Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Özet

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Özet

Kompleksler sinyal G protein-eşli reseptör (GPCR) yapı ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için, yeni yaklaşımlar reseptör fonksiyonunu bozmayan ifade edilen reseptörlerine bilgi sondaları veya etiket tanıtmak için gereklidir. Bu genetik olarak kodlamak için amber kodonunun bastırılması teknolojisi kullanılan doğal olmayan bir amino asit, heterolog memeli hücrelerinde ifade GPCRs çeşitli hedef konumlarda p-azido-L-fenilalanin (azf). Azido grubunun çok yönlülüğü kendi doğal hücre ortamında veya deterjan çözündürülmüş koşullar altında GPCR'ler çalışma için farklı uygulamalar burada gösterilmektedir. İlk olarak, bir trityum etiketli küçük moleküllü ligand genetik olarak kodlanmış bir azido amino asit çapraz bağlı bir GPCR olan ligand bağlama cebinde kalıntılarını belirlemek için hücre bazlı bir foto-çapraz hedeflenen teknoloji göstermektedir. Daha sonra bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligasyon mina ile reaksiyona göre GPCRs siteye özgü modifikasyonunu göstermekfosfin türevleri kullanılarak azido grubunu hedef tion. Biz, bir bütün hücre bazlı bir ELISA yaklaşım kullanarak in-kültür ve algılama ifade zar proteinlerinin hedef peptide epitop etiketleme için genel bir strateji tartışılmıştır. Son olarak, AZF-GPCR'ler seçici floresan probları ile etiketlendi edilebileceğini göstermektedir. Ilke olarak aktif bir sinyal kompleksi sorgulamak için GPCR ifade edilen herhangi bir amino asit pozisyonunda uygulanabilir olduğu tartışılan yöntemler, geneldir.

Giriş

Heptahelikal G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) önemli ve çeşitli hücre-dışı sinyallerin aracılık eden yüksek dinamik zar proteinlerinin bir üst ailesidir içermektedir. Klasik paradigmada, reseptör aktivasyonu ligand bağlı şekilsel değişiklikleri ile birleştirilmiştir. ¹ GPCRs yapısal biyoloji ² Son gelişmeler zar sinyalizasyon moleküler mekanizmaları üzerinde önemli fikir vermiştir. ^3-5 Ancak, daha büyük kimyasal hassasiyet ile anlamak için fonksiyonel mekanizma ve GPCR'dir sinyal yapısal dinamikleri, yaklaşımları bir araç aktif bir sinyal kompleksleri sorgulamak için bilgilendirici moleküler ve kimyasal sondalar dahil etmek gereklidir.

Bu amaçla, site-spesifik olarak, daha önce Schultz ve c öncülük bastırma teknolojisi kullanılarak amber kodonu doğal olmayan amino asit (UAA) mutagenez göre ifade edilen reseptörlerine olmayan veya minimal bozucu probları tanıtmak için bir yöntem adapteoworkers. ⁶ Bu örneğin memeli hücreleri dışındaki çok heterolog ifade sistemlerinin zordur GPCRs gibi proteinler için yüksek verim ekspresyonu ve mutagenez sistem elde etmek için UAA mutagenez yöntemi optimize edilmiştir. Ortogonal bir mühendislik bastırma tRNA kullanarak ve belirli bir UAA için aminoasil-tRNA sentetaz çifti gelişti, site-spesifik ifade hedef GPCRs içinde UAA'lar tanıttı. UAAS başarıyla dahil edilmesi, p-asetil-L-fenilalanin (ACF), p-benzoil-L-fenilalanin (BZF) ve p-azido-L-fenilalanin (azf) bizim modeli GPCRs olarak gösterilmiştir - rodopsin ve insan CC kemokin alıcısı, CCR5. ^{7, 8}

Prensip olarak, bir UAA genetik olarak protein dizisi içinde herhangi bir pozisyonda kodlanabilir ve bir hedef GPCR tek kodon tarama olanak olarak bu özelliği bir değerli biyokimyasal bir araçtır. Biz bir reaktif Azi olan UAA, azf, çok yönlülük, özellikle burada odakparçasını yapmak. ⁹ AZF aynı zamanda komşu birincil aminler ya da alifatik hidrojenlerin ile reaksiyona sokularak bir ışıkla çapraz bağlayıcı olarak hizmet edebilir, bir kızıl ötesi (IR) ^{probu, 8,} olarak hizmet ek olarak. Buna ek olarak, biyolojik açıdan atıl azido grubu bioorthogonal etiketleme reaksiyonlarda bir seçici kimyasal tutma yeri olarak katılabilir. İşte biz böyle tuzak hedefli foto çapraz bir reseptör-ligand kompleksi ve bioorthogonal epitop etiketleme ve floresan etiketleme stratejilerinin GPCRs modifikasyonu gibi GPCRs, içine AZF site-spesifik esas yararlı uygulamaları gösteren örnekler sunuyoruz.

Işıkla aktive reaktifler 1960'lardan beri biyolojik sistemler incelemek için kullanılmıştır. Bu dönemde ^10, reseptör-ligand çapraz bağlama deneylerinin bir bolluk GPCR kompleksleri incelemek için rapor edilmiştir, burada en fotoafinite ligandları kullanımını içeriyordu. ^{11, 12} Bununla birlikte, bu Onlar gerektirmeyen gibi uygulamalar teknik, sınırlıBir çapraz bağlama grubu taşıyan ligandların e sentezi. ^13-15 Ayrıca, liganddaki çapraz bağlayıcı parça ile, bu GPCR'nin üzerinde çapraz link yerini belirlemek zordur. Site özel bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı proteinlere UAAS olarak foto-çapraz grupların dahil değerli bir gelişmedir. ^{16, 17} Biz, bir reseptör-ligand kompleksinin oluşmasına katılan bir reseptör üzerinde bağlayıcı arayüzü tanımlamak için bir foto-çapraz bağlı bir teknik geliştirdi GPCRs içine fotolabil gruplar getirerek hücreleri canlı. ^{18, 19} Burada, bir küçük moleküllü ligand bağlama sahası, CCR5 üzerinde tritiye Maraviroc tanımlamak için bu hedef foto-çapraz teknolojiyi uygulamak için, deney protokolü ve veri analizi yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem, doğal ligandın kimyasal yapısını koruyarak ek olarak, ligand üzerindeki radyoaktif kolu, kesin miktar istifade eder.

Floresans-tabanlı teknikler, doğrudan reseptörünün oluşum durumunu tarama ile reseptör aktivasyonunun yapısal temeli tam görüşü destekler. ^{20, 21} Bununla birlikte, GPCRs flüoresan etiketler tanıtmak için esneklik sahip teknikler site-spesifik olarak sınırlı bulunmaktadır. Biz GPCR sinyalizasyon komplekslerin tek-molekül algılama (SMD) kolaylaştırmak için bioorthogonal kimyasal modifikasyon stratejileri istihdam ilgilendi. ^22. Azido grubu, Stadinger-Bertozzi ligasyon, ^{23, 24} bakır-germeli terfi azid-olarak bioorthogonal kimyaları katılabilir alkin siklo-(SpAAC) ²⁵ ve bakır ile katalize edilen azit-alkin siklo (CuAAC). ²⁶ İletişim bir azid ve bir fosfin arasındaki özel reaksiyon içerir Staudinger Bertozzi-bağlama reaksiyonu, burada odaklanır. Bir peptid epitop (FLAG peptidi) veya bir fluoresan bir etiket maddeye konjüge iki farklı fosfin türevlerinin kullanımını göstermektedirGPCRs siteye özgü modifikasyonu elde etmek için (fluorescein).

Biz daha önce maruz çözücüdür hedef siteleri seçmek için X-ışını kristal yapıya ve dinamik simülasyonları kullanarak azf varyantları rodopsin site-spesifik etiketleme koşullarını optimize edilmiş. ^{27., 28.} Biz de by background-serbest etiketleme ulaşmak için fizibilite resimli Staudinger- Bertozzi ligasyon. ²⁹ İletişim burada immün afinite matrisi üzerinde hareketsiz hale getirildi ve daha sonra in-jel floresan ile görselleştirilmiştir bir deterjan-çözünebilir reseptörünün floresan etiketleme elde etmek için kullanılan genel prosedürü göstermektedir. Ayrıca, bilinmeyen yapı, CCR5'in bir reseptör üzerinde etiketleme için uygun pozisyonları belirlemek için bu etiketleme strateji üzerinde yararlı bir uzantısı göstermektedir. Bu AZF-GPCR, hücre bazlı bir yarı yüksek bir ürün formatında varyantları bioorthogonal modifikasyonu dayanır bir hedef peptid epitop etiketleme stratejisi kullanılarak gerçekleştirilir. ³⁰ Buyöntem etiketleme olayları izlemek için bir hücre-yüzey ELISA çok adımlı algılama özelliklerini kullanır.

Biz burada tartışmak metodolojiler genel ve ilkesel olarak bastırma teknolojisi kodon sarı kullanarak azf ile dahil herhangi GPCR'nin uygulanabilir. Ayrıntılarıyla GPCRs yapısal ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi ve bunların daha sonraki uygulamaları kullanılarak bu azf gibi UAAS ile dahil reseptörlerin Memeli hücre ekspresyonunda söz konusu olan adımlar Burada yer alan protokollerde.

Protokol

1.. GPCRs içine Doğal olmayan amino asitlerin bölge spesifik genetik Incorporation

1. % 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T hücreler (glukoz 4.5 g / L, 2 mM glutamin) koruyun.
2. Lipofektamin Plus tepkin maddesi kullanılarak 10 cm'lik bir plaka içerisinde% 60-80 konflüansa büyütülmüştür hücreleri transfekte.
   1. 750 ul DMEM için, arzu edilen bir pozisyonda amber durdurma kodonu ihtiva eden 10 ul Plus tepkin maddesi, GPCR cDNA 3.5 ug (pMT4. Rho veya pcDNA 3.1. CCR5), 3.5 baskılayıcı tRNA cDNA'nın (pSVB.Yam) arasında ve 0,35 ug ug eklemek p-azido-L-fenilalanin (pcDNA.RS) için, mutant bir amino asil-tRNA sentetaz cDNA. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ayrıca, bir kontrol olarak hizmet etmek üzere ağırlıkça GPCR cDNA (bir amber durdurma kodonu içeren) kullanılarak da benzer bir transfeksiyon gerçekleştirin. 17 ul Lipofektamin ile DMEM 750 ul bu karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra dengeye getirmek4 ml toplam hacim.
   2. 10 cm'lik bir tabakta aspire ortam hücrelere transfeksiyon karışımı uygulanır ve _CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de geri dönün. 4-6 saat sonra,% 20 FBS ve 1 mM azf içeren 4 ml DMEM hücreleri ek.
3. Ertesi gün, DMEM,% 10 FBS ve 0.5 mM azf içeren büyüme ortamı değiştirin.
4. Hasat hücreleri 48 saat sonrası transfeksiyon, ifadesini analiz ya da aşağıdaki bölümlerde açıklanan foto-veya etiketleme prosedürleri devam etmek.
   1. Büyüme ortamı içinde UAA mevcudiyetinde GPCR sarı mutant ifadesini teyit edin. Biz Batı bağışıklık algılama bunu. Lyse% 1 hücre topağı (ağ / hac) 20 mM Tris-HCI, pH dodesil-β-D-maltozit (DDM) 7.5, 4 ° C 'de 1 saat süre ile 100 mM NaCl 16,000 xg'de lizat santrifüj ve SDS-PAGE ile indirgeyici koşullar altında süpernatantı çözmek. Bir PVDF membrana aktarılır ve inci kullanılarak tam uzunluktaki reseptör ifadesini tespit etmek için bağışıklık-beneklenme analizi gerçekleştirmekreseptörün C-ucunda bir epitopu tanır tasarlanmış e 1D4 mAb (National Hücre Kültürü Merkezi),. ³¹

2. Hedefli foto-kullanarak Ligand Bağlama Sitesi Haritalama

1. 48 saat post-transfeksiyon, hücrelerden aspire ortam ve 4 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile değiştirin. 15 dakika boyunca 37 ° C'de geri dönün.
2. 1x PBS ile tekrar süspansiyon hücreleri ve bir Falcon tüp transfer. Pelet hücreleri ve süpernatan aspire 2 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj.
3. 20 mM HEPES, pH 7.5,% 0.2 BSA ve reseptör-ligand kompleksi oluşmasını sağlamak için, zaman ve sıcaklığın gerekli uzunluğu için bağlanma satürasyon konsantrasyonu da üçlü ligand içeren 1x Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi içinde hücre pelletini.
4. 4 ° C'de 15 dakika boyunca (örneğin, UV-A lambası kullanın) 365 nm'de azf fotoaktivasyon için bir 24 oyuklu veya 96 oyuklu plakaya transfer hücre süspansiyonu Maintain buz üzerinde plaka numune ısıtma ve hücre parçalanmasını önlemek için.
5. Pelet hücreleri, bir Eppendorf tüpü, santrifüje hücreleri aktarın, süpernatant kaldırmak ve analiz geçin. Topaklar gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
6. (W / v) DDM, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5 ve proteaz inhibitörleri% 1 ihtiva eden liziz tamponu içinde hücre topakları yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 1 saatlik inkübasyondan sonra, 16,000 x g'de 10 dakika boyunca hücre lizat santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.
7. Süpernatana 1D4 mAb-sefaroz 2B reçine ilave edin ve işlenmiş C-terminal 1D4 mAb epitop kullanılarak GPCR immunopurify için 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, liziz tamponu ile pek çok kez yıkayın boncuklar. Çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de% 1 SDS ile Elute örnekleri.
8. Bir 15 ml şişe ihtiva eden sintilasyon sıvısına, elüsyon bir kısmını aktarın ve inci olan toz haline getirilmiş olan bağlayıcının spesifik bağlanmasındaki yer değiştirme miktarını belirlemek için bir beta parıldama sayacında sayılıre reseptörü.
9. Standart jel elektroforezi ile kalan 1D4 mAb saflaştırılmış eluen gidermek. Bir 4-12% SDS-PAGE jel ve bağışıklık boyama için bir PVDF membrana daha sonra yarı-kuru aktarımı kullanın. Biz de moleküler ağırlığı görsel yaklaşımı rehberlik standart protein merdiven ile bir şerit bulunur.
   1. % 0.05 Tween-20 içeren TBS tampon maddesi içinde% 5 süt, PVDF membranı ile bloke edin. HRP-konjuge edilmiş anti-fare IgG ikincil antikor, ardından 1D4 mAb ile tam uzunluklu reseptör ifadesini teyit etmek için membran kontrol edin.
   2. Gelişmiş chemiluminescence (ECL) reaktif ile tedavi ve bantları görselleştirmek için filmi otoradyografıye membran maruz.
10. Özel moleküler ağırlık belirteçler kesilerek ardından her numune şerit ayırmak için bir tıraş bıçağı ile membran kesin. Sintilasyon akışkan maddesi ihtiva eden tüplere zar segmentleri aktarın. Bir beta-parıldama sayacında sayılarak, her zar segmentte trityum miktarını ölçmek.
11. Pozitif tespitGPCR ve ligandın bunun toplamına eşit görünür moleküler kütlesi de trityum algılama ile photocrosslink.

3. Epitop Etiketleme ve Hücre yüzey Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Hedeflenen

1. 24 saat post-transfeksiyon PBS'de 1 x 1 ml yıkama hücreleri ve 3 dakika boyunca 1 ml% 0.25 tripsin ile tripsinize edin. ,% 10 FBS ve 0.5 mM azf içeren 9 ml DMEM ile Supplement. Hücrelerin tekrar ve hücre yoğunluğu saymak. Biz standart bir Hemasitometre kullanın.
2. 0.01 mg / ml, oyuk başına poli-D-lisin, 100 ml ile yüksek bağlanma, berrak tabanlı, 96 oyuklu plaka ön tedavi. 1x PBS ve kuru hava ile tekrar tekrar yıkama, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
3. Levha 200 6 x 10 ⁴ yoğunluğunda transfekte edilmiş hücrelerin ul - 8 x 10 ⁴ hücre / oyuk, 96 oyuklu plakaya ve _CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de geri dönün.
4. Ertesi gün etiketleme için hücreleri hazırlamak. Yavaşça 100 ul / göz PBS 1x t ile üç kez yıkayıno herhangi AZF içeren büyüme ortamı çıkarın. Hücreler PBS Ca ^{2 +} ve ^{Mg2 +} ihtiva eden kullanılarak, örneğin, yapışık kalmasını sağlayın.
5. PBS içinde 5-20 mM'de tutulan bir stok 1x HBSS / PBS içinde 50-200 uM FLAG-triarilfosfin etiketleme reaktifi hazırlayın. Her bir (her sarı mutant için üç kopya halinde) 60 ml uygulanır ve 30 dakika ila 4 saat boyunca 37 ° C'de geri dönün. 1x HBSS / PBS içinde etiket tedavisiz gözenekli bir grup kullanın koruyun. Ayrıca AZF-GPCR'dir varyantları ile karşılaştırmak için bir ağırlık GPCR'dir kontrolü içerir.
6. Zamanda, bloke edici tampon içinde 100 ul / ile hücreler 3 kez yıkanmakta, BB (1 x PBS,% 0.5 BSA), tamamen reaksiyona girmemiş etiket çıkarmak için kullanılır.
7. Hücrelere 100 ul / oyuk (1 x PBS içinde% 16 stoktan hazırlandı)% 4 paraformaldehid uygulanır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. BB ile üç kez yıkayın.
8. Etiketli reseptör ve reseptör ekspresyonunu tespit etmek için standart hücre yüzeyi ELISA protokolü yapın. İkinci An ve ardından, buz üzerinde 1.5 saat için primer antikor ile inkübe1 saat oda sıcaklığında inkübasyon tibody.
   1. FLAG-triarilfosfin etiketleme reaktifi FLAG peptit epitopunun tespit etmek için bir anti-FLAG M2 antikoru 100 ul (BB yapılan antikorun örneğin 1:2,000 seyrelti) ilave edin. Aynı zamanda, negatif kontrol olarak etiketli olmayan tedavi kuyu sonda. Wt veya AZF-GPCR, hücre yüzeyi ekspresyonunu belirlemek için kuyu ayrı bir dizi antikoru (1:500 seyreltme bir kullanımı), anti-CCR5 2D7 ekleyin.
   2. BB ile hücreler üç kez yıkayın ve HRP ile konjüge edilmiş anti-fare IgG ikincil antikor (1:2,000 seyreltme), 100 ul ile inkübe edin.
   3. Dikkatle BB ile hücreleri beş kez yıkayın. 50 ul tampon algılama ekleyin Amplex Red, 20 mM ₂ H ₂ O, 1 x PBS (1:10:90 oranı) ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. Λ _ex = 530 bir floresan çoklu-plaka okuyucu üzerinde spektral veri toplamak ve λ _em 590 =.

4. Bir GPCR ve Bioorthogonal floresan etiketleme

1. LyseWt veya AZF-rodopsin% 1 ihtiva eden 1 ml tampon maddesi içinde çözündürme varyantları (w / v) DM, 50 mM HEPES ve Tris-HCI, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 mM _CaCl2 ve 1 proteaz inhibitörleri eksprese eden 10 ⁷ hücre hasat 4 ° C'de hr 10 dakika boyunca 15,000 xg'de santrifüj hücre lizatı ve süpernatan fraksiyonu toplamak.
2. Işlenmiş C terminus 1D4 epitopu ile reseptörün yakalamak için 100 ul mAb 1D4-sefaroz reçinesi 2B ekleyin. 4 ° C'de 12 saat boyunca inkübe 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.3 (w / v)% 0,1 ile DDM, reçineyi üç defa yıkanır.
3. Immün afinite matrisi (mAb 1D4-sefaroz 2B) üzerinde hareketsizleştirilmiş reseptörü etiketlemek için 0.5 ml - 0.3 arasında bir toplam hacim içinde 0.1 mM Fluorescein-fosfin ekleyin. Oda sıcaklığında 12 saat boyunca inkübe edin. Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. Girmemiş etiketi kaldırmak için reçine yıkayın.
4. (W / v) DDM ve 0.33 mg / ml nonapeptit (1D4 epitopuna karşı C9 peptid)% 0.1 ihtiva eden 100 ml yıkama tampon maddesi ile işaretlenmiş reseptörü Zehir2 mM fosfat tampon maddesi içinde 1 saat için buz üzerinde kuluçkalama ile pH 6.0.
5. Indirgeyici koşullar altında SDS-PAGE ile etiketli örnekleri giderin. PBS kısaca jeller yıkayın ve sonra-jel floresan ile AZF-GPCR'nin etiketleme görselleştirmek. Örneğin, floresan ile modifiye reseptörünü tespit etmek için, 488 nm dalga boyu lazer konfokal floresan tarayıcıyı kullanın.

Sonuçlar

Bu spesifik yerinde bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı renkte bir GPCR olarak molekül probları tanıtmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi kullanılabilir. Şekil 1'de şema metodoloji belirgin adımlar ve GPCRs içine, çok yönlü, UAA, p-azido-L-fenilalanin (azf) içeren çeşitli uygulamalarını açıklar. Memeli hücrelerinde AZF-GPCRs sentezlenmesi ligandlarına foto-çapraz hedefli ve bioorthogonal etiketleme kimyasalları ile peptid epi...

Tartışmalar

Biz GPCRs içine, reaktif bir prob, AZF site-spesifik birleşme için buraya sağlam bir metodoloji tarif ve GPCRs yapısını ve dinamiklerini incelemek için bu aracı üç yararlı uygulamaları göstermek. Bizim yöntem sitede-özellikle UAA'lar kimyasal ^{32, 33} etiketleme veya tek erişilebilir sistein mutant foto ³⁴ bağlama dayalı alternatif bir strateji ile temel bir problemi aşılmaktadır dahil. Sistein tiyol grupları hedef kimyaları flüoresan millerini takmak için kullanılmış...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials