Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق هو جيد التحمل، التحقق من صحة، وقابلة للتكرار نموذج من ضمور العضلات والهيكل العظمي. يوصف بروتوكول الجراحية نموذج وتظاهر في C57Black6 الفئران.

Abstract

العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق هو جيد التحمل، التحقق من صحة، وقابلة للتكرار نموذج من إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات والهيكل العظمي في القوارض. على الرغم من أن وضعت أصلا وتستخدم على نطاق واسع في الفئران ويرجع ذلك إلى حجم أكبر لها، العصب قصبي في الفئران كبيرة بما يكفي أنه يمكن التلاعب بها بسهولة مع أي سحق أو عانى من قطع، وترك فروع العصب الشظوي والربلي من العصب الوركي سليمة وبالتالي الحفاظ على العضلات المستهدفة. وهكذا، وهذا النموذج يوفر مزايا إحداث أقل معدلات المراضة وعائقا من التمشي من العصب الوركي نموذج عانى من قطع وأيضا يسمح للمحققين لدراسة الآليات البيولوجية الفسيولوجية الخلوية والجزيئية التي تنظم عملية ضمور العضلات في الفئران المعدلة وراثيا. العصب قصبي تمد الساق، النعلية والعضلات الأخمصية، لذلك عانى من قطع في تصاريح دراسة العضلات والهيكل العظمي يتألف من مزالة العصب سريع نشل ألياف نوع الثاني و / أو بطيئة نشل نوع Iالألياف. هنا علينا أن نظهر العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق في الماوس C57Black6. نحن تقييم ضمور في عضلة الساق، كما في عضلة ممثل، في 1 و 2 و 4 أسابيع بعد إزالة التعصيب عن طريق قياس أوزان العضلات ونوع الألياف محددة منطقة مستعرضة على البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام نسيجية immunostained للميوسين السريع نشل.

Introduction

الهيكل العظمي إزالة التعصيب العضلات، ويرجع ذلك إلى إصابات الأعصاب الطرفية أو المرض أو التدخل الدوائي، والنتائج في خسارة فورية من العضلات وظيفة مقلص الطوعية. العضلات يبدأ بصورة متزامنة إلى ضمور وهذا هو عكسها إذا ضمور في الوقت المناسب، عودة التعصيب ذات النوعية الجيدة يحدث 1،2. في غياب عودة التعصيب، ليف عضلي ضمور تقدم، والتغيرات البيولوجية لا رجعة فيه في العضلات يحدث مع تليف العضلات وفاة ليف عضلي. نحن هنا لشرح نموذج الظنبوب العصب عانى من قطع، وهذا نموذج من إزالة التعصيب التي يسببها الهيكل العظمي ضمور العضلات والتليف، في الفئران. هذا النموذج تمكن العلماء من دراسة الآليات البيولوجية الفسيولوجية الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء ضمور العضلات في الجسم الحي في عضلات الساق والنعلية. بينما تاريخيا تستخدم في الغالب في الفئران، وتطبيق أحدث من هذا النموذج لخروج المغلوب وخطوط الماوس المعدلة وراثيا على وجه التحديد، يسمح المحققون إلى تقييم دور بهمبروتين معين (ق) من الفائدة في الاستقراء وتطوير وصيانة، أو بدلا من حل، وضمور العضلات والتليف في الجسم الحي.

العصب قصبي هو الأعصاب الطرفية الحركية الحسية مختلطة في hindlimb القوارض، وهي واحدة من فروع محطة الثلاثة للعصب الوركي. عانى من قطع في العصب قصبي denervates في الساق، النعلية والعضلات الأخمصية (وثلاثة صغيرة عضلات المثنية العميقة من القدم بما في ذلك الظنبوبي الخلفي، المثنية الطويلة للأصابع وإبهام اليد المثنية hallicus)، وهو نموذج موحد بشكل جيد والتحقق من صحتها في الفئران 3،4 . عضلات الساق والنعلية يمكن تشريح بسهولة في نقاط زمنية المسلسل إضافة عانى من قطع العصب قصبي، الثابتة وتجهيزها لتقييم الأنسجة في العضلات والألياف العضلية morphometrics، أو فلاش تجميد لاستخراج الحمض النووي الريبي العضلات والبروتين لغرض الدراسة، على سبيل المثال، الشبكات الخلوية مما يشير ضمور العضلات تنظيم. اللوحة الرئيسية GAالعضلات strocnemius هو نوع الألياف المختلطة العضلات (النوع الأول والنوع الثاني، على الرغم من أن معظمها من النوع الثاني)، وتتكون العضلة النعلية من نسبة كبيرة من الألياف أنا نوع، وبالتالي توفير حد سواء بسرعة وبطيئة نشل العضلات لتقييم 5،6. العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق هو مناسبة لدراسة عملية إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات في كل من المدى القصير (أيام) (7) والمدى الطويل (أسابيع إلى أشهر) 4،8.

وعلى النقيض من نموذج عانى من قطع العصب الوركي (نموذج الثاني من إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات التي تستخدم عادة في القوارض)، عانى من قطع العصب قصبي يدفع أقل الاعتلال في الحيوان، مما يجعلها نموذجا أكثر جاذبية. عانى من قطع في العصب الوركي denervates جميع عضلات الساق (تحت الركبة) والقدم، وإضعاف قدرة الحيوان للتجول 2، في حين عانى من قطع في العصب قصبي يترك فروع العصب الشظوي والربلي من العصب الوركي سليمة، وبالتالي الحفاظالعضلات المستهدفة والمناطق الحسية. الماوس غير قادر على العطف الأخمصي أو عكس القدم، ولكن قادرة على التجول بسهولة والوزن يتحمل بالتساوي على كل من أطرافه الخلفية، مما يقلل بشكل كبير من معدلات المراضة للنموذج. وقد أجريت دراسات تحليل مشية تقييم أنماط المشي في الفئران بعد اصابات العصب الوركي والظنبوب وإثبات أن البصمة وتحمل الوزن هو الحفاظ بشكل أفضل مع إصابة الظنبوب 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، في العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق، يمكن تعبئتها العصب الشظوي في نقطة وقت لاحق ونقل كمصدر للتأخر عودة التعصيب، إذا كان تصميم الدراسة يتطلب 3. في المقابل، تأخر عودة التعصيب في العصب الوركي نموذج عانى من قطع يتطلب استخدام الكسب غير المشروع العصبية إلى العجز العصب الوركي، جدا زيادة كبيرة في صعوبة فنية من طراز والحد من استخدامه إلى الجراحين المهرة.

في حين أن العصب قصبي نموذج عانى من قطع Requires إلمام المشغل مع تقنية المنطوق العقيمة في جراحة الحيوان، على حد سواء العصب قصبي وعضلات الساق فإنه يعصب يمكن الوصول إليها بسهولة ومحددة للتلاعب، بحيث الأفراد الذين ليسوا الجراحين، أو من ذوي الخبرة العالية مع جراحة الحيوان، ويمكن السيطرة بسهولة هذا النموذج .

Protocol

قبل استخدام هذا النموذج، يجب أن المحققين قد حصل على موافقة لبروتوكول الجراحية من استخدام الحيوانات مؤسستهم التي تحكم الجسم. تمت الموافقة على نموذج من الأخلاق مجلس البحوث، ومؤسسة علوم الصحة هاملتون، جامعة ماكماستر (سياسة الاستخدام المقبول # 10-04-24) ويتم تنفيذها وفقا صارمة مع توصيات المجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. إعداد الماوس

  1. وزن الماوس. لحث التخدير مع 5٪ isoflurane وأو 2٪ هالوثان. يجب على الدوائر الكهربية المستعملة ضمان نظافتها كافية من مخدر لحماية الجراح. بعد 2-3 دقائق تنفس الحيوان سيتباطأ. ضمان منعكس طرفة غائب وقرصة المسافات بين الأصابع في مخلب لتأكيد التخدير الجراحي (أي لم يكن هناك استجابة من الفأر). تطبيق مواد التشحيم العيون للعين، لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة.
  2. حلق الفخذ الجانبية والارداف من الوركيالى الشق الركبة وتطهير مع proviodine. سوف الحلاقة حفاظ على موقع من الشعر شق مجانية لضمان التصور الكافي للالجراحي الميداني وتقليل التدخل في تشريح الأعصاب وعانى من قطع. الشق الوركي، الذي هو أعلى والخلفي لعظم الفخذ، يمكن تحديدها عن طريق الجس.

2. إجراء المنطوق

  1. تقليل isoflurane والاستنشاق إلى 2٪ (هالوثان 1٪) ثم ضع الماوس على جانبها (الجانب المعدة للجراحة التي تواجه متابعة)، تحت مجهر التشغيل أو تشريح. وبدلا من ذلك يمكن إجراء الجراحة مع Loupes لالجراحية منذ التكبير 3.5X مرضية لشخص بالغ (20-25 ز) الماوس.
  2. ارتداء قفازات معقمة. تحديد الشق الوركي من قبل الجس. باستخدام مشرط، شق الجلد من الفخذ الجانبي من الشق الوركي إلى الركبة (حوالي 1 سم).
  3. تنتشر بلطف على الجلد. التعرف على العضلة ذات الرأسين الفخذية، والذي هو عضلة مسطحة سطحية من الفخذ الجانبيةفورا تحت الجلد. باستخدام مقص غرامة، وتقسيم العضلة ذات الرأسين الفخذية على طول الألياف العضلية وعقد مفتوح مع ضام الربيع لفضح العصب الوركي وفروعه.
  4. التعرف على العصب الوركي العميق على الفور إلى الفخذية ذات الرأسين. ويمكن التعرف عليه من قبل مميزة لونه أبيض لامع، وحوالي 0.8 ملم في القطر. يتم تشغيله من الشق الوركي إلى الركبة، المتفرعة في الأعصاب الظنبوب، الشظوي والربلي على مستوى المبأبضية.
  5. فصل بلطف الظنبوب من فروع العصب الشظوي والربلي مع ملقط متناهية الصغر والربيع مقص microdissecting. العصب الظنبوب هو أكبر فرع وعادة ما تكون مركزية. فمن المهم عدم سحق العصب بينما تفصل بين الفروع. عقد العصب فقط على طبقة adventicial الخارجي مع ملقط متناهية الصغر، والحفاظ على الركود العصب (لا يدرس)، وسوف تجنب سحق العصبية وإصابة الجر.
  6. لكاملة ودائمة denervatiعلى، قطع العصب قصبي مع microdissecting مقص وبشكل أقصى قدر ممكن، وتجنب بعناية السفن المأبضية. بدلا من ذلك، لإزالة التعصيب مؤقتة مع عودة التعصيب كاملة المتوقعة في 2-4 أسابيع، يمكن ببساطة أن سحق العصب قصبي مع ملقط متناهية الصغر لمدة 15 ثانية بدلا من مقطوع. (الأعصاب الطرفية تنمو بعد الاصابة وسوف reinnervate العضلات المستهدفة.)
  7. إذا كان المطلوب إزالة التعصيب كاملة، خياطة نهاية العصب قصبي مقطوع إلى السطح الأمامي للعضلة ذات الرأسين الفخذية مع 10-0 نايلون وإعادة الاقتراب من الفخذية ذات الرأسين مع 5-0 VICRYL لمنع الشاذة إعادة تعصيب من الساق و عضلات النعلية.
  8. إغلاق الجلد مع تشغيل 5-0 خياطة VICRYL.

3. أضف الرعاية الجراحية

  1. إيقاف مخدر الاستنشاق ولكن الحفاظ على تدفق الأكسجين. إدارة buprinorphine (أو بديل) مسكن تحت الجلد.
  2. نقل الماوس إلى قفص نظيفة مع عدم وجودالفراش في حين الاستيقاظ من التخدير. الحفاظ على بطانية الاحترار داخل القفص وتحت الملاحظة المباشرة حتى التجول.
  3. نقل ومنزل في قفص أسفل لينة (لا أسلاك) مع الفراش لينة وافرة.
  4. تفقد أطرافهم المنطوق اليومي لحالة من الجروح والقدم لتطوير القرحة كعب استلقاء أو أدلة على مضغ. يمكن أن تدار مشاكل بسيطة مع المضادات الحيوية الموضعية أو المطهرات مثل proviodine. مؤشرات نقطة النهاية التي تتطلب القتل الرحيم الحيوانية هي فقدان الوزن، ودليل على سوء الرعاية الذاتية (الفراء تكدرت)، والتقوس في الجلوس. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي التضحية الحيوانات مع انفتاح الجرح أو القرح الرئيسية التي لا تلتئم في 1-2 أسابيع مع المضادات الحيوية الموضعية أو تظهر لديهم الألم.

4. الساق مزالة العصب والعضلات النعلية الحصاد

  1. في نقطة زمنية ما بعد الجراحة المطلوب، تزن الماوس والتضحية مع CO 2 جرعة زائدة.
  2. يحلق الجانب الإنسي من كل منالمنطوق والساقين التحكم المقابل ونظيفة مع الكحول. ضع الماوس تحت مجهر التشغيل أو تشريح، أو استخدم بدلا من Loupes لعرض الجراحية لالتكبير.
  3. على الطرف المنطوق، شق الجلد العجل وسطي مع مشرط من الكاحل إلى الركبة ومحيطي حول الكاحل. سحب بلطف الجلد مع ملقط قبالة العضلات وقريب نحو الفخذ. هذا يفضح كل عضلات الساق. تحديد عضلة الساق، والذي هو عضلة الساق الذي يمتد من الركبة إلى الكاحل على الجانب الخلفي من الساق وتقع مباشرة تحت الجلد. تحديد الإدراج البعيدة للعضلة ذات الرأسين الفخذية، الأقرب إلى عضلة الساق على الجانب الإنسي من الركبة. في الإدراج لها القاصي يظهر الفخذية ذات الرأسين رقيقة وغشائي ويعتلي الجزء الأكثر القريبة من الساق. باستخدام مقص حادة وتشريح نهاية، فصل بلطف الإدراج القاصي من الفخذية ذات الرأسين من الغازالعضلات trocnemius.
  4. في الإدراج لها القاصي في العقبي، وعضلة الساق التناقص التدريجي في وتر أخيل. التعرف على وتر أخيل، والتي تظهر أبيض وتري. عقد في وتر أخيل مع ملقط، مع الحرص على عدم عقد أو سحق عضلة الساق، وتقسيم وتر أخيل من الإدراج عقبي باستخدام مقص.
  5. ما زالت تحتجز في وتر، ورفع بلطف عضلة الساق (أحمر باهت) قبالة النعلية عميق (أعمق الحمراء)، من الإدراج القاصي نحو أصله عند الركبة (والنعلية يمكن أن تحصد بشكل منفصل).
  6. تشريح الساق قبالة المحطة بقسمة أصل الساق من chondyles عظم الفخذ الإنسي والجانبية باستخدام مقص. الجر لطيف جدا على العضلات يسهل هذه العملية. يجب الحرص على عدم سحق العضلات.
  7. سوف النعلية يكون الآن مرئية بوضوح، على الفور تحت موقع من الساق. رفع النعلية من الإدراج على وتر أخيل ل، أوigin على العجل الخلفي. إذا تم رفع النعلية عن غير قصد مع الساق، فصل برفق من العينة المقطوع. على الساق (الضوء الأحمر) والنعلية (الأحمر الداكن) يظل يسهل التعرف عليها في العينة التي تحصد بسبب وجود خلافات ونها.
  8. وزن العضلات بشكل منفصل على نطاق والدقة.
  9. تقسيم عضلات عموديا، ونصف لتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل (لبروتين اللاحقة و / أو استخراج الحمض النووي الريبي)، والنصف الآخر للعلم الأنسجة (أي تقييم المظهرية، immunohistology) تحديد إما في 10٪ من الفورمالين، أو تثبيت المجمدة في نظير البنتان تبرد مع النيتروجين السائل ، كما تريد.
  10. كرر من الخطوة 4.3 أعلاه على السيطرة، التي تديرها الأمم المتحدة، جنبا إلى حصاد الساق وعضلات التحكم النعلية.

النتائج

عانى من قطع العصب قصبي denervates في الساق، النعلية والعضلات الأخمصية من العجل. نحن هنا تقييم تطور ضمور في عضلة الساق، كما في عضلة ممثل. وكان حصاد عضلة الساق 2-3 أشهر من العمر C57Black 6 الفئران (جاكسون المختبرات) مزالة العصب لمدة 1 أو 2 أو 4 أسابيع. الأوزان العضلات تقلل تدريجيا ...

Discussion

العصب قصبي نموذج عانى من قطع من إزالة التعصيب التي يسببها الهيكل العظمي ضمور العضلات هو نموذج استخداما والتحقق من صحتها جيدا في الفئران. تكيفنا هذا النموذج للاستخدام في الفئران، والذي يسمح للمحقق للاستفادة من وجود الفئران المعدلة وراثيا ودراسة عملية ضمور العضلات

Disclosures

يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من عصبي عضلي شراكة الأبحاث CIHR (JNM - 90959؛ إلى JAEB).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and Materials
10-0 Nylon sutureEthicon2850G
5-0 Vicryl sutureEthiconJ553G
Equipment
Spring microdissecting scissorsFine Surgical Tools15021-15
Ultra fine forcepsFine Surgical Tools11370-40
Non locking micro needle holder (driver)Fine Surgical Tools12076-12
Spring retractorFine Surgical Tools17000-02

References

  1. Fu, S. Y., Gordon, T. Contributing factors to poor functional recovery after delayed nerve repair: prolonged denervation. J. Neurosci. 15, 3886-3895 (1995).
  2. Kobayashi, J., Mackinnon, S. E., Watanabe, O., Ball, D. J., Gu, X. M., Hunter, D. A., Kuzon, W. M. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20, 858-866 (1997).
  3. Bain, J. R., Veltri, K. L., Chamberlain, D., Fahnestock, M. Improved functional recovery of denervated skeletal muscle after temporary sensory nerve innervation. Neuroscience. , 103-503 (2001).
  4. Batt, J., Bain, J., Goncalves, J., Michalski, B., Plant, P., Fahnestock, M., Woodgett, J. Differential gene expression profiling of short and long term denervated muscle. FASEB J. 20, 115-117 (2006).
  5. Sher, J., Cardasis, C. Skeletal muscle fiber types in the adult mouse. Acta Neurol. Scand. 54, 45-56 (1976).
  6. Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F., Butler-Browne, G. Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol. Cell. 95, 399-406 (2003).
  7. Nagpal, P., Plant, P. J., Correa, J., Bain, A., Takeda, M., Kawabe, H., Rotin, D., Bain, J. R., Batt, J. A. The ubiquitin ligase nedd4-1 participates in denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. PLoS ONE. 7, e46427 (2012).
  8. Plant, P. J., Bain, J. R., Correa, J. E., Woo, M., Batt, J. Absence of caspase-3 protects against denervation-induced skeletal muscle atrophy. J. Appl. Physiol. 107, 224-234 (2009).
  9. Varejao, A. S., Meek, M. F., Ferreira, A. J., Patricio, J. A., Cabrita, A. M. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. J. Neurosci. Methods. 108, 1-9 (2001).
  10. Willand, M. P., Holmes, M., Bain, J., Fahnestock, M., de Bruin, H. Electrical muscle stimulation after immediate nerve repair reduces muscle atrophy without affecting reinnervation. Muscle Nerve. 48, 219-225 (2013).
  11. Sterne, G. D., Coulton, G. R., Brown, R. A., Green, C. J., Terenghi, G. Neurotrophin-3-enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b. J. Cell Biol. 139, 709-715 (1997).
  12. Plant, P. J., North, M. L., Ward, A., Ward, M., Khanna, N., Correa, J., Scott, J. A., Batt, J. Hypertrophic airway smooth muscle mass correlates with increased airway responsiveness in a murine model of asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 46, 532-540 (2012).
  13. Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast. Reconstr. Surg. 83, 129-138 (1989).
  14. Hare, G. M., Evans, P. J., Mackinnon, S. E., Best, T. J., Midha, R., Szalai, J. P., Hunter, D. A. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Ann. Plast. Surg. 30, 147-153 (1993).
  15. McLean, J., Batt, J., Doering, L. C., Rotin, D., Bain, J. R. Enhanced rate of nerve regeneration and directional errors after sciatic nerve injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma knock-out mice. J. Neurosci. 22, 5481-5491 (2002).
  16. Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. J. Vis. Exp. (54), e3092 (2011).
  17. Rogoz, K., Lagerstrom, M. C., Dufour, S., Kullander, K. VGLUT2-dependent glutamatergic transmission in primary afferents is required for intact nociception in both acute and persistent pain modalities. Pain. 153, 1525-1536 (2012).
  18. Thornell, L. E. Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 14, 22-27 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

81 gastronemius

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved