חיתוך רוחב עצב הטיביאלי - מודל סטנדרטי לניוון שרירים שלד מושרה denervation בעכברים

Summary

מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי הוא מודל נסבל היטב, אימות, ושחזור של ניוון שרירים שלד. הפרוטוקול כירורגית המודל מתואר והפגין בC57Black6 עכברים.

Abstract

מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי הוא מודל נסבל היטב, אימות, ושחזור של ניוון שרירים שלד מושרה denervation במכרסמים. למרות שפותח במקור ושימוש נרחב בעכברים בגלל הגודל שלה, העצב הטיביאלי בעכברים הוא גדול מספיק שניתן לטפל בו בקלות עם או למעוך או חיתוך רוחב, והשאיר את ענפי עצב peroneal וsural של העצב השת ללא פגע וכך לשמר שרירי היעד שלהם. לכן, מודל זה מציע את היתרונות של גרימת פחות תחלואה ומניעה של ambulation מאשר דגם חיתוך רוחב העצב השת וגם מאפשר לחוקרים ללמוד את המנגנונים פיסיולוגיים הביולוגיים, תאיים ומולקולריים המסדירים את התהליך של ניוון שרירים בעכברים מהונדסים גנטי. העצב הטיביאלי מספק את הגסטרוקנמיוס, soleus והשרירים plantaris, כך חיתוך רוחב שלה מאפשר הלימוד של שריר שלד denervated המורכב של סיבים מהירים עווית סוג II ו / או סוג עווית איטי אניסיבים. כאן אנו מדגימים את מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי בעכבר C57Black6. אנו מעריכים את הניוון של שריר הגסטרוקנמיוס, כמו שריר מייצג, בבית 1, 2, ו 4 שבועות לאחר denervation על ידי מדידת משקולות שרירים ושטח חתך מסוים סיבי סוג ב-פרפין מוטבע סעיפים היסטולוגית immunostained לשרירן עווית מהיר.

Introduction

denervation שלד שריר, עקב פציעה טראומטית עצבים היקפיים, מחלה או התערבות פרמקולוגית, תוצאות באובדן המיידי של פונקצית התכווצות שרירים מרצון. שריר במקביל מתחיל להתנוון וניוון זה הוא הפיך אם עצבוב בזמן, באיכות טובה מתרחש ^1,2. בהיעדר העצבוב, ניוון myofiber מתקדם, ושינויים ביולוגיים בלתי הפיכים בשריר להתרחש עם סיסטיק שריר ומות myofiber. כאן אנו מדגימים את מודל השוקה עצב חיתוך רוחב, דגם של denervation-Induced ניוון שרירים השלד וסיסטיק, בעכברים. מודל זה מאפשר למדענים לחקור את המנגנונים הביולוגיים פיסיולוגיים, תאיים ומולקולריים העומדים בבסיס ניוון שרירים in vivo בשרירי הגסטרוקנמיוס וSoleus. תוך שימוש היסטורי בעיקר בחולדות, יישום חדש יותר של הדגם הזה לקווי עכבר מהונדסים במיוחד נוקאאוט ו, מאפשר לחוקרים להעריך את התפקיד שלהםחלבון מסוים (ים) של עניין באינדוקציה, פיתוח ותחזוקה, או לחלופין רזולוציה של, ניוון שרירים וסיסטיק in vivo.

העצב הטיביאלי הוא עצב מוטורי היקפי חושי מעורב בhindlimb המכרסם, והוא אחד משלושת הענפים הטרמינל של העצב השת. חיתוך רוחב של העצב הטיביאלי denervates את הגסטרוקנמיוס, soleus והשרירים plantaris (והשלושה השרירים המכופפים העמוקים הקטנים של כף הרגל, כולל tibialis האחורי, longus מכופף digitorum longus hallicus ומכופף), וגם הוא מודל סטנדרטי תוקף בחולדות ^3,4 . יכולים להיות גזורים שרירי הגסטרוקנמיוס וSoleus בקלות בנקודות זמן סדרתיים לפרסם חיתוך רוחב עצב הטיביאלי, קבוע ומעובד להערכת היסטולוגיה השריר ושריר הסיבים morphometrics, או הבזק הוקפא למיצוי של RNA וחלבונים שריר לצורך הלימודים, למשל, הרשתות הסלולריות האיתות מסדירות ניוון שרירים. Gaשריר strocnemius הוא שריר סוג סיבים מעורב (סוג I וסוג II, למרות שהסוג השני בעיקר) ושריר Soleus מורכב מחלק גדול של סיבים מסוג I, ובכך לספק גם עווית שריר מהיר ואיטי להערכה ^5,6. מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי מתאים ללימוד התהליך של denervation-Induced ניוון שרירים הן בטווח ארוך לטווח הקצר (ימים) ^ו7 (שבועות עד חודשים) ^4,8.

בניגוד למודל חיתוך רוחב העצב השת (מודל שני של denervation-Induced ניוון שרירים נפוצים במכרסמים), חיתוך רוחב עצב הטיביאלי גורם פחות תחלואה בבעלי החיים, מה שהופך אותה למודל אטרקטיבי יותר. חיתוך רוחב של העצב השת denervates כל שרירי הרגל (מתחת לברך) והרגל, פוגע ביכולתו של בעל החיים לambulate ^2, ואילו חיתוך רוחב של העצב הטיביאלי משאיר את ענפי עצב peroneal וsural של העצב השת ללא פגע, ובכך לשמר אתשרירי היעד שלהם וטריטוריות סנסוריים. העכבר אינו יכול להגמיש plantar או להפוך את הרגל, אבל הוא מסוגל ambulate בקלות ובמשקל נושא במידה שווה על שני הגפיים אחוריות, ובכך מצמצם את התחלואה של המודל באופן משמעותי. מחקרי ניתוח הליכה הערכת דפוסי הליכה בוצעו בחולדות בעקבות פציעות עצב הטיביאלי והשיתו ולהוכיח כי נושאת טביעת רגל ומשקל נשמרה טוב יותר עם ​​פציעת השוקה ^9,10. בנוסף, במודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי, ניתן לגייס את עצב peroneal בשלב מאוחר יותר והועבר כמקור עצבוב מתעכב, אם תכנון המחקר דורש ^3. לעומת זאת, עצבוב מתעכב במודל חיתוך רוחב העצב השת מחייב שימוש בשתל עצב לגירעון העצב השת, מאוד להגדיל באופן משמעותי את הקושי הטכני של הדגם ולהגביל את השימוש בו למנתחים מיומנים.

בעוד מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי Requires היכרות של המפעיל עם טכניקה ניתוחית סטרילי בניתוח בעלי חיים, גם העצב הטיביאלי ושרירי השוקיים זה innervates הנגיש בקלות והניתנת לזיהוי למניפולציה, כך שאנשים שאינם מנתחים, או בעל ניסיון רב בניתוח בעלי חיים, בקלות יכולים לשלוט מודל זה .

Protocol

לפני השימוש במודל זה, חוקרים כנראה קיבל אישור לפרוטוקול כירורגית מהשימוש בבעלי החיים של המוסד שלהם גוף מנהל. המודל אושר על ידי מועצת המנהלים מחקר האתיקה, המילטון בריאות חברה למדעים, אוניברסיטת מקמאסטר (AUP # 10-04-24) ומבוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות של המועצה הקנדית בטיפול בבעלי חיים.

1. הכנת עכבר

1. לשקול את העכבר. לגרום הרדמה עם 5% או 2% isoflurane halothane. המעגל משמש צריך להבטיח הדחה מספקת של חומר ההרדמה כדי להגן על המנתח. לאחר 2-3 דקות הנשימה של בעל החיים תהיה איטית. להבטיח את רפלקס המצמוץ חסר ולצבוט את חללי interdigital בכפה כדי לאשר הרדמה כירורגית (כלומר, אין תגובה על ידי העכבר). החל סיכה עיניים לעין, כדי למנוע התייבשות של הקרנית במהלך ניתוח.
2. שבי ירך לרוחב וישבן מהשתלחרוץ עד הברך ולחטא עם proviodine. גילוח ישמור את האתר של השיער ללא חתך על מנת להבטיח להדמיה נאותה של שדה הניתוח, וכדי למזער את ההפרעה לנתיחת עצב וחיתוך רוחב. חריץ sciatic, שהוא מעולה ואחורי לעצם הירך, ניתן לזהות על ידי מישוש.

2. הליך אופרטיבי

1. להפחית isoflurane איפה ל2% (halothane 1%) והנח את העכבר על הצד שלו (בצד המיועד לניתוח פונה כלפי מעלה), תחת מיקרוסקופ הפעלה או לנתח. לחלופין ניתוח יכול להתבצע עם loupes כירורגיות מאז הגדלה 3.5x היא משביעת רצון לעכבר בוגר (20-25 גרם).
2. לעטות כפפות סטריליות. זהה את שריר הירך על ידי מישוש. באמצעות אזמל, לחתוך את העור של הירך לרוחב מאת שריר הירך עד הברך (כ 1 ס"מ).
3. להפיץ את העור בעדינות. זהה את השרירים femoris שרירי, שהוא השריר השטחי השטוח לרוחב של הירךמייד מתחת לעור. בעזרת מספריים בסדר, לפצל את השרירים femoris שרירי לאורך סיבי השריר ולהחזיק פתוח עם מפשק אביב כדי לחשוף את העצב השת וענפיו.
4. לזהות את העצב השת עמוק באופן מיידי לשרירי femoris שרירי. ניתן לזהות אותו לפי הצבע הלבן הבוהק האופייני שלה והיא כ 0.8 מ"מ קוטר. היא פועלת מאת שריר הירך עד הברך, הסתעפות לתוך עצבי השוקה, peroneal וsural ברמה של פוסה popliteal.
5. בעדינות להפריד את השוקה מענפי עצב peroneal וsural עם מלקחיים ומספריים ultrafine microdissecting אביב. העצב הטיביאלי הוא הענף הגדול ביותר והוא בדרך כלל מרכזי. זה חשוב לא לרסק את העצב תוך הפרדה בין הענפים. מחזיק את העצב רק על השכבה החיצונית adventicial עם המלקחיים ultrafine, ושמירה על מרווח העצב (לא לימד), יימנע למחוץ עצב ופציעת מתיחה.
6. לשלם ומתמשך denervatiב, לחתוך עצב הטיביאלי עם microdissecting מספריים כdistally ככל האפשר, תוך הימנעות בזהירות את כלי popliteal. לחלופין, לdenervation הזמני עם עצבוב מלא צפוי ב2-4 שבועות, יכול להיות פשוט מחץ את העצב הטיביאלי עם מלקחיים ultrafine במשך 15 שניות במקום transected. (עצבים היקפיים לגדל מחדש פציעה הבאה ויהיה ReInnervate שריר היעד.)
7. אם נדרש denervation מלא, תפרת את הסוף של העצב הטיביאלי transected אל פני השטח הקדמי של שריר femoris שרירי עם 10-0 ניילון ומחדש משוער הרירים femoris עם 5-0 Vicryl למנוע מחדש עצבוב חריג של הגסטרוקנמיוס ו שרירי soleus.
8. סגור את העור עם תפר Vicryl ריצת 5-0.

3. הודעה טיפול אופרטיבי

1. כבה את חומר ההרדמה שהאיפה אך לשמור על הזרימה של חמצן. לנהל buprinorphine (או תחליף) כאבים מתחת לעור.
2. העבר את העכבר לכלוב נקי ללאמצעים בזמן מתעורר מהרדמה. שמור על שמיכת התחממות בתוך הכלוב ותחת השגחה ישירה עד ambulating.
3. העברה ובית בכלוב תחתון רך (לא חוט) עם מצעים רכים בשפע.
4. בדוק את האיבר האופרטיבי יומי למצבו של פצע הניתוח והרגל להתפתחות כיבים בעקב משכוב או ראיות של לעיסה. ניתן לנהל בעיות קטנות עם אנטיביוטיקה או חיטוי כגון proviodine אקטואליים. אינדיקטורים נקודות קצה הדורשות הרדמת בעל חיים הם ירידה במשקל, עדות לטיפול עצמי ירוד (פרווה פרועה), ויציבה כפופה. בנוסף, בעלי חיים עם הפרעה פצע גדולה או כיבים שאינם נרפא ב1-2 שבועות עם אנטיביוטיקה מקומית או מופיעים יש כאב יש להקריב.

4. הגסטרוקנמיוס Denervated וקציר שריר Soleus

1. בנקודת הזמן שלאחר הניתוח הרצויה, לשקול את העכבר והקרבה עם מנת יתר של CO _2.
2. לגלח את ההיבט המדיאלי של שניהםניתוח ובקרת רגליים נגדיות ונקי עם אלכוהול. מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה או לנתח, או לחלופין להשתמש loupes צפייה כירורגיות להגדלה.
3. על האיבר האופרטיבי, לחתוך את עור העגל המדיאלי עם אזמל מהקרסול עד הברך וcircumferentially סביב הקרסול. משוך בעדינות את העור עם מלקחיים מעל השריר וproximally לכיוון הירך. זה חושף את כל שרירי הרגל. זהה את שריר הגסטרוקנמיוס, שהוא שריר השוק שיוצא מהברך לקרסול בחלק האחורי של הרגל ונמצא מייד מתחת לפני העור. זהה את הכניסה הדיסטלי של השרירים femoris שרירי, הפרוקסימלי לשריר הגסטרוקנמיוס על ההיבט המדיאלי של הברך. בכניסת דיסטלי femoris שרירי מופיע דק ושקוף וoverlies החלק הפרוקסימלי ביותר של הגסטרוקנמיוס. בעזרת מספריים ונתיחת קצה קהה, בעדינות להפריד את הכניסה הדיסטלי של שריר הזרוע femoris מהגזשריר trocnemius.
4. בכניסתו לדיסטלי calcaneous, שריר הגסטרוקנמיוס נרות לגיד אכילס. זהה את גיד אכילס, המופיע לבן ושרירי. החזק את גיד אכילס עם מלקחיים, נזהר שלא להחזיק או למחוץ את שריר הגסטרוקנמיוס, ולחלק את גיד אכילס מהחדרת calcaneus באמצעות מספריים.
5. עדיין מחזיק את הגיד, בעדינות להרים את שריר הגסטרוקנמיוס (אדום חיוור) את Soleus העמוק (אדום עמוק), מההחדרה הדיסטלי לכיוון מקורו בברך (ניתן לקצור את Soleus בנפרד).
6. לנתח את הגסטרוקנמיוס את הרגל על ​​ידי חלוקת מקורם של הגסטרוקנמיוס מchondyles הירך המדיאלי ו לרוחב באמצעות מספריים. מתיחה מאוד עדינה על השריר מאפשרת את התהליך הזה. היזהר שלא למחוץ את השריר.
7. את Soleus עכשיו יהיה ברור לעין, באופן מיידי באתר של הגסטרוקנמיוס. הרם את Soleus מהכנסתו על גיד אכילס לה אוigin על העגל האחורי. אם Soleus עולה בטעות עם הגסטרוקנמיוס, בעדינות להפריד אותו מהדגימה שנקטפו. הגסטרוקנמיוס (אור האדום) וSoleus (אדום כהה) יישארו לזיהוי בקלות בדגימה שנקטפו בשל הבדלי הצבע שלהם.
8. לשקול את השרירים בנפרד בקנה מידת דיוק.
9. לפצל את השרירים בצורה אנכית, חצי הצמד להקפאה בחנקן נוזלי (לחלבון ו / או מיצוי RNA שלאחר מכן), וחצי ליסטולוגיה (הערכת morphometric כלומר, immunohistology) או בתיקון 10% פורמלין, או קיבעון קפוא בisopentane מקורר עם חנקן נוזלי , המועדפים.
10. חזור על צעד מ4.3 לעיל בשלט, המופעל באמצעות האו"ם, בצד למסוק הגסטרוקנמיוס בקרה ושרירים soleus.

תוצאות

חיתוך רוחב עצב הטיביאלי denervates את הגסטרוקנמיוס, soleus והשרירים plantaris של העגל. כאן אנו בוחנים את ההתפתחות של ניוון בשריר הגסטרוקנמיוס, כנציג שריר. שריר הגסטרוקנמיוס היה שנקטפו מן 2-3 חודשים 6 עכברים ישנים C57Black (ג'קסון מעבדות) denervated עבור 1, 2 או 4 שבועות. משקולות שרירים בה?...

Discussion

מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי של ניוון שרירים שלד מושרה denervation הוא מודל מועסק בדרך כלל ותוקף גם בחולדות. יש לנו להתאים את המודל הזה לשימוש בעכברים, המאפשר לחוקר לנצל את קיומם של עכברים מהונדסים גנטי וללמוד את התהליך של ניוון השרירים in vivo בהיעדר חלבונים חיוניים לר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02