Secção do nervo tibial - um modelo padronizado para denervação induzida por atrofia muscular em ratos

Resumo

O modelo de corte transversal do nervo tibial é um modelo bem-tolerado, validado, e reprodutível de atrofia do músculo esquelético. O protocolo cirúrgico modelo é descrito e demonstrado em ratinhos C57Black6.

Resumo

O modelo de corte transversal do nervo tibial é um modelo bem-tolerado, validado, e reprodutível de atrofia do músculo esquelético desnervação induzida em roedores. Embora originalmente desenvolvido e amplamente utilizado no rato, devido ao seu grande tamanho, o nervo tibial em ratinhos é grande o suficiente para que ele possa ser facilmente manipulada com qualquer esmagamento ou corte transversal, deixando os ramos do nervo sural e fibular do nervo ciático intacta e preservando assim seus músculos alvo. Assim, este modelo oferece as vantagens de induzir menor morbidade e impedimento de locomoção do que o modelo de secção do nervo ciático e também permite aos investigadores estudar os mecanismos biológicos fisiológicos, celulares e moleculares que regulam o processo de atrofia muscular em camundongos geneticamente modificados. O nervo tibial fornece os gastrocnêmio, sóleo e plantar, por isso seu corte transversal permite o estudo do músculo esquelético desnervado composto de fibras de contração rápida do tipo II e / ou tipo de contração lenta Ifibras. Aqui demonstramos o modelo de secção do nervo tibial no C57Black6 mouse. Avaliamos a atrofia do músculo gastrocnêmio, como um músculo representante, em 1, 2 e 4 semanas de pós-denervação medindo pesos musculares e tipo de fibra área transversal específica em parafina cortes histológicos histoquímica para miosina de contração rápida.

Introdução

Desnervação do músculo esquelético, devido a uma lesão traumática do nervo periférico, doença ou intervenção farmacológica, resulta na perda imediata da função contrátil do músculo voluntário. Muscle concomitantemente começa a atrofiar e esta atrofia é reversível se oportuna, reinervação de boa qualidade ocorre ^1,2. Na ausência de Reinervação, myofiber atrofia progride, e alterações biológicas irreversíveis no músculo ocorrer com fibrose muscular e da morte de células musculares. Aqui demonstramos o modelo transecção do nervo tibial, um modelo de atrofia induzida por desinervação do músculo esquelético e da fibrose, em ratinhos. Este modelo permite aos cientistas estudar os mecanismos biológicos fisiológicos, celulares e moleculares subjacentes atrofia muscular in vivo nos músculos gastrocnêmio e sóleo. Enquanto historicamente utilizados predominantemente em ratos, uma aplicação mais recente deste modelo KO e linhas de ratinhos transgénicos especificamente, permite aos investigadores para avaliar o papel da suaproteína específica (s) de interesse na indução, desenvolvimento e manutenção, ou em alternativa, a resolução de, atrofia muscular e fibrose in vivo.

O nervo tibial é um nervo periférico sensório-motora mista no membro posterior do roedor, e é um dos três ramos terminais do nervo ciático. Transecção do nervo tibial denervates o gastrocnêmio, sóleo e plantar (e os três músculos flexores profundos pequenos do pé incluindo tibial posterior, flexor longo dos dedos e flexor hallicus longus), e é um modelo bem padronizados e validados em ratos ^3,4 . Os músculos gastrocnêmio e sóleo pode ser facilmente dissecados em momentos de série postar secção do nervo tibial, fixados e processados ​​para avaliação da histologia muscular e morfometria das fibras musculares, ou flash congelado para a extração de RNA e proteínas musculares para a finalidade de estudar, por exemplo, as redes de sinalização celular que regulam a atrofia muscular. O gastrocnemius muscular é um tipo de fibra muscular mista (tipo I e tipo II, embora seja predominantemente do tipo II) e do músculo sóleo é composta por uma grande proporção de fibras do tipo I, proporcionando deste modo tanto rápido e lento contração muscular para avaliação ^5,6. O modelo de corte transversal do nervo tibial é adequado para o estudo do processo de atrofia induzida por desnervação muscular quer a curto prazo (dias) ⁷ e de longo prazo (semanas a meses) ^4,8.

Em contraste com o modelo de corte transversal do nervo ciático (um segundo modelo de atrofia induzida por desinervação do músculo utilizada em roedores), transecção do nervo tibial induz menor morbidade no animal, tornando-a um modelo mais atraente. A transecção do nervo ciático denervates todos os músculos da perna (abaixo do joelho) e no pé, prejudicar a capacidade do animal para deambulação ^2, enquanto que a transecção do nervo tibial folhas dos ramos do nervo sural e fibular do nervo ciático intacta, preservando assimseus músculos alvo e territórios sensoriais. O mouse é incapaz de flexão plantar ou inverter a pé, mas é capaz de deambular facilmente eo peso tem igualmente em ambos os membros posteriores, assim diminuindo significativamente a morbidade do modelo. Estudos de análise de marcha avaliando padrões de caminhada foram realizados em ratos após lesão do nervo ciático e tibial e demonstrar que a pegada eo peso do rolamento é melhor preservada com lesão tibial ^9,10. Além disso, no modelo de corte transversal do nervo tibial, o nervo peroneal pode ser mobilizada num ponto de tempo posterior e transferido como uma fonte de Reinervação retardada, se o desenho do estudo requer ^3. Em contraste, Reinervação retardada no modelo de corte transversal do nervo ciático que requer a utilização de um enxerto de nervo ao défice do nervo ciático, o aumento muito significativamente a dificuldade técnica do modelo e limitando a sua utilização para os cirurgiões especializados.

Enquanto o modelo de secção do nervo tibial requires familiaridade do operador com técnica cirúrgica estéril em cirurgia animal, tanto o nervo tibial e que inerva os músculos da panturrilha são facilmente acessíveis e identificáveis ​​para a manipulação, de modo que os indivíduos que não são cirurgiões, ou altamente experiente com a cirurgia animal, podem facilmente dominar este modelo .

Protocolo

Antes de usar este modelo, os investigadores devem ter recebido aprovação para o protocolo cirúrgico de uso de animais de sua instituição de órgão. O modelo é aprovado pelo Conselho de Ética de Pesquisa, Hamilton Health Sciences Corporation, da Universidade McMaster (AUP # 10-04-24) e é realizado em estrita conformidade com as recomendações do Canadian Council on Animal Care.

1. Rato Preparação

1. Pesar o mouse. Induzir a anestesia com isoflurano 5% ou 2% de halotano. O circuito utilizado deve assegurar a eliminação adequada do anestésico para proteger o cirurgião. Após 2-3 min respiração do animal vai abrandar. Verifique se o piscar reflexo está ausente e prender os espaços interdigitais na pata para confirmar a anestesia cirúrgica (ou seja, sem resposta do mouse). Aplicar lubrificante oftálmica para o olho, para evitar a secagem da córnea, durante a cirurgia.
2. Raspar a lateral da coxa e nádega do ciáticoponto para o joelho e desinfectar com proviodine. Barbear vai manter o local do cabelo incisão livre para garantir a adequada visualização do campo cirúrgico e minimizar a interferência com dissecção do nervo e transecção. O entalhe ciático, que é superior e posterior do fêmur, pode ser identificado por palpação.

2. Procedimento operatório

1. Reduzir inalatória isoflurano a 2% (1% de halotano) e colocar o rato sobre o seu lado (destinado a cirurgia virada para cima), sob um microscópio de operação ou dissecação. Alternativamente, a cirurgia pode ser executada com lupas cirúrgicas desde ampliação 3.5X é satisfatória para um adulto (20-25 g) do rato.
2. Vestir luvas estéreis. Identificar o entalhe ciático por palpação. Utilizando um bisturi, inciso na pele da coxa lateral da incisura ciática para o joelho (aproximadamente 1 cm).
3. Delicadamente espalhar a pele. Identificar o músculo bíceps femoris, o qual é o músculo superficial plana da face lateral da coxaimediatamente por baixo da pele. Usando uma tesoura fina, dividir o músculo bíceps femoral ao longo das fibras musculares e mantenha aberto com um afastador de primavera para expor o nervo ciático e seus ramos.
4. Identificar o nervo ciático imediatamente profundo ao músculo bíceps femoral. Ele pode ser identificado pela sua cor branca brilhante característica e é aproximadamente 0,8 mm de diâmetro. Ele roda a partir do entalhe ciático até o joelho, ramificando-se nos nervos tibial, fibular e sural ao nível da fossa poplítea.
5. Delicadamente separar o tibial dos ramos do nervo fibular e sural com uma pinça ultrafinas e primavera tesouras microdissecting. O nervo tibial é o maior ramo e é geralmente central. É importante para não esmagar o nervo enquanto separando os ramos. Segurando o nervo apenas na camada adventicial exterior com a pinça ultrafinas, e mantendo a folga nervo (não ensinado), vai evitar esmagamento do nervo e lesão de tração.
6. Para completa e duradoura denervatiem, cortar o nervo tibial com microdissecting tesoura como distal possível, evitando cuidadosamente os vasos poplíteos. Alternativamente, para a desnervação temporária com Reinervação completa esperado em 2-4 semanas, o nervo tibial podem ser simplesmente esmagados com uma pinça ultrafinas de 15 seg, em vez de seccionado. (Nervos periféricos regredir após lesão e reinervar músculo alvo.)
7. Se desnervação completo é necessária, a sutura da extremidade do nervo tibial seccionado na superfície anterior do músculo bíceps femoris com nylon 10-0 e re-aproximar a bíceps femoris com 5-0 Vicryl aberrante para evitar a re-inervação dos gastrocnémio e sóleo.
8. Feche a pele com uma corrida de sutura Vicryl 5-0.

3. Cuidados pós-operatória

1. Desligue o anestésico inalatório, mas manter o fluxo de oxigênio. Administrar buprinorphine (ou substituto) analgésico por via subcutânea.
2. Transferir o mouse para a gaiola limpa, semcama ao acordar da anestesia. Mantenha em um cobertor aquecimento dentro da gaiola e sob observação direta até deambulação.
3. Transferência e casa na gaiola inferior macia (não condutores) com ampla cama macia.
4. Inspecione a parte operativa diária para a condição da ferida cirúrgica e do pé para o desenvolvimento de úlceras de decúbito ou provas de salto de mastigar. Pequenos problemas podem ser tratados com antibióticos ou anti-sépticos como proviodine. Indicadores de terminais que requerem a eutanásia de animais são perda de peso, a evidência de auto-cuidado pobres (pele enrugada) e postura arqueada. Além disso, animais com grande ruptura feridas ou úlceras que não cicatrizam em 1-2 semanas com antibióticos tópicos ou parecem ter dor deve ser sacrificado.

4. Gastrocnêmio desnervado Colheita músculo sóleo

1. No ponto em tempo de pós-operatório desejado, pesar o mouse e sacrifício com _dois overdose CO.
2. Raspar o aspecto medial de ambos osoperatório e pernas controle contralateral e limpo com álcool. Posicione o mouse sob um microscópio cirúrgico ou de dissecação, ou, alternativamente, utilizar lupas visualização cirúrgicos para ampliação.
3. No membro operativo, incisar a pele de vitelo medial com um bisturi a partir do tornozelo ao joelho e perifericamente em torno do tornozelo. Puxe delicadamente a pele com uma pinça fora do músculo e proximal em direção à coxa. Isto expõe todos os músculos da perna. Identificar o músculo gastrocnémio, a qual é o músculo bezerro que se estende desde o joelho para o tornozelo na parte posterior da perna e encontra-se imediatamente abaixo da pele. Identificar a inserção distal do bíceps femoral proximal do músculo gastrocnêmio sobre o aspecto medial do joelho. Na sua inserção distal do bíceps femoral parece fina e transparente e recobre a porção mais proximal do gastrocnêmio. Usando uma tesoura e dissecção fim brusco, separe delicadamente a inserção distal do bíceps femoral a partir do gásmúsculo gastrocnêmio.
4. Na sua inserção distal no calcâneo, o músculo gastrocnêmio afunila no tendão de Aquiles. Identificar o tendão de Aquiles, que aparece em branco e musculoso. Segure o tendão de Aquiles com uma pinça, tomando cuidado para não prender ou esmagar o músculo gastrocnêmio, e dividir o tendão de Aquiles da inserção do calcâneo com uma tesoura.
5. Ainda segurando o tendão, levante suavemente o músculo gastrocnêmio (vermelho pálido) fora o sóleo profundas (mais fundo vermelho), a partir da inserção distal em direção a sua origem na altura do joelho (o sóleo pode ser colhida separadamente).
6. Dissecar as gastrocnémio fora da perna dividindo a origem do gastrocnémio dos chondyles medial e lateral do fémur, utilizando uma tesoura. Tração muito suave no músculo facilita esse processo. Tenha cuidado para não esmagar o músculo.
7. Os sóleo será agora claramente visível, imediatamente abaixo do local do gastrocnêmio. Levante o sóleo de sua inserção no tendão de Aquiles para a sua ouigin na panturrilha posterior. Se o sóleo é, inadvertidamente, levantado com o gastrocnêmio, separe-o suavemente a amostra colhida. O gastrocnêmio (luz vermelha) e sóleo (vermelho escuro) permanecem facilmente identificáveis ​​na amostra colhida, devido às suas diferenças de cor.
8. Pesar os músculos separadamente em uma balança de precisão.
9. Dividir os músculos na vertical, para o congelamento de metade pressão em azoto líquido (por proteína posterior e / ou de extracção de ARN), e metade para a histologia (isto é, a avaliação morfométrica, imunohistologia) fixar ou em formalina a 10%, ou fixação congelados em isopentano arrefecido com azoto líquido , conforme o desejado.
10. Repita a partir do passo 4.3 acima no controle, não-operado, lado a colheita de controle gastrocnêmio e sóleo.

Resultados

Secção do nervo tibial denervates o gastrocnêmio, sóleo e plantar do bezerro. Aqui nós avaliar o desenvolvimento de atrofia do músculo gastrocnémio, como um representante do músculo. Músculo do gastrocnémio foi colhido 2-3 meses de idade C57Black seis ratinhos (Jackson Laboratories) desnervados por 1, 2 ou 4 semanas. Pesos do músculo diminuir progressivamente (Figura 1), assim como a área de secção transversal de fibras do tipo II rápidas contração muscular (Figura 2),

Discussão

O modelo de corte transversal do nervo tibial induzida por desnervação atrofia do músculo esquelético é um modelo vulgarmente utilizados e bem validado em ratos. Temos este modelo adaptado para utilização em ratinhos, o que permite ao investigador para tirar vantagem da existência de ratos geneticamente modificados e estudar o processo de atrofia muscular in vivo na ausência de proteínas essenciais para a regulação da massa muscular ^7,8. Os músculos gastrocnemius e sóleo, ambos desnerva...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
			Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02