בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

Summary

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

Abstract

כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קולטן מצמידים חלבון G (GPCR) איתות מתחמים, גישות חדשות נדרשות להציג בדיקות או תוויות אינפורמטיבי לקולטניים ביטא שלא להפריע פונקצית קולטן. אנחנו השתמשנו בטכנולוגית דיכוי קודון ענבר גנטי לקודד חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין (azF) בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs הביעה heterologously בתאי יונקים. הרבגוניות של קבוצת azido מודגמת כאן ביישומים שונים כדי ללמוד GPCRs בסביבה התאית האם שלהם או בתנאי solubilized חומרי ניקוי. ראשית, אנו מדגימים מבוסס תאי טכנולוגית photocrosslinking ממוקד כדי לזהות את השאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR בי יגנד מולקולה הקטנה שכותרתו טריטיום הוא crosslinked לחומצת אמינו azido גנטי מקודדת. לאחר מכן, אנו מדגימים שינוי ספציפי לאתר של GPCRs ידי reac קשירת Staudinger-Bertozzi bioorthogonaltion כי מטרות קבוצת azido באמצעות נגזרי phosphine. אנחנו דנים באסטרטגיה כללית לתיוג פפטיד epitope הממוקד של החלבונים בממברנה באו לידי ביטוי בתרבות ובזיהוי שלה באמצעות גישת ELISA המבוססת על כל התא. לבסוף, אנו מראים כי azF-GPCRs יכולה להיות מתויגת באופן סלקטיבי עם בדיקות ניאון. מתודולוגיות שנדונו הן כלליות, בכך שהם יכולים באופן עקרוני להיות מיושמים על כל עמדת חומצת אמינו בכל ביטוי GPCR לחקור מתחמי איתות פעילים.

Introduction

קולטנים Heptahelical G-חלבון בשילוב (GPCRs) מהווים superfamily של חלבוני קרום דינמיים מאוד שלתווך אותות תאיים חשובים ומגוונים. בפרדיגמה הקלסית, הפעלת קולטן בשילוב עם שינויי קונפורמציה יגנד-Induced. ^{1, 2} פיתוחים אחרונים בתחום הביולוגיה מבנית של GPCRs סיפק תובנה משמעותית על המנגנונים המולקולריים של איתות הטרנסממברני. ^3-5 עם זאת, כדי להבין בדייקנות כימית גדולה יותר מנגנון תפקודי ודינמיקה מבנית של איתות GPCR, ערכת כלים של גישות נדרש לשלב בדיקות מולקולריות וכימיות אינפורמטיבי לחקור מתחמי איתות פעילים.

לשם כך, מתאמנים שיטה לאתר במיוחד להציג את אי - או מינימאלי בדיקות מביכות לקולטניים ביטא מבוססות על חומצת אמינו לא טבעית mutagenesis (UAA) באמצעות ענבר קודון טכנולוגית דיכוי חלוץ העבר על ידי ג שולץ וoworkers. ⁶ מותאמים המתודולוגיה mutagenesis UAA כדי להשיג מערכת mutagenesis ביטוי תשואה גבוהה ולחלבונים כגון GPCRs, שקשה לבטא במערכות Heterologous ביותר אחרות מאשר בתאי יונקים. שימוש במדכאים מהונדסים מאונך tRNA והתפתח זוג synthetase aminoacyl-tRNA לUAA ספציפי, אנחנו אתר ספציפי הצגנו UAAs בGPCRs היעד לידי ביטוי. השילוב המוצלח של UAAs, p-אצטיל-L-פנילאלנין (ACF), p-בנזואיל-L-פנילאלנין (BzF), ו-p azido-L-פנילאלנין (azF) הוכח בGPCRs המודל שלנו - רודופסין ואנושי קולט chemokine CC, CCR5. ^{7, 8}

באופן עקרוני, UAA ניתן לקודד גנטי בכל מיקום בתוך רצף החלבון ונכס זה הוא כלי רב ערך ביוכימיים כפי שהיא מאפשרת סריקה חד קודון של GPCR יעד. אנו מתמקדים כאן דווקא ברבגוניות של UAA, azF, שבה יש עזי תגובתילעשות מחצית. בנוסף משמש כבדיקה ייחודית אינפרא אדום ^{(IR), 8, 9} azF יכול גם לשמש כמקשר צולב photoactivatable על ידי מגיב עם אמינים ראשוניים שכנים או מימני אליפטי. בנוסף, קבוצת azido אינרטי מבחינה ביולוגית יכולה להשתתף כידית כימית סלקטיבית בתגובות תיוג bioorthogonal. כאן אנו מציגים דוגמאות הממחישות את היישומים השימושיים התאגדות אתר ספציפי של azF לGPCRs, כגון photocrosslinking הממוקד למלכודת מורכבת קולטן ליגנד, ושינוי של GPCRs ידי תיוג epitope bioorthogonal ואסטרטגיות תיוג ניאון.

ריאגנטים photoactivatable שימשו ללמוד מערכות ביולוגיות מאז 1960s. ¹⁰ בתקופה זו, שפע של ניסויי crosslinking הקולטן ליגנד דווח ללמוד מתחמי GPCR, שרובם כללו שימוש בligands photoaffinity. ^{11, 12} עם זאת, אלה יישומים טכני מוגבלים, כפי שהם requirסינתזת דואר של ligands נושאת קבוצת crosslinking. ^13-15 יתר על כן, עם מחצית crosslinker ביגנד, זה מאתגר לזהות את מיקומו של Crosslink על GPCR. אתר ספציפי בהכנסת קבוצות photocrosslinking כUAAs לחלבונים באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי היא קידום יקר. ^{16, 17} פיתחנו טכניקת photocrosslinking לזהות את הממשק מחייב את קולטן זה מעורב בהיווצרות קומפלקס הקולטן ליגנד ב לחיות תאים על ידי החדרת קבוצות photolabile לGPCRs. ^{18, 19} כאן אנו מתארים את הפרוטוקול ושיטת ניתוח נתוני ניסוי ליישום טכנולוגית photocrosslinking ממוקד זה כדי לזהות את אתר הקישור של ליגנד מולקולה קטנה, maraviroc tritiated, על CCR5. שיטה זו מנצלת את הכימות המדויק של הידית רדיואקטיביים ביגנד, בנוסף לשמירה על המבנה כימי יליד יגנד.

טכניקות הקרינה מבוססת לתמוך בהבנה המדויקת של הבסיס המבני של הפעלת קולטן ישירות על ידי חיטוט מדינת קונפורמציה של הקולטן. ^{20, 21} עם זאת, הטכניקות בעל הגמישות להציג תוויות ניאון לGPCRs אתר ספציפיות הן מוגבלות. אנו מעוניינים בהפעלת אסטרטגיות שינוי הכימי bioorthogonal כדי להקל על זיהוי מולקולה בודדת (SMD) של קומפלקסי איתות GPCR. ²² קבוצת azido יכולה להשתתף בתהליכים כימיים bioorthogonal כגון קשירת ^{Staudinger-Bertozzi, 23, 24} אזיד-קידם מתח ללא נחושת חיי בן אשר alkyne (SpAAC) ²⁵ וחיי בן אשר, הייתה זרז נחושת אזיד-alkyne (CuAAC). ²⁶ אנו מתמקדים כאן בתגובת קשירת Staudinger-Bertozzi המערבת את התגובה הספציפית בין אזיד וphosphine. אנו מדגימים את השימוש בשני נגזרי phosphine שונים, מצומדת לאפיטופ פפטיד (פפטיד FLAG) או תווית ניאון(העמסה) כדי להשיג שינוי ספציפי לאתר של GPCRs.

אנו מותאמים בעבר התנאים לתיוג ספציפי לאתר של rhodopsin azF גרסאות באמצעות המבנה הגבישי רנטגן וסימולציות דינמיות לבחור אתרי יעד שהם ממס חשוף. ^{27, 28} אנחנו גם איירנו את ההיתכנות להשגת תיוג ללא רקע בStaudinger- קשירת Bertozzi. ²⁹ אנו מדגימים כאן הנוהל הכללי המועסק על מנת להשיג ניאון תיוג של קולט חומר ניקוי, solubilized כי הוא משותק על מטריצת immunoaffinity ולאחר מכן דמיינו ידי הקרינה בג'ל. בנוסף, אנו מדגימים הארכה שימושית על אסטרטגית תיוג זה כדי לזהות עמדות נוחות לתיוג על הקולטן של מבנה ידוע, CCR5. זו מתבצעת באמצעות אסטרטגית תיוג פפטיד epitope ממוקדת המסתמכת על שינוי bioorthogonal של azF-GPCR גרסאות בפורמט חצי תפוקה גבוהה מבוסס תאים. ³⁰ זהשיטה מנצלת את תכונות זיהוי רב שלבים של ELISA על פני קרום תא כדי לפקח על אירועי תיוג.

מתודולוגיות אנו דנים כאן הן כלליות ועקרוניים יכולות להיות מיושמות על כל GPCR משולב עם azF באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. בפרוטוקולים שהוצגו כאן פירוט אנו השלבים כרוכים בביטוי תאים היונקים של קולטנים משולבים עם UAAs כגון azF בשיטה טבעית חומצת אמינו mutagenesis והיישומים הבאים שלהם כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של GPCRs.

Protocol

1. התאגדות גנטית אתר ספציפי של חומצות אמינו לא טבעיים לGPCRs

1. שמור על תאי HEK293T בDMEM (4.5 גר '/ L של גלוקוז, 2 גלוטמין מ"מ) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO _2.
2. Transfect התאים מבוגרים כדי מפגש 60-80% בצלחת 10 ס"מ באמצעות מגיב Lipofectamine פלוס.
   1. ל750 DMEM μl, להוסיף 10 μl פלוס מגיב, 3.5 מיקרוגרם של GPCR cDNA (pMT4. Rho או pcDNA 3.1. CCR5) המכיל את קודון עצירת הענבר במיקום רצוי, 3.5 מיקרוגרם של מדכאי tRNA cDNA (pSVB.Yam) ו0.35 מיקרוגרם של cDNA מוטנטי אמין acyl tRNA synthetase עבור p-azido-L-פנילאלנין (pcDNA.RS). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. גם לבצע transfection דומה באמצעות WT GPCR cDNA (שאינם מכיל קודון עצירת ענבר) לשמש כביקורת. להוסיף את התערובת ל750 μl של DMEM עם 17 Lipofectamine μl. לאחר equilibrating 15 דקות בטמפרטורת חדר, להביא אתנפח הכולל עד 4 מיליליטר.
   2. תקשורת לשאוב על צלחת 10-סנטימטר, להחיל תערובת transfection לתאים, ולחזור ל37 ° C ב 5% CO ₂ אווירה. אחרי 4-6 שעות, להשלים את התאים עם 4 מיליליטר DMEM המכיל FBS 20% לבין 1 מ"מ azF.
3. למחרת, להחליף את תקשורת הצמיחה עם DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ"מ azF.
4. קציר תאים 48 שעות שלאחר transfection, לנתח ביטוי או להמשיך לנהלי photocrosslinking או תיוג המתואר בסעיפים הבאים.
   1. אשר ביטוי של המוטציה ענבר GPCR בנוכחות UAA בתקשורת הצמיחה. אנו עושים זאת על ידי זיהוי immunoblot המערבי. Lyse התא גלולה ב 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) ב20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 100 מ"מ NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate XG 16,000 ולפתור את supernatant תחת הפחתת תנאים ידי-SDS. העברה לקרום PVDF ולבצע את ניתוח immunoblot לזהות ביטוי הקולטן באורך מלא באמצעות הדואר 1D4 מב (Cell הלאומי מרכז תרבות), אשר מזהה אפיטופ מהונדס בC-הסופית של הקולטן. ^{ביום 31}

2. מיפוי אתר קישור ליגנד שימוש Photocrosslinking ממוקד

1. לאחר transfection 48 שעות, מדיה לשאוב מהתאים ולהחליף עם 4 מיליליטר 1x בופר פוספט (PBS). חזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
2. Resuspend התאים עם 1x PBS ולהעביר לצינור פלקון. צנטריפוגה ב 1,500 סל"ד במשך 2 דקות עד גלולה התאים ולשאוב supernatant.
3. Resuspend התא גלולה שבנאגרו תמיסת מלח של 1x האנק מכיל 20 HEPES מ"מ, pH 7.5, BSA 0.2% ויגנד tritiated בלהרוות ריכוז מחייב לאורך הנדרש של זמן וטמפרטורה על מנת להבטיח היווצרות מורכבת קולטן ליגנד.
4. מעביר את ההשעיה התא לצלחת 24 גם או 96 היטב לphotoactivation של azF ב365 ננומטר (למשל להשתמש UV-מנורה) ל15 דקות ב 4 ° C. Maintain את הצלחת על קרח, כדי למנוע חימום מדגם ותמוגה תא.
5. להעביר את תאי צינור Eppendorf, צנטריפוגות כדי גלולה התאים, להסיר את supernatant ולהמשיך לניתוח. ניתן לאחסן את כדורים ב-20 ° C לשימוש עתידי.
6. Resuspend את כדורי התא במאגר תמוגה המכילים 1% (w / v) DDM, 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5 ומעכבי פרוטאז. לאחר דגירה 1-HR ב 4 ° C, צנטריפוגה lysate התא 10 דקות ב 16,000 XG, ולהעביר את supernatant לצינור חדש.
7. הוספת שרף 2B מב-sepharose 1D4 לsupernatant ו דגירה הלילה ב 4 ° C כדי immunopurify GPCR באמצעות epitope 1D4 מב C-הסופית המהונדס. למחרת לשטוף את החרוזים כמה פעמים עם חיץ תמוגה. דגימות Elute עם SDS 1% ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד.
8. להעביר חלק מeluent לבקבוקון המכיל נוזל נצנץ 15 מיליליטר ולסמוך על מונה נצנץ בטא לכמת את כמות המחייב הספציפי של ליגנד tritiated הקולט דואר.
9. לפתור את eluent מטוהר 1D4 מב שנותר על ידי ג'ל אלקטרופורזה סטנדרטית. אנו משתמשים ב4-12% ג'ל SDS-PAGE ולאחר מכן העברת חצי יבשה לקרום PVDF לimmunoblotting. אנו גם מסלול עם סולם חלבון סטנדרטי להנחות קירוב חזותי של משקל מולקולרי.
   1. לחסום את קרום PVDF עם חלב 5% ב TBS חיץ המכיל 20-Tween 0.05%. לחקור את הקרום כדי לאשר ביטוי הקולטן באורך מלא עם 1D4 מב ואחרי שני נוגדנים אנטי העכבר IgG HRP-מצומדות.
   2. פנק עם chemiluminescence המשופרת מגיב (ECL) ולחשוף את הקרום לautoradiography סרט לדמיין להקות.
10. חותכים את הקרום בסכין גילוח כדי להפריד בין נתיב לדוגמה, ואחריו על ידי חיתוך בסמני משקל מולקולריים ספציפיים. העבר את מקטעי קרום למבחנות המכילות נצנץ נוזל. לכמת את הכמות של טריטיום בכל מגזר קרום על ידי ספירה על דלפק בטא נצנץ.
11. זהה את חיוביphotocrosslink עם זיהוי של טריטיום במסה המולקולרית לכאורה שווה לסכום של זו של GPCR ויגנד.

3. ממוקד Epitope תיוג ותא שטח צמוד לאנזים immunosorbent assay (ELISA)

1. 24 שעות שלאחר transfection, לשטוף תאים עם 1 מיליליטר 1x PBS וtrypsinize עם טריפסין 1 מיליליטר 0.25% במשך 3 דקות. להשלים עם 9 מיליליטר DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ"מ azF. Resuspend תאים ולספור את צפיפות התאים. אנו משתמשים hemocytometer סטנדרטית.
2. טרום לטפל צלחת מחייב גבוהה, ברורה תחתון 96 היטב עם של 0.01 מ"ג / פולי-D-ליזין מיליליטר לכל טוב 100 מיליליטר. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף שוב ושוב עם 1x PBS ואוויר יבש.
3. צלחת 200 μl של תאי transfected בצפיפות של 6 x ^04-8 אוקטובר x 10 ⁴ תאים / היטב לצלחת 96 היטב ולחזור ל37 ° C ב 5% CO ₂ אווירה.
4. למחרת להכין את התאים לתיוג. לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם 100 μl / גם לא PBS 1xo להוציא מדיה מצמיחה המכילה azF. ודא תאים נשארים דבקים, למשל, באמצעות PBS המכיל Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +.}
5. הכן 50-200 מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine מיקרומטר ב1x HBSS / PBS ממניות נשמרו ב5-20 מ"מ ב-PBS. החל 60 מיליליטר היטב כל אחד (בשלושת עותקים עבור כל מוטציה כתומה) ולחזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 4 שעות. שמור על סט של בארות ללא טיפול תווית ב1x HBSS / PBS. כמו כן כולל שליטת GPCR WT להשוות עם גרסאות azF-GPCR.
6. שטוף תאים 3 פעמים עם 100 μl / טוב של חיץ חסימה, BB (1x PBS, BSA 0.5%), כדי להסיר את תווית unreacted לחלוטין.
7. החל 100 μl / טוב של paraformaldehyde 4% (שהוכן ממניות 16% ב 1x PBS) לתאים. דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף שלוש פעמים עם BB.
8. לבצע פרוטוקול ELISA תא השטח סטנדרטי כדי לזהות קולט שכותרתו וביטוי הקולטן. דגירה עם נוגדן ראשוני ל1.5 שעות על קרח ואחרי משנייםהדגירה tibody בטמפרטורת חדר במשך שעה 1.
   1. הוספה של נוגדן אנטי הדגל M2 100 μl (דילול למשל 1:2,000 של נוגדנים שנעשה בBB) כדי לזהות epitope פפטיד דגל של מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine. גם לחקור בארות מטופלים שאינם תווית כביקורת שלילית. הוספה אנטי CCR5 2D7 (אנו משתמשים 1:500 דילול) נוגדן לקבוצה של בארות נפרדת כדי לקבוע WT או ביטוי פני תא azF-GPCR.
   2. שטוף תאים שלוש פעמים עם BB, ודגירה עם נוגדן HRP-מצומדות אנטי העכבר IgG המשני (1:2,000 דילול) 100 μl.
   3. לשטוף בזהירות תאים חמש פעמים עם BB. הוסף חוצץ איתור 50 μl: Amplex אדום, 20 מ"מ H ₂ O _2, 1x PBS (1:10:90 יחס) ו דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. לאסוף נתונים ספקטרליים על קורא צלחת רב גם הקרינה _באקס λ = 530 וλ _em = 590.

4. Bioorthogonal תיוג פלורסנט של GPCR

1. Lyse10 ⁷ תאים שנקטפו להביע WT או azF-Rhodopsin גרסאות במאגר solubilization 1 מיליליטר המכיל 1% (w / v) DM, 50 HEPES מ"מ או טריס-HCl, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 מ"מ CaCl ₂ ומעכבי פרוטאז ל1 שעות ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate התא ב15,000 XG עבור 10 דקות ולאסוף את החלק היחסי supernatant.
2. הוספת 100 μl שרף 2B sepharose 1D4-מב ללכוד קולט באמצעות epitope 1D4 הסופית C המהונדס. דגירה עבור שעה 12 ב 4 ° C. שטוף את השרף שלוש פעמים עם 0.1% (w / v) DDM במאגר M 0.1 פוספט נתרן, pH 7.3.
3. הוספת 0.1 מ"מ והעמסת-phosphine בנפח כולל של 0.3-0.5 מיליליטר לתייג קולט משותק על מטריצת immunoaffinity (2B sepharose 1D4-מב). דגירה של 12 שעה בטמפרטורת חדר. צנטריפוגה ולהסיר supernatant. שטוף את השרף להסרת תווית unreacted.
4. Elute קולט שכותרתו עם חיץ elution 100 מיליליטר מכיל 0.1% (w / v) DDM ו0.33 מ"ג / מיליליטר nonapeptide (פפטיד C9 נגד אפיטופ 1D4)ב2 חיץ פוספט מ"מ, pH 6.0 על ידי דגירה על קרח במשך שעה 1.
5. לפתור דגימות שכותרתו ידי-SDS תחת הפחתת תנאים. שטוף ג'לים לזמן קצר ב PBS ולאחר מכן לדמיין את התיוג של azF-GPCR על ידי הקרינה בג'ל. לדוגמא, השתמש בסורק הקרינה confocal עם לייזר באורך גל 488 ננומטר כדי לזהות קולט שונה עם והעמסת.

תוצאות

אנחנו מועסקים על המתודולוגיה mutagenesis חומצת אמינו לא טבעית לאתר באופן ספציפי, להציג את הבדיקות מולקולריות לGPCR באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. ערכה באיור 1 מתארת ​​את הצעדים הבולטים של המתודולוגיה ויישומים השונים של שילוב UAA תכליתי, p-azido-L-פנילאלנין (...

Discussion

אנו מתארים כאן המתודולוגיה חזקה לשילוב באתר הספציפי של בדיקה תגובתי, azF, לGPCRs ולהדגים שלושה יישומים שימושיים של כלי זה כדי ללמוד את המבנה ודינמיקה של GPCRs. השיטה שלנו לאתר באופן ספציפי לשלב UAAs עוקפת בעיה בסיסית עם אסטרטגיה חלופית המבוססת על תיוג כימי ^{32, 33} או צירוף p...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials