胫骨神经切断术 - 一个标准化的模型失神经诱导小鼠骨骼肌

摘要

胫神经横断模型骨骼肌萎缩是一种耐受性良好，验证和可重复的模型。中描述和演示C57Black6小鼠模型手术协议。

摘要

胫神经横断模型在啮齿类动物中去神经引起的骨骼肌萎缩是一种耐受性良好，验证和可重复的模型。虽然最初的开发中广泛使用，由于其较大规模的大鼠，小鼠的胫神经，留下完好的坐骨神经腓神经和腓肠神经分支，从而保持足够大，它可以很容易被操纵，无论是挤压或横断他们的目标肌肉。因此，这种模式提供的优势诱导坐骨神经横断模型少的发病率和障碍比下地，还允许调查研究生理，细胞和分子生物学机制的调节肌肉萎缩的过程中，在遗传工程小鼠。胫神经建筑材料的腓肠肌，比目鱼肌和跖肌，所以它的横断允许失神经骨骼肌快肌II型纤维和/或慢肌型组成的研究，我纤维。在这里，我们展示了胫神经横断模型在C57Black6鼠标。我们评估腓肠肌的萎缩，作为一个有代表性的肌肉，在1，2，和4周后去神经通过测量肌肉重量和纤维类型特定的横截面面积，对石蜡包埋的组织切片进行免疫染色快肌的肌球蛋白。

引言

骨骼肌失神经支配，由于外伤性周围神经损伤，疾病或药物干预，肌肉自愿收缩功能在眼前亏的结果。伴随肌肉开始萎缩，这种萎缩是可逆的，如果及时，优质的神经支配发生^1,2。在没有神经支配，肌纤维萎缩的进展，在肌肉与发生不可逆的生物变化肌肉纤维化及肌纤维死亡。在这里，我们展示了胫神经横断模型，模型引起的失神经支配骨骼肌萎缩和纤维化，在小鼠体内。这种模式使科学家研究背后体内肌肉萎缩，腓肠肌和比目鱼肌的生理，细胞和分子生物学机制。虽然历史上主要用于大鼠，更近的应用，让这个模型，基因敲除和转基因小鼠系专门调查，以评估它们的作用特定的蛋白质（S）的感应，开发和维护，或者决议，肌肉萎缩及纤维化体内的兴趣。

胫神经是一个混合的运动感觉的啮齿类动物的后肢，外周神经和是三个终端坐骨神经分支之一。胫神经横断denervates腓肠肌，比目鱼肌和跖肌（三个小深屈肌的脚，包括胫骨后肌，趾长屈肌和屈hallicus的长肌），是一个标准化和验证模型大鼠^3,4 。序列的时间点，可以很容易地解剖腓肠肌和比目鱼肌交的胫骨神经切断术，评估肌肉组织学和肌纤维形态测量或闪存冻结肌肉RNA和蛋白质的，目的是研究提取固定和处理，例如，调节肌肉萎缩的细胞信号网络。遗传算法strocnemius肌肉的混合纤维型肌（I型和II型，虽然主要是II型）和比目鱼肌I型纤维组成的相当大的比例，从而提供了快速和慢速肌^5,6评估。胫神经横断模型适用于研究失神经性肌肉萎缩的过程中，短期（日^）7和长期（周月^）4,8。

在坐骨神经横断模型（失神经性肌肉萎缩的第二个模型常用于啮齿动物），胫骨神经切断术诱导少在动物发病率，使其成为一个更具吸引力的模型。坐骨神经横断denervates腿部（膝盖以下）和脚的肌肉，损害动物的走动能力^2，而胫神经横断离开坐骨神经腓神经和腓肠神经分支不变，从而保持他们的目标肌肉和感官领土的。鼠标是无法跖屈或脚倒置，但能够轻易走动，体重承担同样的两后肢，从而大大减少发病率的模型。步态分析研究，评估步行模式已在胫骨和坐骨神经损伤的大鼠进行胫骨受伤^9,10证明足迹和负重保存较好。此外，在胫骨神经横断模型，腓总神经可以在稍后的时间点被动员，迟发神经再生和转移作为源的研究设计，如果需要^3。相比之下，延迟神经再生坐骨神经横断模型需要使用的神经移植到坐骨神经赤字，模型的技术难度非常显着增加，并限制其使用，熟练的外科医生。

虽然胫神经横断模型Requires熟悉无菌手术技术在动物手术操作，无论是胫神经和支配小腿肌肉很容易访问和操纵识别，从而使个人谁是不是外科医生，或具有丰富的经验与动物外科手术，可以很容易地掌握这个模型。

研究方案

使用这个模型之前，研究者必须接受手术动物从他们的机构的理事机构使用协议的批准。该模型是研究伦理委员会，汉密尔顿健康科学公司，麦克马斯特大学（AUP＃10-04-24）批准，并严格按照加拿大动物保护协会的建议进行。

1。鼠标准备

1. 称量鼠标。异氟醚或5％，2％氟烷麻醉。应确保有足够的麻醉清除保护外科医生使用的电路。 2-3分钟后，动物的呼吸会减缓。确保眨眼反射消失，并在爪子捏叉空间，以确认手术麻醉（ 即通过鼠标无响应）。眼科润滑剂应用的眼球，在手术过程中防止角膜干燥。
2. 剃须大腿外侧和臀部坐骨神经缺口膝盖和消毒proviodine。剃须将免费保持切口的头发的部位，以确保有足够的可视化手术野，以尽量减少干扰与神经剥离和横断。可以被识别，这是优越，后方股骨，坐骨切迹通过触诊。

2。手术过程

1. 减少吸入异氟醚2％（1％氟烷），将鼠标放在其侧面（侧用于手术朝上），经营或解剖显微镜下。另外可以进行手术治疗与手术放大镜为成人（20-25克）鼠标自3.5X放大倍率是令人满意的。
2. 戴上无菌手套。通过触诊识别坐骨切迹。使用手术刀，切割皮肤从坐骨切迹大腿外侧膝（约1厘米）。
3. 轻轻涂抹皮肤。识别股二头肌，这是平坦的表面肌肉大腿外侧紧接下方的皮肤。用细剪刀，拆股二头肌沿着肌纤维，并举行公开的弹簧拉钩暴露坐骨神经及其分支。
4. 确定坐骨神经紧接深至股二头肌。都可以识别通过其特性有光泽的白色，直径约0.8毫米。它运行从坐骨切迹到膝盖，分支到胫骨，腓骨和腓肠神经的胭窝上面的水平。
5. 轻轻分开胫，腓神经和腓肠神经分支与超细钳和弹簧microdissecting的剪刀。胫神经是最大的分支，通常是中央的。重要的是不要的神经，而分离的树枝粉碎。控股超细镊子外adventicial层的神经，使神经松弛（不教），将避免神经损伤和牵拉损伤。
6. 完整和持久denervati的，切开胫骨神经尽量远侧microdissecting剪刀，小心地避免腘血管。另外，对于暂时​​神经预期在2-4周内完整的神经再支配，可以简单地被粉碎的胫骨神经与超细钳为15秒，而不是横断。 （周围神经损伤后再生将reinnervate目标肌肉。）
7. 是必需的，如果完全去神经的横断胫神经缝合结束股二头肌的前表面用5-0薇乔以10-0尼龙和重近似股二头肌，以防止异常神经支配腓肠肌和比目鱼肌。
8. 关闭与正在运行的5-0薇乔缝合皮肤。

3。术后护理

1. 关闭吸入麻醉剂，但维持氧气流量。管理buprinorphine（或代替）镇痛皮下注射。
2. 没有鼠标转移到一个干净的笼从麻醉中醒来时，床上用品。请毯上一个笼子内，直接观察下，直到走动。
3. 软底笼（线）的转让及房屋充足的软床上用品。
4. 在每天检查执行肢体状况的发展褥疮的鞋跟溃疡或咀嚼的证据的外科伤以及脚。如proviodine外用抗生素或防腐剂，可管理的小问题。规定动物安乐死的终点指标是减肥，恶劣的自我护理的证据（竖起毛皮），弯腰驼背的姿势。此外，主要伤口的干扰或溃疡不愈合在1-2周内局部抗生素或出现有疼痛的动物应该被牺牲掉。

4。失神经支配腓肠肌和比目鱼肌收获

1. 在手术后所需的时间点，权衡与CO ₂过量的鼠标和牺牲。
2. 剃须双方的内侧方面手术和对侧控制的腿和用酒精清洁。将鼠标操作或解剖显微镜下，或者使用手术观赏放大镜放大。
3. 手术肢体的小腿内侧皮肤切开，用解剖刀从脚踝到膝关节和踝关节周围的圆周上。轻轻拉扯皮肤，肌肉和大腿近端向钳断。这暴露了所有的腿部肌肉。确定，这是从膝盖后方的腿的脚踝上，紧靠下面的皮肤的小腿肌肉的腓肠肌。识别远端插入股二头肌，腓肠肌近端上的内侧面的膝盖。股二头肌出现在其远端插入薄薄膜和覆盖在腓肠肌的最基端部。使用剪刀钝端剥离，轻轻地从气体中分离的远端插入股二头肌肌肉trocnemius。
4. 在其远端插入到跟骨，腓肠肌逐渐变细到跟腱。确定白色和强壮有力的跟腱，这似乎。保持用钳子跟腱，照顾不持有或粉碎腓肠肌，把跟腱跟骨插入用剪刀。
5. 仍持有肌腱，轻轻抬起腓肠肌（淡红色）关闭深比目鱼（更深的红色），从远端插入朝着它的起源在膝盖（比目鱼可以收获另发）。
6. 解剖腓肠肌关闭腿，除以用剪刀从内侧和外侧的股骨chondyles的起源腓肠肌。很温柔的对肌肉的牵引促进这一进程。小心不要压碎肌肉。
7. 比目鱼现在清晰可见，立刻根据网站的腓肠肌。电梯比目鱼其插入跟腱或其小腿后部igin。如果不经意间提出的腓肠肌，比目鱼轻轻分开，从收获的标本。 （淡红色）腓肠肌和比目鱼（暗红色）在收获的标本由于其颜色差异仍然很容易识别。
8. 精密的规模分别称量肌肉。
9. 垂直拆分肌肉，半金鱼草冷冻在液氮中（随后的蛋白质和/或RNA的提取），组织学（ 即形态学评估，免疫组化）的一半固定在10％福尔马林或异戊烷中冷冻固定用液氮冷却，然后随意。
10. 重复上述步骤4.3上的控制，取消操作，一边收获控制腓肠肌和比目鱼肌。

结果

胫神经的横断denervates的小腿腓肠肌，比目鱼肌和跖肌。在这里，我们评估腓肠肌萎缩的发展，作为一个代表性的肌肉。从2-3个月大的程琳，程雪，闵连秋，中国保健CHINESE HEALTH CARE 2007年第12期C57black 6小鼠（杰克逊实验室），1，2，或4周神经腓肠肌收获。肌肉的重量逐渐减小（ 图1），II型快肌纤维（ 图2），随着时间的推移的横截面的面积。腓肠肌是混纤型肌（I型和I...

讨论

去神经引起的骨骼肌萎缩胫神经横断模型大鼠模型是一种常用的和很好的验证。我们已经适应了这个模型在小鼠中的使用，这使得研究者利用遗传工程小鼠的存在，并在体内研究的过程中，肌肉萎缩，肌肉质量^7,8的调节至关重要的蛋白质在没有。腓肠肌和比目鱼肌，神经在这个模型中，能够容易且迅速，解剖以最小的处理能力，从而提供优良的品质mRNA和蛋白用于后续的分子分析。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02