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요약

경골 신경 절개 모델은 골격 근육 위축, 잘 용납 검증 및 재현성 모델입니다. 모델 수술 프로토콜은 C57Black6 마우스에 설명 설명된다.

초록

경골 신경 절개 모델은 설치류에서 탈 신경에 의한 근육의 위축, 잘 용납 검증 및 재현성 모델입니다. 원래 개발 및 큰 크기로 인해 쥐에서 광범위하게 사용되지만, 생쥐의 경골 신경은 좌골 신경의 비골과 비복 신경 가지가 손상함으로써 유지 떠나는 쉽게 호감이나 절개하거나 조작 할 수있는 충분히 큰 그들의 목표 근육. 따라서,이 모델은 좌골 신경의 절개 모델보다 이환율과 보행의 장애를 유도하는 장점을 제공하고 또한 연구자들은 유전자 조작 생쥐의 근육 위축의 과정을 조절, 생리 세포 및 분자 생물학적 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 경골 신경 비복근, 가자미근과 plantaris 근육을 공급, 그래서 그 절개 빠른 트 유형 II 섬유 및 / 또는 속도가 느린 트 타입으로 구성 denervated 골격 근육의 연구를 허용 I섬유. 여기에서 우리는 C57Black6 마우스의 경골 신경 절개 모델을 보여줍니다. 우리는 파라핀 조직 학적 부분에 근육 무게와 섬유 유형별 단면적을 측정하여 1, 2에서 대표적인 근육으로 비복근 근육의 위축을 평가하고, 4 주 후 탈 신경은 빠른 트 마이 오신에 대한 면역 염색.

서문

외상성 말초 신경 손상, 질병이나 약물의 개입에 의한 골격근 탈 신경, 근육의 자발적 수축 기능의 즉각적인 손실됩니다. 근육 병용 위축으로 시작하고 적시에 양질의 reinnervation 1,2가 발생했을 경우이 위축 가역적이다. reinnervation의 부재에서, 근섬유의 위축이 진행하고, 근육에 돌이킬 수없는 생물학적 변화는 근육의 섬유화 및 근섬유의 죽음으로 발생합니다. 여기에서 우리는 쥐의 경골 신경 절개 모형, 탈 신경 유도 된 근육의 위축과 섬유화의 모델을 보여줍니다. 이 모델은 비복근과 가자미근의 근육 생체 내에서 근육 위축의 기초, 생리 세포 및 분자 생물학적 메커니즘을 연구하는 과학자들 수 있습니다. 역사적 쥐에서 주로 사용하지만, 녹아웃 특히 유전자 변형 마우스 라인이 모델의 최근 응용 프로그램은 연구자가 자신의 역할을 평가할 수 있습니다생체 내 유도, 개발 및 유지 보수, 또는 양자 택일의 해상도, 근육 위축 및 섬유화에 대한 관심의 특정 단백질 (들).

경골 신경 쥐 뒷다리의 혼합 모터 감각 말초 신경이며, 좌골 신경의 세 단자 가지 중 하나입니다. 경골 신경의 절개 비복근, 가자미근과 plantaris 근육 (및 후방 경골근, 굴근 digitorum의 롱 및 굴근 hallicus의 롱 등 다리의 세 개의 작은 깊은 굴곡 근육) denervates, 그리고 쥐 3,4에서 잘 표준화되고 검증 된 모델입니다 . 비복근과 가자미근의 근육은 쉽게 경골 신경 절개, 고정 공부의 목적을 위해 근육 RNA와 단백질의 추출 냉동 근육 조직학과 근육 섬유 morphometrics, 또는 플래시의 평가를위한 처리, 예를 들면 게시, 연속 시간 지점에서 해부 할 수 있습니다 근육 위축을 조절하는 세포 신호 전달 네트워크. GAstrocnemius 근육이 혼합 된 섬유 형 근육 (유형 I 및 유형 II, 주로 유형 II 있지만)과 가자미근 근육함으로써 평가 5,6에 대한 빠르고 느린 모두 트 근육을 제공하는 타입 I 섬유의 큰 비율로 구성되어 있습니다. 경골 신경 절개 모델 (개월 주) 단기 (일) 7 및 장기 모두 4.8에서 탈 신경에 의한 근육 위축의 과정을 공부 적합합니다.

좌골 신경 절개 모델 (일반적으로 설치류에 사용되는 탈 신경에 의한 근육 위축의 두 번째 모델)과 대조적으로, 경골 신경 절개가 더 매력적인 모델을 만들고, 동물 덜 사망률을 유도합니다. 경골 신경의 절개가 좌골 신경의 비골과 비복 신경 분기는 그대로 유지하는 반면 좌골 신경의 절개 따라서 보존, 2 ambulate하는 동물의 능력을 저해, 다리 (무릎 아래)과 다리의 모든 근육을 denervates그들의 목표 근육과 감각 지역. 마우스 발바닥 플렉스 할 수 없습니다 또는 발 반전이지만, 쉽게 ambulate 할 수 있으며 무게는이를 크게 모델의 사망률을 감소, 양쪽 뒷다리에 동등하게 부담. 걷는 패턴을 평가하는 보행 분석 연구는 경골과 좌골 신경 손상에 따라 쥐에서 수행 공간과 무게를 베어링 더 경골 부상 9,10으로 유지되고 있음을 입증.되었습니다 연구 설계 3 필요한 경우, 또한, 경골 신경 절개 모델에서, 비골 신경은 나중에 지점에서 동원 할 수 있으며, 지연 reinnervation의 소스로 전송. 반면, 좌골 신경의 절개 모델에서 지연 reinnervation은 매우 크게 모델의 기술적 어려움을 증가하고 숙련 된 외과 의사에 그것의 사용을 제한, 좌골 신경 적자에 신경 이식의 사용을 필요로한다.

동안 경골 신경 절개 모델 연구이 innervates 경골 신경 및 종아리 근육을 모두 동물 수술 불임 수술 기법 연산자의 친숙 함을 equires 외과하지 않거나 매우 동물의 수술 경험이 개인이 쉽게이 모델을 마스터 할 수 있도록, 조작 쉽게 접근하고 식별 할 수 .

프로토콜

이전에이 모델을 사용하여, 연구자들은 몸을 관장하는 교육 기관의 동물 사용으로 수술 프로토콜에 대한 승인을받은이 있어야합니다. 모델은 연구 윤리위원회, 해밀턴 건강 과학 회사, McMaster 대학 (AUP # 10-04-24) 승인 및 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라 엄격 수행됩니다.

1. 마우스 준비

  1. 마우스를 무게. 5 isoflurane을 % 또는 2 % 할로 탄으로 마취를 유도. 외과 의사를 보호하기 위해 마취의 청소 적절한 사용 회로 확인해야합니다. 2 ~ 3 분 후에는 동물의 호흡 속도가 느려집니다. 깜박 반사가없는 확인하고 수술 마취 (마우스에 의한 응답의 ie) 확인 발에서 인터 공백을 꼬집어. 수술 중 각막의 건조를 방지하기 위해 눈 안과 윤활제를 적용합니다.
  2. 좌골의 측면 허벅지와 엉덩이를 면도무릎 노치와 proviodine으로 소독. 면도는 수술 부위의 적절한 시각화를 보장하기 위해 신경 박리와 절개의 간섭을 최소화하기 위해 절개 모발의 사이트에 무료로 유지됩니다. 우수하고 대퇴골 후방에있는 좌골 노치, 촉진하여 식별 할 수 있습니다.

2. 수술 절차

  1. 2 % (할로 1 %)로 흡입 isoflurane을을 줄이고 운영 또는 해부 현미경 아래에서 옆으로 (위로 향하게 수술을위한면)에 마우스를 놓습니다. 3.5X 배율 성인 (20 ~ 25 g) 제품 마우스 만족하기 때문에 다른 방법으로 수술은 외과 루페을 수행 할 수 있습니다.
  2. 멸균 장갑을 걸칠. 촉진하여 좌골 노치를 식별합니다. 좌골 노치에서 무릎 (약 1cm)의 측면 허벅지 메스, 절개 피부에 사용.
  3. 부드럽게 피부를 확산. 대퇴 이두근 근육을 식별, 어느 측면 허벅지의 평평한 표면 근육이다바로 피부 아래에. 미세 가위를 사용하여, 근육 섬유를 따라 대퇴 이두근 근육을 분리하고 좌골 신경과 그 분지를 노출 스프링 견인기로 열기십시오.
  4. 대퇴 이두근 근육에 즉시 깊은 좌골 신경을 식별합니다. 그것은 그것의 특성 빛나는 화이트 색상으로 식별 직경 약 0.8 mm입니다 수 있습니다. 그것은 오금의 수준에서, 경골 비골 및 비복 신경에 분기, 좌골 노치에서 무릎 실행합니다.
  5. 부드럽게 미세 집게 봄 microdissecting 가위로 비골과 비복 신경 가지에서 경골을 분리합니다. 경골 신경 최대 규모의 지점이며 일반적으로 중앙이다. 그것은 가지를 분리하는 동안 신경을 분쇄하지 않는 것이 중요합니다. 미세 집게로 그냥 외부 adventicial 레이어에 신경을 들고, 및 신경 이완을 (가르쳤다) 유지, 신경 호감 및 견인 부상을 방지합니다.
  6. 완전하고 지속적인 denervati에 대한에 신중 오금 혈관을 피하기 위해, 같은 원심 가능한 가위 microdissecting과 경골 신경을 잘라. 또는 2-4 주간 예상 완료 reinnervation에 일시적으로 탈 신경에 대해, 경골 신경이 단순히 절단하여 15 초 대신에 대한 미세 집게로 분쇄 할 수 있습니다. (말초 신경은 다음과 같은 부상을 자라게 및 대상 근육을 reinnervate 않습니다.)
  7. 완전한 탈 신경이 필요한 경우, 비복근의 재 신경 분포 탈선을 방지하기 위해 5-0 Vicryl로 10-0 나일론을 다시 대략 대퇴 이두근과 대퇴 이두근 근육의 앞쪽 표면에 절단되어 경골 신경의 끝을 봉합하고 가자미근의 근육.
  8. 실행 5-0 Vicryl 봉합사로 피부를 닫습니다.

3. 수술 케어 게시

  1. 흡입 마취제를 끄고 있지만 산소의 흐름을 유지한다. 피하 진통 buprinorphine (또는 대체) 관리 할 수​​ 있습니다.
  2. 더 깨끗하고 케이지에 마우스를 전송하지침구 마취에서 깨어있는 동안. ambulating까지 케이지 내에서 직접 관찰 아래 온난화 담요에 보관하십시오.
  3. 충분한 부드러운 침구 연약한 바닥 케이지 전송 및 집 (하지 선).
  4. 욕창 발 뒤꿈치 궤양이나 씹는 증거의 개발을위한 수술 상처 다리의 조건을 매일 수술 다리를 검사합니다. 사소한 문제는 국소 항생제 나 proviodine 등의 방부제로 관리 할 수​​ 있습니다. 동물의 안락사를 요구하는 엔드 포인트 지표는 체중 감소, 가난한자가 치료의 증거 (뻗치고 모피) 및 구부리고 자세입니다. 또한, 중상 중단 또는 국소 항생제로 1-2주에서 치료 또는 고통을 가지고 나타나지 않는 궤양 동물 희생해야한다.

4. Denervated 비복근과 가자미근 근육 수확

  1. 원하는 수술 시점에서, CO 2 과다와 마우스와 희생의 무게.
  2. 모두의 내측 측면을 면도수술 및 반대측 제어 다리와 알코올로 청소하십시오. 운영 또는 해부 현미경 마우스를 놓고, 또는 양자 택일 확대를위한 수술보기 루페를 사용합니다.
  3. 수술 사지에 무릎 발목에서 메스와 원주 발목 주위와 내측 종아리 피부를 절개. 부드럽게 근육을 끄고 근위부 허벅지를 향해 집게로 피부를 잡아 당깁니다. 이 다리의 모든 근육을 노출합니다. 무릎에서 다리의 후방 측면의 발목을 실행하고 피부 바로 아래 자리 잡고 종아리 근육 인 비복근을 확인합니다. 무릎의 내측 측면의 비복근 근육 근위 대퇴 이두근 근육의 말초 삽입을 확인합니다. 의 말초 삽입시 대퇴 이두근 얇고 엷은 껍질 나타나는 비복근의 가장 근위부 위에 놓. 가위 무딘 끝 절개를 사용하여 부드럽게 가스 대퇴 이두근의 원심 삽입을 분리trocnemius 근육.
  4. calcaneous으로는 말초 삽입시, 비복근 근육이 아킬레스 건에 테이퍼. 흰색과 힘찬 나타나는 아킬레스 건을 확인합니다. 보류 또는 비복근 근육을 분쇄 않도록주의하면서, 집게와 아킬레스 건을 잡고 가위를 사용하여 종골 삽입에서 아킬레스 건을 나눕니다.
  5. 아직도 힘줄을 잡고 조심스럽게 무릎에서 그 기원으로 말초 삽입 (가자미근이 별도로 수확 할 수있다)에서, 깊은 가자미근 (깊은 적색) 떨어져 비복근 (엷은 홍색)를 들어 올립니다.
  6. 가위를 사용하여 내측 및 외측 대퇴골 chondyles에서 비복근의 출처를 나누어 다리 해제 비복근을 해부하다. 근육이 매우 부드러운 견인이 프로세스를 용이하게합니다. 근육을 분쇄하지 않도록주의해야합니다.
  7. 가자미근 지금 바로 비복근의 사이트에서 노골적으로 표시됩니다. 에 아킬레스의 힘줄의 삽입에서 가자미근을 들어 올려 그 또는후방 종아리에이긴. 가자미근이 실수 비복근 제기되는 경우, 조심스럽게 수확 한 시료에서 분리합니다. 비복근 (밝은 빨강)과 가자미근 (진한 빨강)의 색깔의 차이로 인해 수확 시편 쉽게 식별 남아 있습니다.
  8. 정밀 저울에 별도로 근육 무게.
  9. (이후 단백질 및 / 또는 RNA 추출을위한) 액체 질소 스냅 냉동, 수직 절반 근육을 분리하고, 조직학 (즉, 형태 학적 평가, immunohistology)에 대한 반 이소 펜탄 10 포르말린 %, 또는 냉동 고정에 하나 고정은 액체 질소로 냉각 원하는대로.
  10. 제어 비복근과 가자미근의 근육을 수확하는 컨트롤 위의 단계 4.3, 유엔 운영 측면에서 반복합니다.

결과

경골 신경 절개는 비복근, 가자미근과 종아리의 plantaris 근육을 denervates. 여기에 우리가 대표하는 근육으로, 비복근 근육 위축의 발전을 평가합니다. 비복근의 근육은 1, 2, 4 주 동안 denervated 2-3개월 이전 C57Black 6 마우스 (잭슨 연구소)에서 수확했다. 근육의 무게는 점차적으로 시간이 지남에 따라 유형 II 빠른 트 위치 근육 섬유 (그림 2)의 단면적 않습니다 (그림 1) 감?...

토론

탈 신경에 의한 근육 위축의 경골 신경 절개 모델 쥐에서 일반적으로 채택하고 잘 검증 된 모델입니다. 우리는 조사가 유전자 조작 생쥐의 존재를 활용하고 근육 질량 7,8의 규제에 중요한 단백질의 부재에서 생체 내에서 근육 위축의 과정을 연구 할 수 있도록 마우스의 사용이 모델을 채택했다. 비복근과 가자미근의 근육이 모델에 denervated 모두, 따라서 이후의 분자 분석을위한 우?...

공개

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 작품은 CIHR 신경 근육 학 연구 협력 (-; JAEB에 90959 JNM)에서 교부금에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and Materials
10-0 Nylon sutureEthicon2850G
5-0 Vicryl sutureEthiconJ553G
Equipment
Spring microdissecting scissorsFine Surgical Tools15021-15
Ultra fine forcepsFine Surgical Tools11370-40
Non locking micro needle holder (driver)Fine Surgical Tools12076-12
Spring retractorFine Surgical Tools17000-02

참고문헌

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