Tibial Sinir transeksiyonu - Farelerde denervasyon bağlı İskelet Kas Atrofi için bir Standart Model

Özet

Tibial sinir kesisi modeli iskelet kas atrofi bir, iyi tolere doğrulanmış ve tekrarlanabilir bir model. Model cerrahi protokol C57Black6 farelerde açıklanan ve gösterilmiştir.

Özet

Tibial sinir kesisi modeli kemirgenlerde denervasyon bağlı iskelet kas atrofisi bir, iyi tolere doğrulanmış ve tekrarlanabilir bir model. Geliştirildiği ve daha büyük boyutu nedeniyle sıçan yaygın olarak kullanılmasına rağmen, farelerde tibial sinir siyatik sinirin peroneal ve sural sinir dalları sağlam ve böylece muhafaza bırakarak, kolayca ezmeyin veya kesisi ya ile manipüle edilebilir yeterince büyük hedef kasları. Bu nedenle, bu model siyatik sinir transeksiyonu modeli daha az morbidite ve ambulasyon engel uyaran avantajları sunuyor ve aynı zamanda araştırmacılar genetik olarak farelerde kas atrofi süreci düzenleyen, fizyolojik hücresel ve moleküler biyolojik mekanizmalar çalışma sağlar. Tibial sinir gastroknemius, soleus ve plantaris kasları sağlar, bu yüzden onun transection hızlı kasılan tip II lifleri ve / veya yavaş kasılan tip oluşan Denerve iskelet kası çalışma izin Ilifler. Burada C57Black6 fare tibial sinir transeksiyonu modeli göstermektedir. Biz parafine gömülü histolojik bölümlerde kas ağırlık ve lif tipi özel kesit alanı ölçerek 1, 2, bir temsilci kas olarak, gastroknemius kas atrofi değerlendirmek ve 4 hafta sonrası denervasyon hızlı kasılan miyozin için immunohistokimyasal.

Giriş

Travmatik periferik sinir yaralanma, hastalık veya farmakolojik müdahale nedeniyle İskelet kası denervasyon, kas gönüllü kasılma fonksiyonu hemen kaybına neden olur. Kas eş zamanlı atrofi başlar ve zamanında, kaliteli reinnervation ^1,2 oluşursa bu atrofi tersine çevrilebilir. Reinervasyon yokluğunda, myofiber atrofi ilerler ve geri dönüşü olmayan bir biyolojik kas değişiklikleri kas fibroz ve myofiber ölüm meydana gelir. Burada farelerde tibial sinir transection modeli, denervasyon-bağlı iskelet kas atrofisi ve fibrozis bir model, göstermektedir. Bu model gastroknemius ve soleus kaslarında in vivo kas atrofi altında yatan, fizyolojik hücresel ve moleküler biyolojik mekanizmaları incelemek için bilim adamları sağlar. Tarihsel sıçanlarda ağırlıklı olarak kullanılır iken, nakavt ve özellikle transgenik fare hatları, bu modelin daha yeni uygulama, araştırmacılar kendi rolünü değerlendirmenizi sağlarin vivo indüksiyon, geliştirme ve bakım veya alternatif çözümü, kas atrofi ve fibrozis ilgi özellikle protein (ler).

Tibial sinir kemirgen bacak bir karma motor duyusal periferik sinir ve siyatik sinirin üç terminali dallarından biridir. Tibial sinir kesisi gastroknemius, soleus ve plantaris kas (ve posterior tibial, fleksör digitorum longus ve fleksör hallicus longus dahil olmak üzere ayağın üç küçük derin fleksör kaslar) denervates ve sıçanlarda ^3,4 bir iyi standart ve onaylanmış model . Gastroknemius ve soleus kasları kolayca tibial sinir kesisi, sabit ve eğitim amacıyla kas RNA ve protein çıkarılması için dondurulmuş kas histoloji ve kas lifi morfometrik, veya flash değerlendirilmesi için işlenmiş, örneğin, sonrası seri zaman noktalarında disseke edilebilir kas atrofi düzenleyen hücresel sinyal ağları. Gastrocnemius kas karışık elyaf tipi kas (tip I ve tip II, tip II, ancak ağırlıklı olarak) ve soleus kasının ve böylece ^5,6 değerlendirilmesi için hızlı ve yavaş hem kasılan kas sağlayarak, tip I lifleri büyük bir kısmı oluşmaktadır. Tibial sinir kesisi modeli (ay hafta) kısa vadeli (gün) ⁷ ve uzun vadeli hem de ^4,8 de denervasyon bağlı kas atrofi süreci çalışmak için uygundur.

Siyatik sinir transeksiyonu modeli (genellikle kemirgenlerde kullanılan denervasyon bağlı kas atrofi bir ikinci model) aksine, tibial sinir kesisi bir daha çekici model yapımı, hayvan daha az morbidite neden olur. Tibial sinir kesisi siyatik sinirin peroneal ve sural sinir dalları olduğu gibi bırakır ise siyatik sinir kesisi böylece koruyarak, ² ambulasyon için hayvanın yeteneğini bozarak, bacak (diz altında) ve ayak tüm kasları denervateshedef kas ve duyusal toprakları. Fare plantar esnek yapamaz veya ayak invert, ancak kolayca ambulasyon yapabiliyor ve ağırlığı böylece önemli ölçüde modelin morbidite azalan, her iki arka ayakları üzerinde eşit taşımaktadır. Yürüyüş desen değerlendiren yürüme analizi çalışmaları tibial ve siyatik sinir yaralanmaları sonrasında sıçanlarda yapılan ve ayak izi ve yük daha tibia yaralanma ^9,10 ile korunmuş olduğunu göstermektedir. Edilmiştir Çalışma tasarımı ³ gerektiriyorsa, ek olarak, tibial sinir transection modelinde, peroneal sinir daha sonra bir noktada seferber edilebilir ve gecikmiş reinnervation kaynağı olarak aktarılır. Buna karşılık, siyatik sinir kesisi modelinde gecikmeli reinnervation çok önemli modelin teknik zorluk artan ve yetenekli cerrahlar onun kullanımını sınırlayan, siyatik sinir açığı bir sinir greft kullanılması gerekmektedir.

Ise tibial sinir transeksiyonu model rbu innervates tibial sinir ve baldır kasları hem hayvan cerrahi steril ameliyat tekniği ile operatörün aşinalık, equires cerrahlar değil, ya da çok hayvan cerrahi deneyimli kişiler, kolayca bu model ana böylece, manipülasyon için kolay erişilebilir ve tanımlanabilir .

Protokol

Bundan önce modelini kullanarak, araştırmacılar vücut yönetim kendi kurumun hayvan kullanımından cerrahi protokolü için onay almış olmalıdır. Model Araştırma Etik Kurulu, Hamilton Sağlık Bilimleri Kurumu, McMaster Üniversitesi (KKS # 10-04-24) tarafından onaylanmıştır ve Hayvan Bakım Kanada Konseyi önerileri ile tam uyum içinde gerçekleştirilir.

1. Fare Hazırlık

1. Fare tartılır. 5 izofluran% veya% 2 halotan ile anestezi neden. Cerrah korumak için yeterli bir anestezik atma kullanılan devre sağlamalıdır. 2-3 dakika sonra hayvanın solunum yavaş olacaktır. Göz kırpma refleksi yoktur emin olun ve cerrahi anestezi (fare ile cevap yani) onaylamak için pençe en arasi bosluklari çimdik. Ameliyat sırasında, korneanın kurumasını önlemek için, göz oftalmik yağ uygulanır.
2. Siyatik gelen lateral uyluk ve kalça tıraşdiz çentik ve proviodine ile dezenfekte edin. Tıraş cerrahi alanın yeterli görselleştirme sağlamak ve sinir diseksiyonu ve transection müdahale en aza indirmek için kesi saç site ücretsiz devam edecektir. Üstün ve femur posterior olan siyatik çentik, palpasyonla tespit edilebilir.

2. Operatif Prosedürü

1. 2% (halotan% 1) inhalasyon izofluran azaltın ve bir işletim ya da mikroskop altında yan (yukarı bakacak şekilde ameliyat için tasarlanmıştır tarafı), üzerinde fare yerleştirin. 3,5 kat büyütme, bir yetişkin için (20-25 g), fare için yeterli olduğu Alternatif olarak cerrahi cerrahi loupes ile yapılabilir.
2. Steril eldiven Don. Palpasyonla siyatik çentik belirleyin. Siyatik çentik gelen diz (yaklaşık 1 cm) için lateral uyluk bir neşter, insizyon deri kullanma.
3. Nazikçe cilt yayıldı. Biceps femoris kas belirlemek, hangi lateral uyluk düz yüzeysel kashemen derinin altında. Ince makas kullanarak, kas lifleri boyunca biceps femoris kas bölünmüş ve siyatik sinir ve dalları ortaya çıkarmak için bir yay retraktörü ile açık tutun.
4. Biceps femoris kas hemen derin siyatik sinir belirleyin. Bu karakteristik parlak beyaz renk ile tanımlanan ve çapı yaklaşık 0.8 mm olabilir. Bu popliteal fossa düzeyinde, tibial peroneal ve sural sinirler içine dallanma, siyatik çentik gelen diz çalışır.
5. Yavaşça ultra ince forseps ve yaylı Microdissecting makas ile peroneal ve sural sinir dallarından tibia ayırın. Tibial sinir en büyük dalıdır ve genellikle merkezi. Bu dalları ayıran sinir ezmek için değil önemlidir. Ultra ince forseps ile sadece dış adventicial katman üzerinde sinir Holding ve sinir gevşek (öğretti değil) tutarak, sinir ezilme ve çekiş yaralanmaları önlemek olacaktır.
6. Tam ve kalıcı bir denervati içinüzerinde, dikkatle popliteal damarlar kaçınarak, gibi distalde mümkün olduğunca makas Microdissecting ile tibial sinir kesti. Alternatif olarak, 2-4 hafta içinde beklenen tam reinnervation ile geçici denervasyon için, tibial sinir sadece kesilen 15 sn yerine için ultra ince forseps ile ezilebilir. (Periferik sinirler aşağıdaki yaralanma regrow ve hedef kas reinnervate olacaktır.)
7. Tam denervasyon gerekiyorsa, gastroknemius yeniden innervasyonu anormal önlemek için 5-0 Vicryl ile 10-0 Naylon ve yeniden yaklaşık biceps femoris ile biseps femoris kasının ön yüzeyine kesilen tibial sinir sonunda dikiş ve soleus kasları.
8. Bir çalışan 5-0 Vicryl dikiş ile cilt kapatın.

3. Operatif Bakım Mesaj

1. Inhalasyon anestezi kapatın ama oksijen akışını sağlamak. Subkutan analjezik buprinorphine (veya yerine) yönetmek.
2. Olmayan temiz bir kafes için fareyi transferyatak anestezi uyanma sırasında. Ambulasyon kadar kafes içinde ve doğrudan gözlem altında bir ısınma battaniye tutun.
3. Bol yumuşak yatak yumuşak alt kafeste transferi ve ev (değil tel).
4. Dekübit topuk ülser veya çiğneme kanıtı gelişimi için cerrahi yara ve ayak durumu için günlük ameliyat bacak kontrol edin. Ufak sorunlar topikal antibiyotik ya da proviodine gibi antiseptikler ile tedavi edilebilir. Hayvan ötenazi gerektiren Endpoint göstergeleri kilo kaybı, kendine bakım kanıtı (karıştırdı kürk), ve kambur duruş vardır. Buna ek olarak, büyük yara bozulma veya topikal antibiyotiklerle 1-2 hafta içinde iyileşmek ya da ağrı görünmüyor ülseri ile hayvanların kurban edilmelidir.

4. Denerve Gastrocnemius ve Soleus Kas Hasat

1. İstenilen sonrası ameliyat süresi noktada, CO ₂ doz aşımı ile fare ve kurban tartın.
2. Hem de medial Tıraşoperatif ve karşı kontrol bacakları ve alkol ile temiz. Bir işletim ya da mikroskop altında fare yerleştirin, ya da alternatif büyütme için cerrahi görüntüleme loupes kullanın.
3. Operatif bacak üzerinde, bir diz ayak bileği neşter ve çevresel olarak ayak bileği etrafında ile medial buzağı cilt insizyon. Yavaşça kas kapalı ve proksimal uyluk doğru forseps ile cilt çekin. Bu, bacak bölgesinin tüm kas ortaya koyar. Diz bacak arka yönü üzerinde ayak bileği için çalışır ve cilt altında hemen yatıyor baldır kas gastroknemius kas, tanımlayın. Diz medial yönü üzerinde gastroknemius kas proksimal biseps femoris kas distal ekleme, tanımlayın. Distal ekleme de biseps femoris ince ve şeffaf görünür ve gastroknemius en proksimal kısmını örter. Makas ve künt sonunda diseksiyon kullanarak, yavaşça gazdan biceps femoris distal ekleme ayırmaktrocnemius kas.
4. Calcaneous içine distal ekleme de, gastroknemius kas Aşil tendonu içine tapers. Beyaz ve zinde görünen Aşil tendonu, tanımlayın. Tutun veya gastroknemius kas ezmek için özen, forseps ile Aşil tendonu tutun ve makas kullanarak kalkaneus ekleme gelen Aşil tendonu bölün.
5. Hala tendon tutarak, yavaşça diz aslına doğru distal ekleme (soleus ayrı ayrı hasat edilebilir) gelen, derin soleus (derin kırmızı) kapalı gastroknemius kas (soluk kırmızı) kaldırın.
6. Makas kullanarak medial ve lateral femur chondyles gelen gastroknemius kökeni bölerek bacak kapalı gastrocnemius parçalara ayır. Kas çok nazik çekiş bu süreci kolaylaştırır. Kas ezmek için dikkatli olun.
7. Soleus şimdi hemen gastroknemius sitenin altında, açıkça görülebilir. Için Aşil tendonu üzerindeki ekleme gelen soleus kaldırın onun veyaarka buzağı üzerinde igin. Soleus yanlışlıkla gastroknemius ile kaldırılırsa, yavaşça hasat örnekten ayırmak. Gastrokinemius (açık kırmızı) ve soleus (koyu kırmızı), renk farklılıkları nedeniyle hasat örnekte kolayca tanımlanabilir kalır.
8. , Bir hassas terazi üzerinde ayrı ayrı kas tartılır.
9. (Sonraki protein ve / veya RNA ekstraksiyonu için) sıvı azot içinde ek dondurma için dikey yarım kaslar ayrıldı ve histoloji (yani morfolojik değerlendirmesi, immünohistoloji) için yarım izopentan içinde% 10 formalin ile, ya da dondurulmuş sabitleme ya da sabitleme sıvı azot ile soğutulmuş istendiği gibi.
10. Kontrolü gastroknemius ve soleus kasları hasat için kontrol yukarıdaki adım 4.3, un-çalışan, taraftan tekrarlayın.

Sonuçlar

Tibial sinir kesisi gastroknemius, soleus ve buzağı plantaris kasları denervates. Burada bir temsilci kas olarak, gastroknemius kas atrofi gelişimini değerlendirmek. Gastrokinemius kası, 1, 2 ya da 4 hafta boyunca denerve 2-3 aylık C57Black 6 fareleri (Jackson Laboratuarları) hasat edilmiştir. Kas ağırlıkları kademeli olarak zaman içinde tip II hızlı kasılan kas lifleri (Şekil 2), enine kesit alanı yapar (Şekil 1) azalır. Gastrokinemius karışık lif tipi kas...

Tartışmalar

Denervasyon bağlı iskelet kas atrofi tibial sinir kesisi modeli sıçanlarda yaygın olarak kullanılan ve iyi onaylanmış modelidir. Biz araştırmacı genetik farenin varlığını yararlanmak ve kas kütlesi ^7,8 düzenlenmesinde çok önemli proteinlerin yokluğunda in vivo olarak kas atrofisi süreci çalışma sağlar farenin olarak kullanımı Bu modeli adapte edilmiştir. Gastroknemius ve soleus kas, bu modelde denerve hem de böylece daha sonraki moleküler analiz için mükemmel kalitede ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02