-L-苯丙氨酸（AZF）已被证明在我们的模型中的GPCR -视紫红质和人类CC趋化因子受体，CCR5 ^7,8

原则上，UAA可以基因编码的蛋白质序列中的任何位置，这个属性是一个非常宝贵的生化工具，因为它使一个目标GPCR的单密码子扫描。我们特别关注这里的UAA，AZF，其中有一个反应阿紫的多功能性做的部分。除了 ​​作为一个独特的红外（IR）探测器^，8,9 AZF也可以作为一个可光活化交联剂通过与邻近的伯胺或脂族氢的反应。此外，生物惰性叠氮基可以参与作为生物正交标记反应选择性的化学处理。在这里，我们提出了举例说明位点特异性结合AZF的有用的应用程序转换为G蛋白偶联受体，例如有针对性的光交诱捕受体 - 配体复合物，并通过G蛋白偶联受体抗原生物正交标记和荧光标记的策略进行修改。

光活化试剂已被用于研究生物系统自1960年以来^，10在这期间，受体-配体的交联实验丰盈已报道研究G蛋白偶联受体复合物，其中大部分涉及利用光亲和配体^。11,12然而，这些应用技术上的限制，因为它们必需参数E的合成配体带有交联基团的^13-15再者，在配位体的交联基团，它是具有挑战性的，以确定在G蛋白偶联受体的交联点的位置。位点特异性地引入光交联基团如UAAs到使用琥珀密码子抑制技术的蛋白质是一种有价值的进步^。16,17我们开发了一种光致交联的技术，以确定对涉及的受体-配体复合物的形成是一个受体的结合界面通过引入光不稳定基团引入GPCR的活细胞^。18,19在这里，我们描述的实验方案和数据分析的方法，应用该目标光交联技术，以确定一个小分子配体的结合位点，氚标记马拉韦罗，对CCR5。该方法利用了对配体的放射性的手柄，除了保留配体的天然化学结构的精确定量。

基于荧光技术直接探测受体的构象状态支持受体激活的结构基础的精确理解^。20,21然而，拥有技术引进荧光标记成G蛋白偶联受体的灵活性，位点特异性是有限的。我们感兴趣的是使用生物正交化学修饰策略，以促进G蛋白偶联受体信号复合物的单分子检测^{（SMD），22}叠氮基可以参与生物正交化学物质，如施陶丁格-Bertozzi教授结扎^，23，24无铜应变推动叠氮炔环加成反应^{（SpAAC）25}和铜催化的叠氮-炔环加成反应^{（CuAAC）26}在这里，我们重点放在涉及叠氮化物和磷化氢之间的特异性反应的施陶丁格-Bertozzi教授连接反应。我们展示了使用两种不同的膦衍生物，缀合的肽表位（FLAG肽）或荧光标记的（荧光素），以实现GPCR的位点特异性修饰。

我们以前优化的视紫红质AZF变种利用X-射线晶体结构和动态模拟来选择是溶剂暴露目标站点的站点特定标记的条件^{。27，28，}我们也说明了实现无背景标签的可行性，施陶丁格- Bertozzi教授结扎²⁹我们在这里展示用于实现该被固定在免疫亲和基质，并随后通过在凝胶荧光可视化的洗涤剂增溶的受体荧光标记的一般方法。此外，我们证明这个标签战略，以确定适合于对未知结构，CCR5的受体标记位置的有用的扩展。这是通过使用一个依赖于的AZF-GPCR在基于细胞的半高通量形式的变体生物正交变型的靶向肽的表位标记的战略^。30这方法利用细胞表面的ELISA的多步骤的检测性能监视标记的事件。

我们在这里讨论的方法是通用的，原则上可以适用于使用琥珀密码子抑制技术与AZF注册成立的任何G蛋白偶联受体。在这里给出的细节，我们涉及使用非天然氨基酸的诱变方法和其后续的应用，以促进G蛋白偶联受体的结构和动力学研究UAAs如AZF结合受体的哺乳动物细胞表达的步骤的协议。

研究方案

1。非天然氨基酸位点特异性基因掺入到G蛋白偶联受体

1. 保持HEK293T细胞在DMEM（4.5 g / L的葡萄糖，2mM谷氨酰胺）中在37℃下在5％CO ₂气氛中添加了10％胎牛血清（FBS）。
2. 转染生长至在使用Lipofectamine试剂加有10厘米板60-80％汇合的细胞。
   1. 到750微升DMEM中，加入10微升加试剂，3.5微克的GPCR的cDNA（pMT4.的Rho或染pcDNA3.1。CCR5）含有琥珀终止密码子在所希望的位置上，3.5微克的抑制基因tRNA的cDNA（pSVB.Yam）和0.35微克的突变氨酰tRNA合成酶的cDNA 的 p-叠氮基-L-苯丙氨酸（pcDNA.RS）。在室温下孵育15分钟。也可以执行使用重量GPCR的cDNA（不含有琥珀终止密码子），以用作对照类似转染。将此混合物750μLDMEM与17μL脂质体。平衡15分钟后在室温下，使总体积〜4毫升。
   2. 吸出介质上10厘米的板，采用转染混合物到细胞中，并返回到37℃，在5％CO ₂气氛中。后4-6小时，补充细胞用4ml的DMEM含20％FBS和1 mM的AZF。
3. 第二天，用含有10％FBS和0.5mM AZF DMEM更换生长培养基。
4. 收获细胞48小时后转染，分析表达或继续在下面的章节中描述光交联或标签的程序。
   1. 确认在UAA的生长培养基中存在的G蛋白偶联受体琥珀突变体的表达。我们通过免疫印迹检测。溶胞物，以1％的细胞沉淀物（重量/体积）十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）在20mM的Tris-HCl，pH值7.5，100mM NaCl的1小时，在4℃下离心溶胞产物以16,000×g离心并解决下通过SDS-PAGE在还原条件上清液。转移到PVDF膜上，并进行免疫印迹分析使用日检测全长受体的表达Ë1D4单抗（国家细胞培养中心），其中确认在受体的C-末端的工程表位^。31

2。映射一个配体结合网站使用定向光交

1. 48小时转染后，从细胞中吸出介质，并替换为4毫升1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。返回到37°C下15分钟。
2. 重悬细胞用1×PBS和转移到Falcon管中。离心机在1500 rpm离心2分钟以沉淀细胞并吸出上清液。
3. 重悬含有20mM HEPES，pH为7.5，0.2％BSA和氚化的配体在饱和浓度的结合的时间和温度所需要的长度，以确保受体 - 配体复合物形成的细胞沉淀物在1×Hank氏缓冲盐溶液。
4. 细胞悬液转移到24孔或96孔板的AZF的光活化在365nm下在4℃下（ 例如，使用UV-A灯）15分钟Maintain中板置于冰上，以避免样品加热和细胞裂解。
5. 将细胞转移到Eppendorf管中，离心沉淀细胞，除去上清液并进行分析。这些颗粒可以被储存在-20℃下以供将来使用。
6. 重悬含1％（重量/体积）的DDM，20mM的Tris-盐酸，pH为7.5和蛋白酶抑制剂的细胞沉淀中的裂解缓冲液。经过1小时温育在4℃下，离心分离细胞裂解物对于以16,000×g离心10分钟，并且将上清液转移到新管中。
7. 添加1D4单克隆抗体 - 琼脂糖树脂2B向上清液孵育过夜，在4℃使用改造的C-末端1D4单克隆抗体的表位至immunopurify的G蛋白偶联受体。第二天，用裂解缓冲液洗珠数次。洗脱的样品用1％SDS在37℃下进行1小时振荡培养。
8. 洗脱剂的一部分转移到15ml小瓶中含闪烁液并计数在β闪烁计数器来量化氚标记的配体的特异性结合量以日Ë受体。
9. 解决剩余1D4单克隆抗体纯化洗脱液用标准凝胶电泳。我们使用了4-12％SDS-PAGE凝胶，然后半干转移到PVDF膜用于免疫印迹分析。我们还包括了与标准蛋白质阶梯车道引导分子量的视觉逼近。
   1. 用含有0.05％Tween-20的5％牛奶的TBS缓冲液阻断PVDF膜上。探测膜，以确认全长受体表达与1D4单克隆抗体随后HRP-偶联的抗小鼠IgG第二抗体。
   2. 治疗用增强的化学发光（ECL）试剂和暴露膜放射自显影胶片，以可视化的频带。
10. 切膜用刀片来分隔每个样品泳道，接着通过切割在特定分子量标记物。转移膜段含闪烁液小瓶。通过计数β-闪烁计数器定量在每个膜段氚的量。
11. 标识正面photocrosslink与氚的表观分子量等于该G蛋白偶联受体和配体的总和的检测。

3。有针对性的抗原表位标记和细胞表面酶联免疫吸附试验（ELISA）

1. 24小时转染后，洗涤细胞，用1ml的1×PBS和胰蛋白酶消化，用1ml 0.25％胰蛋白酶3分钟。补充用9ml的DMEM含有10％FBS和0.5mM AZF。重悬细胞并计数细胞密度。我们使用标准的血球。
2. 预治疗的高结合，透明底的96孔板中，用1​​00ml的0.01毫克/毫升，每孔聚-D-赖氨酸。温育30分钟，在室温下用1×PBS和风干反复洗涤。
3. 板200微升转染细胞在6×10 ⁴的密度- 8×10 ⁴个细胞/孔的96孔板中，并返回到37℃，在5％CO ₂气氛中。
4. 第二天准备的细胞进行标记。轻轻洗涤三次，用100μl/孔的1×PBS吨Ø删除任何AZF含有生长培养基。确保细胞仍附着，例如，通过使用PBS中含有的Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +。}
5. 从维持在5-20毫米PBS股票准备50-200微米旗 - 三芳基膦标记试剂在1x HBSS / PBS中。申请60毫升到每个孔中（一式三份对各琥珀突变体），并返回到37℃，进行30分钟至4小时。保持一个集水井没有在1x HBSS / PBS标签处理。还包括G蛋白偶联受体重量控制AZF-G蛋白偶联受体的变体来比较。
6. 用100μl/孔的封闭缓冲液洗涤细胞3次，BB（1×PBS，0.5％BSA），以完全除去未反应的标记。
7. 应用100μl/孔的4％多聚甲醛（从在1x PBS中的16％的库存制备）到细胞中。孵育20分钟，在室温下进行。带BB洗三次。
8. 执行标准细胞表面的ELISA方法检测标记的受体和受体的表达。孵育一抗1.5小时冰上其次是次要的tibody在室温下孵育1小时。
   1. 加入100μl抗FLAG M2抗体（ 如抗体1:2000稀释的BB制造）检测FLAG-三芳基膦标记试剂的FLAG肽抗原表位。还探讨非标签处理的孔作为阴性对照。添加抗CCR5 2D7（我们用1:500稀释）抗体，以一个单独的集水井，以确定重量或AZF-GPCR细胞表面表达。
   2. 带BB洗涤细胞3次，并孵育用100μlHRP-偶联的抗小鼠IgG第二抗体（1:2000稀释）的。
   3. 小心地用BB洗涤细胞五次。加入50μL检测缓冲液：红色的Amplex，20 mM的H _{2 O 2，1×PBS（1:10:90}的比例），并孵育15分钟，在室温下。收集的荧光多孔板读数器的光谱数据在_λEX = 530和λ _发射 = 590。

4。一个G蛋白偶联受体的生物正交荧光标记

1. 裂解10 ⁷收获的细胞中表达（重量）或AZF-视紫红质中含有1％1毫升溶解缓冲液变体（重量/体积）DM，50mM的HEPES或Tris-盐酸，pH为6.8，100 mM氯化钠，1mM的_氯化钙和蛋白酶抑制剂为1小时，在4℃下离心细胞裂解物在15,000×g离心10分钟，收集上清液部分。
2. 加入100μl1D4-单克隆抗体琼脂糖凝胶2B树脂使用设计的C末端1D4表位捕捉受体。孵育12小时，在4℃下用0.1％的洗涤树脂3次（重量/体积）的DDM在0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3。
3. 加入0.1毫米的荧光素膦0.3总体积 - 0.5毫升到标签受体固定在免疫亲和基质（1D4-单抗琼脂糖2B）。孵育12小时，在室温下进行。离心机除去上清液。洗涤树脂以除去未反应的标签。
4. 洗脱标记的受体与含0.1％（重量/体积）的DDM和0.33毫克/毫升的九肽（C9对1D4表位肽）100毫升洗脱缓冲液在2 mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0通过在冰上温育1小时。
5. 在还原条件下解决标记的样品进行SDS-PAGE。在短暂的PBS洗凝胶，然后通过凝胶内的荧光可视化AZF-G蛋白偶联受体的标签。例如，使用共聚焦荧光扫描仪具有488纳米波长的激光来检测受体修饰与荧光素。

结果

我们所用的非天然氨基酸的诱变方法，以位点特异性地引入分子探针进入的GPCR使用琥珀密码子抑制技术。 图1中的方案概述的显着的步骤的方法，并结合了多功能UAA， 对-叠氮基-L-苯丙氨酸（AZF），进GPCRs的各种应用。的AZF-G蛋白偶联受体在哺乳动物细胞中的表达可让有针对性的光交联配体，并通过生物 ​​正交标记化学针对性的肽表位标记或G蛋白偶联受体的荧光修改。...

讨论

在这里，我们描述了一个完善的方法进行位点特异性结合反应的探针，AZF，进入G蛋白偶联受体，并证明这个工具来研究G蛋白偶联受体的结构和动力学的三个有用的应用程序。我们的方法来位点特异性地并入UAAs规避与基于化学标记^32,33或附加光交联剂³⁴到单个可访问的半胱氨酸突变体的替代策略的一个基本问题。虽然，针对半胱氨酸硫醇基团的化学已被用于附加的荧光探针，这种?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials