واحدة ذبابة الفحص لسلوك البحث عن الطعام في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Summary

في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف مقايسة الآلي لقياس تأثير الجوع أو الشبع على حاسة الشم التي تعتمد سلوك البحث الغذائية في الفاكهة الكبار يطير ذبابة الفاكهة السوداء البطن.

Abstract

لكثير من الحيوانات والجوع يعزز التغييرات في نظام حاسة الشم بطريقة تسهل البحث عن مصادر الغذاء المناسب. في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف مقايسة الآلي لقياس تأثير الجوع أو الشبع على حاسة الشم التي تعتمد سلوك البحث الغذائية في الفاكهة الكبار يطير ذبابة الفاكهة السوداء البطن. في ضوء مربع محكم تنيره الضوء الأحمر التي هي غير مرئية للذباب الفاكهة، وكاميرا مرتبطة برنامج الحصول على بيانات مخصصة تراقب الموقف من ستة الذباب في وقت واحد. ويقتصر كل ذبابة على السير في الساحات الفردية التي تحتوي على رائحة الطعام في المركز. والساحات اختبار ترتكز على أرضية مسامية الذي يعمل على منع تراكم الرائحة. يتم تحديد زمن الوصول لتحديد مصدر الرائحة، والذي يعكس حساسية متري حاسة الشم تحت الدول الفسيولوجية المختلفة، من خلال تحليل البرمجيات. هنا، ونحن نناقش اليات حرجة من تشغيل هذا النموذج السلوكي وتغطية قضايا محددة تتعلق ذبابة loadiنانوغرام، وتلوث الرائحة ودرجة الحرارة الفحص، جودة البيانات، والتحليل الإحصائي.

Introduction

الدول الجوع تعزيز نوعين من السلوكيات مشهي: البحث الغذائية والاستهلاك الغذائي ^1. هذا الاختبار السلوكية البسيطة هي مفيدة لدراسة السلوكيات المرتبطة الكيميائي تستخدم علفا ^2،3. على وجه التحديد، فإنه يتابع الموقف الطاير، سرعة المشي والكمون لتحديد موقع الهدف رائحة الطعام. الكمون لتقصي الغذاء بمثابة متري لقياس التغيرات في حساسية من رائحة نظام الكشف عن الذبابة المصب من التغيرات في حالته مشهي الداخلية. وهناك نسخة من دليل هذا الاختبار كان يستخدم في السابق ليبرهن GABA-B مستقبلات الإشارات المهم للسلوك رائحة التوطين في الذباب الكبار ^3. وكان الإصدار الآلي الحالية للمقايسة دور فعال في دراسة كيفية قصيرة نيوروبيبتيدي-F (SNPF) إشارات تعيد تشكيل خريطة حاسة الشم في ذبابة الفاكهة والتأثيرات مشهي السلوكيات ^2.

ويتم اختبار في ودرجة الحرارة والرطوبة غرفة مظلمة تسيطر عليها. رقميكاميرات الفيديو المبينة أعلاه واضحة لوحات اختبار الاكريليك تتبع الذباب الخلفية بواسطة 660 نانومتر إضاءة LED. تتم معالجة المعلومات من الكاميرا في الوقت الحقيقي من خلال جهاز كمبيوتر المتمركزة بالقرب من منطقة الاختبار. ونحن نستخدم برنامج الحصول على بيانات لتسجيل وحفظ إحداثيات المواقع ذبابة خلال فترة الاختبار.

في هذا النموذج، يتم تحرير هذا الموضوع إلى الساحة التي تحتوي على رائحة الطعام في المركز؛ الكائن رائحة يخلق رائحة الطعام التدرج داخل الساحة الذي يسبب السلوك الغذائي في البحث الطاير. وقد تم تطبيق رائحة مماثلة نحو بروتوكول البحث دراسة chemosensation في واحد يرقات ذبابة الفاكهة ^7. بينما المقايسات السلوكية الأخرى مثل olfactometer ^4،5 أربعة الميداني أو تي متاهة ⁶ تقييم رائحة النفور أو الجاذبية السلوكيات، هو الانسب هذا النموذج لتقييم حساسية والكيميائي السلوكيات حاسة الشم.

العديد من المزايا الرئيسية تصاحب هذه أساذ. الأولى، فإنه يسمح سرعة اقتناء مجموعات كبيرة من البيانات، لجمع البيانات وتحليلها في الغالب الآلي. الثانية، وهذا الاختبار يقيس يعزل سلوك الذباب واحد، وبالتالي القضاء على العظة حاسة الشم الاجتماعية التي قد تؤثر على تصرفاتهم. الثالث، وبساطة من البروتوكول والتصميم التجريبي بسيطة تجعل الفحص فعالة وسهلة لتعليم الآخرين.

بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لتحقيق مزيد من الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوك البحث الغذائية، عن طريق الجمع بين ذلك مع أدوات الوراثية الواسعة المتاحة لذبابة الفاكهة السوداء البطن ^8. التعبير المستهدفة من الجينات المحورة أن الصمت أو تثير الخلايا العصبية يمكن أن يتحقق مع أدوات مثل نظام GAL4-UAS فضلا عن ^TS1 UAS-shibire، UAS والكزاز والسم، وUAS-TrpA1 (B) الجينات المحورة ^9-12.

Protocol

1. ذبابة جمع والمجاعة

1. الخلفية الذباب التجريبية تحت ظروف الحرارة والرطوبة (على سبيل المثال 21 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 50-60٪) التي تسيطر على ضوء لمدة 12 ساعة / دورة الظلام.
2. جمع الذباب الإناث في يوم eclosion ووضعها، جنبا إلى جنب مع الذكور 4-5، في قارورة غذائية جديدة (الحد الأقصى 30 في قارورة). عمر الذباب 2-5 أيام.
3. إعداد غرف لذبابة المجاعة.
   1. دفع الأنسجة واحد (4.8 × 8.4 بوصة) وصولا الى الجزء السفلي من قنينة بلاستيكية فارغة. نقع تماما الأنسجة مع الماء المقطر. استخدام كائن لدفع حملة على الأنسجة وبلطف استنزاف المياه الزائدة.
   2. عكس القارورة لتجاهل المياه الزائدة. ينبغي أن يكون هناك ما يكفي من الماء للحفاظ على الذباب رطب وغرفة رطبة المجاعة، ولكن ليس بما يكفي ليغرق الذباب.
4. نقل الذباب من القارورة الطعام في غرفة التجويع والمكونات القارورة حوالي 18-24 ساعة قبل أن تبدأ التجربة. تخزينقارورة تحت ظروف الحرارة والرطوبة تسيطر بين عشية وضحاها حتى تبدأ التجربة في اليوم التالي.

2. إعداد رائحة الطعام

1. إعداد الحل الاغاروز 1٪ عن طريق إضافة 0.1 غرام من انخفاض درجة حرارة انصهار الاغاروز إلى 10 مل من الماء المقطر في دورق زجاجي. تسخين الحل الاغاروز في الميكروويف فقط حتى يبدأ في الغليان ولكن جيدا قبل أن يغلي أكثر.
   1. وقف الميكروويف ودوامة القارورة مرة واحدة. كرر هذه الخطوة مرتين أكثر حتى يذوب تماما الاغاروز. تبقي الحل الاغاروز في حالة سائلة عن طريق الحفاظ على الحارة قارورة على موقد وضعت في 50 درجة مئوية.
2. إضافة 990 ميكرولتر من الحل الاغاروز 1٪ و 10 ميكرولتر من خل التفاح إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف لجعل 1٪ التفاح حل الخل. دوامة الحل حتى مختلطة ومكان في حاضنة حمام الجافة تعيين إلى 50 درجة مئوية.

3. غرفة الاختبار وسلوك إعداد غرفة

1. تعيين غرفة الاختبار للشروط المطلوبة (مثل درجة الحرارة والرطوبة).
2. بدوره على لوحة الصمام (660 نانومتر).
3. شطف والمناخل لوحات الاختبار مع الماء الساخن والحرارة لهم في فرن التجفيف حتى تبخرت كل الرطوبة. تبريد المناخل واللوحات وصولا الى درجة حرارة غرفة الاختبار قبل بداية التجارب.
4. وضع طبق الضحلة على الجزء العلوي من لوحة الناشر وملئه بالماء لزيادة الرطوبة المحلية وتحجب الماء في قطرة الاغاروز.
5. وضع المناخل على طبق الماء.

4. يطير تحميل في لوحات اختبار

الرسوم البيانية للمواصفات لوحات اختبار يمكن العثور عليها في القسم ملفات إضافي. يتم إجراء اختبار لوحة الاكريليك واضحة ويتكون من 6 الساحات الاختبار. A المنزلق بسيط يحتوي عقد الغرف التي تسمح ذبابة التحميل والاحتواء مؤقتة، والإفراج المتزامن ل6 الذباب إلى غرف كل منها فيبداية التجربة. -عبر الشعر محفورا في قلب كل الساحة في لوحة تشير إلى حيث ينبغي pipetted عطر.

1. إدراج المتزلجون في لوحة اختبار الاكريليك.
2. الشريحة بلطف الشافطة في قارورة الماضية المكونات القطن والسماح حوالي 6 الذباب على السير في aspirator.it أمر بالغ الأهمية أن يكون لطيف ممكن في التعامل معها. يمكن للمرء الاستفادة من السلوك ذبابة ضوئية للحث على الذباب على الزحف نحو الشافطة بالإشارة افتتاح قارورة نحو مصدر ضوء خافت. إذا لزم الأمر، يمكن للمرء أيضا تطبيق لطيف لشفط نضح حوالي 6 الذباب الإناث.
3. إدراج غيض من الشافطة في الحفرة الأولى من لوحة الاختبار. السماح لذبابة واحدة بالمرور إلى زنزانة وبلطف دفع التمرير إلى الأمام لتحميل ذبابة في حفرة المقبل. تستمر حتى الذباب يحتل كل 6 خلايا عقد من لوحة.
4. ماصة 5 ميكرولتر من 1٪ عصير التفاح والخل الحل الاغاروز مباشرة على وسط كرOSS-الشعر على وجهه داخل لوحة الاختبار.

5. اختبار تحديد المواقع لوحة

1. لتوسيط لوحة الاختبار، افتح الملف المسمى "تحديد المواقع Tool.vi." "ابفيف السادس لأداة لتحديد المواقع. سادسا يمكن العثور عليها في القسم ملفات إضافي. تشغيل الملف من خلال النقر على السهم الأبيض في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.
2. وضع لوحة اختبار على رأس غربال بحيث افتتاح الساحة يواجه الطابق غربال والهدف هو رائحة على السقف من لوحة. محاذاة مرمى محفورا في الجزء الخلفي من لوحة الاختبار مع الشعر الصليب على شاشة العرض.
3. عندما تم الانتهاء المحاذاة، إحباط التنفيذ من خلال النقر على النقطة الحمراء التي تقع بالقرب من الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.

6. تسجيل يطير المركز خلال التجربة

1. لتتبع وتسجيل إحداثيات الطاير خلال كل محاكمة البحث الغذائية، فتح ملف برنامج الحصول على "فلوريداذ تتبع - ستة Zones.vi "فيس ابفيف ل" تتبع فلاي - ستة Zones.vi "يمكن العثور عليها في القسم ملفات التكميلي تشغيل ملف من خلال النقر على السهم الأبيض في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة. .
2. تعيين اسم الملف وانقر على "موافق".
3. دفع المتزلجون في غرف اختبار للافراج عن الذباب في الساحات الاختبار. يجب الحرص على عدم تحريك غرف الاختبار لأن هذا سوف يؤدي إلى محاذاة غير لائق مع الإحداثيات برامج التحليل.
4. انقر على "ابدأ" (تبدأ تسجيل) والتأكد من أن المصدر الوحيد للضوء في غرفة الاختبار هو لوحة LED 660 نانومتر.
5. عند الانتهاء من المحاكمة، وإزالة غربال وغرفة السلوك. رفع لوحة الاختبار من غربال وإزالة الذباب عن طريق غمر لوحة في الجليد. بلطف تنظيف لوحة مع الماء الساخن وإزالة أي حطام الاغاروز. وضع لوحات الاختبار في فرن التجفيف لإزالة الرطوبة.
6. تهوية المنطقة من خلال تحويل التجارب على األصغرل مروحة لحوالي 2 دقيقة. بدوره قبالة المروحة وتحميل المجموعة التالية من الذباب في لوحة الاختبار القادم.

7. تحليل البيانات باستخدام برمجيات مخصصة

"تحليل البيانات لتتبع يطير ستة والمناطق" يمكن العثور عليها في القسم ملفات إضافي. خلال الحصول على البيانات، وتنسق سجلات برنامج الحصول على موقف ذبابة الفردية لكل نقطة زمنية في ملف نصي. كاميرا رقمية واحدة وضعه فوق لوحات اختبار يكتسب الصور بمعدل إطارات قدره 0.5 هرتز. برنامج برامج التحليل "تحليل البيانات لتتبع يطير ستة والمناطق" مقتطفات من المعلومات من هذا الملف النص إلى) حساب متوسط ​​السرعة، ب) تحديد نقطة الوقت الذي ذبابة تقع بنجاح مصدر الرائحة، وج) بناء النوافذ الرسومية التي تسمح للمستخدم لعرض: يطير الموقع، مسافة الطاير من مصدر الرائحة مع مرور الوقت ومتوسط ​​سرعة الطيران مع مرور الوقت. فإنه أيضا تنسيقات البيانات لسهولة التصدير إلى spreبرنامج adsheet. في هذا الماكرو، يتم تعريف الأغذية البحث الكمون كنقطة الوقت الذي تنفق الذباب لا يقل عن 5 ثانية داخل دائرة نصف قطرها 5 ملم من وسط الساحة.

1. فتح ملف برامج التحليل "تحليل البيانات لتتبع فلاي - ستة المناطق". تحت "ويندوز" علامة التبويب، انقر على "إنشاء جدول جديد." كرر هذه الخطوة حتى تم إنشاء ستة جداول.
2. تحت عنوان "وحدات الماكرو" علامة التبويب، انقر على "Foodfinding". يجب أن تظهر لوحة رئيسية مع الخيارات التالية: ملف البيانات المفتوحة أولية للتخطيط؛ فتح ملف بيانات أولية للملف بيانات؛ يطير المكان؛ القطر؛ السرعة؛ تخطيط؛ FormatDataFile.
3. لعرض البيانات الخام دون إلحاق القيم إلى ملف نصي، انقر على "فتح ملف بيانات أولية للتخطيط." حدد موقع ثم حدد ملف البيانات التجريبية في نافذة المتصفح التي تظهر. انقر على "فتح".
4. انقر على "فلاي الموقع" لعرض الموقع كل الذبابة في كل من الساحتين ستة (ستة المؤامرات XY تصور كل ذبابة 'يجب أن تظهر و موقف مع مرور الوقت على الشاشة).
5. انقر على "المسافة" لعرض كل مسافة الذبابة من مصدر الرائحة (يجب أن تظهر ستة المؤامرات التي تصور مسافة الذبابة من مصدر الرائحة مع مرور الوقت على الشاشة). الخط الأفقي في ص = 5 مم يدل على العتبة التي تعتبر الطاير أن يكون موجودا في مصدر الغذاء.
6. انقر على "سرعة" لعرض معدل السرعة لكل الذبابة أثناء المحاكمة (يجب أن تظهر ستة المؤامرات التي تصور سرعة الذبابة مع مرور الوقت على الشاشة).
7. انقر على "تخطيط" لعرض تخطيط مع كل موقع ذبابة، وبعد المسافة، والسرعة الرسوم البيانية بالإضافة إلى متوسط ​​السرعة (خلال 50 ثانية الأولى) والكمون من العثور على مصدر الرائحة لكل ذبابة (الشكل 1). لعرض بشكل صحيح تخطيط، قد يكون من الضروري لضبط الهوامش. للقيام بذلك، انقر أولا على نافذة المخطط. تحت عنوان "ملف" التبويب، انقر على "إعداد الصفحة للتخطيط." إعادة تعيين الهوامش إلى0.2 بوصة وانقر على "موافق". غادر على الفور من كل مؤامرة الموقع طاولة صغيرة مع عناوين "السرعة" و "الكمون". القيم المدخلة تحت كل عنوان يشير إلى متوسط ​​السرعة في ملم / ثانية والبحث الغذائي الكمون في ثوان. إدخالات فارغة تحت الكمون تشير إلى فشل الطاير لتحديد مصدر الرائحة. يعرف الغذاء البحث الكمون كنقطة الوقت الذي الذباب قضى ما لا يقل عن 5 ثانية ضمن دائرة نصف قطرها 5 ملم من وسط الغرفة.
8. لطباعة تخطيط، انقر على منطقة تخطيط (تخطيط التحديثات إلى الملف الحالي). انقر على "ملف" ثم انقر على "تخطيط الطباعة".
9. لعرض الصورة التالى، ببساطة انقر على "فتح ملف بيانات أولية للتخطيط." انقر على ملف البيانات الخام القادمة التي ترغب في عرضها، ثم انقر على "موافق". انقر على نافذة تخطيط لتحديث الإطار مع ملف بيانات جديد.
10. قد يتم حفظ الإعدادات في ملف التجربة لاستخدامها لاحقا.

8. تصدير البيانات منالبرنامج تحليل البيانات إلى برنامج جدول بيانات

1. لتصدير البيانات السرعة والكمون لكل ملف، انقر على "فتح ملف بيانات أولية للملف بيانات." حدد ملف البيانات التجريبية وانقر على "فتح". سوف تظهر نافذة متصفح جديدة.
2. في نافذة متصفح جديدة، انقر بالزر الايمن على "جديد"، ثم انقر على "مستند نص". تسمية مستند نصي جديد. حدد ملف نصي يدعى حديثا وانقر على "فتح". هذه مخازن البيانات من ملف البيانات الخام إلى ملف نصي.
3. لتصدير البيانات من ملف آخر، انقر على "فتح ملف بيانات أولية للملف بيانات." انقر على ملف آخر وانقر على "فتح". حدد ملف النص من الخطوة 8.2). تستمر هذه العملية لملفات البيانات المتبقية التي ترغب في تصديرها.
4. مرة واحدة تم إضافة كافة الملفات البيانات المطلوبة إلى ملف نصي، انقر على "ملف تنسيق البيانات." حدد مستند نص يستخدم لتخزين البيانات من الخطوات السابقة وانقر على "فتح" (أ يندو جديدةسوف تفتح تلقائيا ث).
5. إنشاء مستند نص جديد في النافذة، وتعيين اسم ملف، وانقر على "حفظ". هذا بإنشاء ملف نصي يحتوي على اسم الملف، معدل السرعة، والكمون لكل يطير ويمكن استيرادها إلى برنامج جدول بيانات.
6. هي التي شيدت المؤامرات التراكمي من البيانات على عدد من الذباب بلوغ الهدف رائحة الطعام بوصفها وظيفة من الوقت (الشكل 3).
7. ويتم تحليل مجموعات البيانات التجريبية للدلالة إحصائية باستخدام اختبار ض للنسب.

النتائج

برنامج تحليل البيانات والتخطيط، مثالا وهو ما يمكن ملاحظته في الشكل 1، وتستخدم لتقييم أداء كل الذبابة لها خلال 10 دقيقة المحاكمة وفقا لمجموعة من المعايير التحليل. وتستخدم المعايير التالية لتحديد ما إذا كان سيتم استخدام البيانات من كل ذبابة لتحليل البيانات وت...

Discussion

في هذا البروتوكول، ونحن تصف الإجراء خطوة بخطوة لفحص سلوك البحث الغذائية. بالإضافة إلى الروائح الغذائية ذات الصلة، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف لدراسة قدرة الذبابة لتحديد مواقع الأشياء رائحة أخرى. على سبيل المثال، فإنه يمكن تطبيقها تجاه دراسة السلوك توطين زميله في الذباب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple Cider Vinegar	Spectrum		commercially available
Agarose, Type VII	Sigma-Aldrich	A0701	low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate		custom	Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens	National Instruments	780024-01	Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate	Edmund Optics	custom	Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight	Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply	GW Instek	GPS-1830D	Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard	Digikey	922354-ND	Breadboard for LEDs