Resezione del nervo tibiale - Un modello standardizzato per Denervation indotta scheletrico atrofia muscolare nei topi

Riepilogo

Il modello di resezione del nervo tibiale è un modello ben tollerato, validato e riproducibile di atrofia del muscolo scheletrico. Il protocollo chirurgico modello è descritto e dimostrato in C57Black6 topi.

Abstract

Il modello di resezione del nervo tibiale è un modello ben tollerato, validato e riproducibile di denervazione indotta atrofia del muscolo scheletrico nei roditori. Benché originariamente sviluppato e ampiamente utilizzato nel ratto causa delle sue grandi dimensioni, il nervo tibiale nei topi è abbastanza grande da poter essere facilmente manipolato con uno schiacciamento o transezione, lasciando i rami peroneale e surale del nervo sciatico intatto e preservando così i loro muscoli bersaglio. Così, questo modello offre i vantaggi di indurre minore morbilità e impedimento della deambulazione rispetto al modello resezione del nervo sciatico e permette anche ai ricercatori di studiare i fisiologici, cellulare e molecolare dei meccanismi biologici che regolano il processo di atrofia muscolare nei topi geneticamente modificati. Il nervo tibiale fornisce il gastrocnemio, soleo e muscoli plantare, quindi la sua recisione permette lo studio del muscolo scheletrico denervato composto da fibre a contrazione rapida di tipo II e / o tipo di contrazione lenta iofibre. Qui mostriamo il modello recisione del nervo tibiale nel topo C57Black6. Valutiamo l'atrofia del muscolo gastrocnemio, come un muscolo rappresentante, a 1, 2 e 4 settimane dopo la denervazione misurando pesi muscolari e l'area specifica il tipo di fibra trasversale su paraffina sezioni istologiche immunocolorate per una rapida contrazione della miosina.

Introduzione

Denervazione del muscolo scheletrico, a causa di una lesione traumatica dei nervi periferici, malattie o intervento farmacologico, comporta l'immediata perdita della funzione contrattile del muscolo volontario. Muscle inizia in concomitanza ad atrofizzarsi e questa atrofia è reversibile se tempestivo, reinnervazione di buona qualità si verifica ^1,2. In assenza di reinnervazione, myofiber atrofia progredisce, e cambiamenti biologici irreversibili nel muscolo si verifica con fibrosi muscolare e morte miofibre. Qui mostriamo il modello nervo tibiale resezione, un modello di denervazione indotta-atrofia del muscolo scheletrico e la fibrosi, nei topi. Questo modello consente agli scienziati di studiare le fisiologiche, cellulari e molecolari meccanismi biologici che sono alla base atrofia muscolare in vivo nei muscoli gastrocnemio e soleo. Mentre storicamente utilizzato prevalentemente nei ratti, di più recente applicazione di questo modello ad eliminazione diretta e le linee di topi transgenici in particolare, consente agli investigatori di valutare il ruolo dei loroparticolare proteina (s) di interesse nella induzione, sviluppo e manutenzione, o in alternativa la risoluzione, atrofia muscolare e fibrosi in vivo.

Il nervo tibiale è un nervo periferico motore-sensoriale mista nel hindlimb roditore, ed è uno dei tre rami terminali del nervo sciatico. Recisione del nervo tibiale denervates gastrocnemio, soleo e muscoli plantare (e le tre piccoli muscoli flessori profondi del piede compreso tibiale posteriore, flessore lungo delle dita e flessore hallicus longus), ed è un modello ben standardizzati e validati nei ratti ^3,4 . I muscoli gastrocnemio e soleo può essere facilmente sezionato in momenti seriali postare recisione del nervo tibiale, fissati e trattati per la valutazione di istologia dei muscoli e fibre muscolari morfometria, o Flash congelati per l'estrazione di RNA e proteine ​​muscolari a scopo di studio, per esempio, le reti cellulari di segnalazione che regolano l'atrofia muscolare. La gastrocnemius muscolare è un tipo di fibra muscolare misto (tipo I e tipo II, anche se prevalentemente di tipo II) e il muscolo soleo è composto da una grande percentuale di fibre di tipo I, fornendo in tal modo sia veloce e lenta contrazione muscolare per la valutazione ^5,6. Il modello di resezione del nervo tibiale è adatto per studiare il processo di denervazione indotta da atrofia muscolare, sia a breve termine (giorni) ⁷ e lungo termine (settimane o mesi) ^4,8.

In contrasto con il modello transezione del nervo sciatico (un secondo modello di denervazione indotta atrofia muscolare comunemente usato nei roditori), transezione del nervo tibiale induce meno morbilità nell'animale, rendendolo un modello più attraente. Transezione del nervo sciatico denervates tutti i muscoli della gamba (sotto il ginocchio) e piede, riducendo la capacità del animale di deambulare ^2, mentre transezione del nervo tibiale lascia i rami del nervo peroneo e surale del nervo sciatico intatto, preservando cosìi loro muscoli bersaglio e territori sensoriali. Il mouse è in grado di flessione plantare oppure invertire il piede, ma è in grado di deambulare facilmente e sopporta il peso equamente sui due arti posteriori, diminuendo così significativamente la morbidità del modello. Andatura studi di analisi che valutano i modelli a piedi sono stati condotti in ratti dopo lesioni del nervo tibiale e sciatico e dimostrare che ingombro e peso del cuscinetto è meglio conservato con lesione tibiale ^9,10. Inoltre, nel modello transezione del nervo tibiale, il nervo peroneo può essere mobilizzato in un punto temporale successivo e trasferita come fonte di ritardata reinnervazione, se il disegno studio richiede ^3. Al contrario, ritardato reinnervazione nel modello transezione del nervo sciatico richiede l'uso di un innesto nervoso al deficit nervo sciatico, molto aumentando notevolmente la difficoltà tecnica del modello e limitazione all'uso chirurghi qualificati.

Mentre il nervo tibiale modello transection requires familiarità dell'operatore con tecnica operatoria sterile nella chirurgia degli animali, sia il nervo tibiale e muscoli del polpaccio si innerva sono facilmente accessibili e identificabili per la manipolazione, in modo che gli individui che non sono chirurghi, o di grande esperienza con la chirurgia degli animali, possono facilmente padroneggiare questo modello .

Protocollo

Prima di utilizzare questo modello, i ricercatori devono aver ricevuto l'approvazione per il protocollo chirurgico dall'uso degli animali della loro istituzione organo di governo. Il modello è approvato dal Consiglio di etica della ricerca, Hamilton Health Sciences Corporation, McMaster University (AUP # 10-04-24) e viene effettuata in stretta conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese sulla cura degli animali.

1. Topo Preparazione

1. Pesare il mouse. Indurre l'anestesia con il 5% isoflurano o 2% alotano. Il circuito utilizzato dovrebbe garantire un'adeguata scavenging dell'anestetico per proteggere il chirurgo. Dopo 2-3 minuti di respirazione dell'animale rallenterà. Assicurarsi che il riflesso corneale è assente e pizzicare gli spazi interdigitali della zampa per confermare l'anestesia chirurgica (cioè nessuna risposta dal mouse). Applicare oftalmica lubrificante per gli occhi, per evitare l'essiccazione della cornea durante l'intervento chirurgico.
2. Shave laterale della coscia e gluteo dalla sciaticotacca per il ginocchio e disinfettare con proviodine. Rasatura manterrà il sito del pelo libero incisione per garantire un'adeguata visualizzazione del campo chirurgico e per minimizzare l'interferenza con dissezione e transezione del nervo. La tacca sciatico, che è superiore e posteriore al femore, può essere identificato con la palpazione.

2. Procedura Operativa

1. Ridurre inalatoria isoflurano al 2% (alotano 1%) e posizionare il mouse su un fianco (lato destinata all'intervento rivolto verso l'alto), sotto un microscopio operatorio o dissezione. In alternativa, la chirurgia può essere eseguita con gli occhialini chirurgico poiché ingrandimento 3,5 x è soddisfacente per un topo adulto (20-25 g).
2. Indossare guanti sterili. Identificare la tacca sciatico con la palpazione. Usando un bisturi, incidere la pelle della coscia laterale dalla tacca sciatico al ginocchio (circa 1 cm).
3. Diffondere delicatamente la pelle. Identificare il muscolo bicipite femorale, che è il muscolo superficiale piatto della coscia lateraleimmediatamente sotto la pelle. Utilizzando le forbici sottili, dividere il muscolo bicipite femorale lungo le fibre muscolari e tenere aperto con un divaricatore molla per esporre il nervo sciatico e suoi rami.
4. Identificare il nervo sciatico immediatamente profondo al muscolo bicipite femorale. Esso può essere identificato dal suo caratteristico colore bianco lucida ed è circa 0,8 mm di diametro. Si corre dalla tacca sciatico al ginocchio, ramificazione nei nervi tibiale, peroneale e surale a livello della fossa poplitea.
5. Separare delicatamente il tibiale dai rami del nervo peroneo e surale con pinze ultrafine e la primavera forbici microdissecting. Il nervo tibiale è il più grande ramo ed è solitamente centrale. E 'importante non schiacciare il nervo mentre separando i rami. Tenendo il nervo solo sullo strato esterno adventicial con le pinze ultrafini, e mantenendo il gioco nervo (non insegnato), eviterà schiacciamento del nervo e lesioni trazione.
6. Per una completa e duratura denervatisu, tagliare il nervo tibiale con microdissecting forbici come distalmente possibile, evitando accuratamente i vasi poplitea. In alternativa, per la denervazione temporaneo previsto reinnervazione completa in 2-4 settimane, il nervo tibiale può essere semplicemente schiacciato con una pinza ultrafini per 15 sec invece di transected. (Nervi periferici ricrescere seguenti lesioni e saranno Reinnervate muscolo bersaglio.)
7. Se è richiesta la completa denervazione, suturare l'estremità del nervo tibiale transected alla superficie anteriore del muscolo bicipite femorale con 10-0 Nylon e ri-approssimare il bicipite femorale con 5-0 Vicryl per impedire aberrante reinnervazione dei gastrocnemio e soleo.
8. Chiudere la pelle con una corsa 5-0 sutura Vicryl.

3. Posta operatorio

1. Spegnere l'anestetico inalatorio, ma mantenere il flusso di ossigeno. Somministrare buprinorphine (o sostituto) analgesico per via sottocutanea.
2. Passa il mouse in una gabbia pulita senzabiancheria da letto, mentre risveglio dall'anestesia. Tenere su una coperta di riscaldamento all'interno della gabbia e sotto diretta osservazione fino deambulazione.
3. Il trasferimento e la casa in morbido movimento centrale (non filo) con ampio letto morbido.
4. Ispezionare l'arto operativa quotidiana per la condizione della ferita chirurgica e il piede per lo sviluppo di ulcere da decubito del tallone o prova di masticazione. I problemi minori possono essere gestiti con antibiotici topici o antisettici come proviodine. Indicatori Endpoint richiedono l'eutanasia degli animali sono la perdita di peso, la prova di scarsa cura di sé (pelo arruffato), e postura ricurva. Inoltre, gli animali con gravi disagi ferite o ulcere che non guariscono in 1-2 settimane con antibiotici topici o sembrano avere dolore dovrebbero essere sacrificati.

4. Gastrocnemio e soleo Denervato Harvest muscolare

1. Al punto di tempo post-operatorio desiderato, pesare il mouse e il sacrificio con il sovradosaggio di CO _2.
2. Shave faccia mediale sia deloperative e le gambe di controllo controlaterale e pulito con l'alcol. Posizionare il mouse sotto un microscopio operatorio o dissezione, o in alternativa utilizzare lenti di ingrandimento di visualizzazione chirurgico per l'ingrandimento.
3. Sull'arto operativa, incidere la pelle mediale vitello con un bisturi dalla caviglia al ginocchio e circonferenzialmente intorno alla caviglia. Estrarre delicatamente la pelle con una pinza fuori il muscolo e prossimalmente verso la coscia. Ciò espone tutti i muscoli della gamba. Identificare il muscolo gastrocnemio, che è il muscolo del polpaccio che va dal ginocchio alla caviglia sulla faccia posteriore della gamba e si trova immediatamente sotto la pelle. Identificare l'inserzione distale del muscolo bicipite femorale, prossimale al muscolo gastrocnemio sulla faccia mediale del ginocchio. Alla sua inserzione distale del bicipite femorale appare sottile e vaporosa e sovrappone la parte più prossimale del gastrocnemio. Utilizzando le forbici e la dissezione estremità smussata, separare delicatamente l'inserzione distale del bicipite femorale dal gasmuscolo trocnemius.
4. Alla sua inserzione distale nel calcagno, il muscolo gastrocnemio rastrema nel tendine di Achille. Identificare il tendine di Achille, che appare bianco e nervosa. Tenere il tendine di Achille con una pinza, facendo attenzione a non tenere o schiacciare il muscolo gastrocnemio, e dividere il tendine di Achille dall'inserimento calcagno con le forbici.
5. Sempre tenendo il tendine, sollevare delicatamente il muscolo gastrocnemio (rosso chiaro) dai soleo profonde (più profonde rosso), da l'inserzione distale verso la sua origine al ginocchio (il soleo può essere raccolto separatamente).
6. Sezionare il gastrocnemio largo della gamba dividendo l'origine delle gastrocnemio dai chondyles femore mediale e laterale con le forbici. Trazione molto delicato sul muscolo facilita questo processo. Fare attenzione a non schiacciare il muscolo.
7. Il soleo saranno ora chiaramente visibile, immediatamente sotto il sito del gastrocnemio. Sollevare il soleo dalla sua inserzione sul tendine di Achille alla sua oigin sul polpaccio posteriore. Se il soleo viene inavvertitamente sollevato con il gastrocnemio, separare delicatamente dal campione raccolto. Il gastrocnemio (luce rossa) e soleo (rosso scuro) rimangono facilmente identificabile nel campione raccolto a causa delle loro differenze di colore.
8. Pesare i muscoli separatamente su una bilancia di precisione.
9. Dividere i muscoli verticalmente, metà per scatto congelamento in azoto liquido (per successiva proteine ​​e / o estrazione di RNA), e metà per istologia (cioè la valutazione morfometrica, immunoistologia) fissa sia in formalina al 10%, o fissazione congelati in isopentano raffreddato con azoto liquido , se lo desideri.
10. Ripetere dal punto 4.3 sopra il controllo, non operato, fianco a raccogliere gastrocnemio di controllo e muscoli soleo.

Risultati

Recisione del nervo tibiale denervates gastrocnemio, soleo e muscoli plantare del polpaccio. Qui valutiamo lo sviluppo di atrofia nel muscolo gastrocnemio, come un muscolo rappresentante. Muscolo gastrocnemio è stato raccolto da 2-3 mesi vecchi C57Black 6 topi (Jackson Laboratories) denervati per 1, 2, o 4 settimane. Pesi muscolari diminuiscono progressivamente (figura 1), così come l'area di sezione trasversale di tipo II fibre muscolari a contrazione rapida (Figura 2), nel...

Discussione

Il nervo modello di resezione tibiale di atrofia del muscolo scheletrico denervazione-indotta è un modello comunemente impiegato e ben convalidato nei ratti. Abbiamo adattato questo modello per l'uso in topi, che consente al ricercatore di sfruttare la presenza di topi geneticamente ingegnerizzati e studiare il processo di atrofia muscolare in vivo, in assenza di proteine ​​fondamentali per la regolazione della massa muscolare ^7,8. I muscoli gastrocnemio e soleo, sia denervato in questo mode...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02