Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster.

Zusammenfassung

Für viele Tiere, Hunger fördert Veränderungen im olfaktorischen System in einer Weise, die die Suche nach geeigneten Nahrungsquellen erleichtert. In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster. In einem lichtdichten Gehäuse mit rotem Licht, die unsichtbar für Fruchtfliegen ist beleuchtet, eine Kamera, um benutzerdefinierte Datenerfassungssoftware verknüpft überwacht die Position von sechs Fliegen gleichzeitig. Jede Fliege beschränkt sich auf in einzelnen Arenen, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte gehen. Die Testarenen ruhen auf einem porösen Boden, die Funktionen, um Geruch Ansammlung zu verhindern. Latenz, um die Geruchsquelle, eine Metrik, Geruchsempfindlichkeit unter verschiedenen physiologischen Zuständen spiegelt zu finden, wird von der Software-Analyse bestimmt. Hier diskutieren wir die kritische Mechanik der Ausführung dieses Verhaltens-Paradigma und decken spezifische Fragen der Fliege loading, Geruchsbelastung, Temperatur-Test, Datenqualität und statistische Analyse.

Einleitung

Staaten von Hunger fördern zwei Arten von appetitive Verhalten: Nahrungssuche und der Nahrungsaufnahme ^ein. Diese einfache Verhaltenstest ist nützlich für die Untersuchung der chemotaktischen Verhalten mit Futter ^2,3 verbunden. Insbesondere verfolgt sie fly Position, Laufgeschwindigkeit und Latenz auf der Suche nach einem Lebensmittelgeruch Ziel. Latenz von Lebensmitteln Stellung dient als Maß für die Messung von Veränderungen in der Empfindlichkeit des Fliegengeruchserkennungssystem stromabwärts von Änderungen im internen Zustand appetitive. Eine manuelle Version dieses Tests wurde zuvor verwendet, um zu zeigen GABA-B-Rezeptor-Signal ist für die Geruchslokalisierung Verhalten wichtig in der Erwachsenen ³ fliegt. Die aktuelle Version des automatisierten Test war maßgeblich an der Studie, wie kurz Neuropeptid-F (sNPF) Signalisierung formt die olfaktorischen Karte in Drosophila und Einflüsse appetitive Verhaltensweisen ^2.

Tests in einem dunklen, Temperatur und Feuchtigkeit kontrollierten Raum erfolgen. DigitalVideokameras über den klaren Acryl-Testplatten gesetzt verfolgen Fliegen durch 660-nm-LED-Beleuchtung hinterleuchtet. Informationen von der Kamera in Echtzeit von einem Computer stationiert neben dem Testbereich verarbeitet. Wir verwenden Datenerfassungssoftware, die während der Testphase und speichert die Koordinaten der Flugpositionen.

In diesem Paradigma wird das Thema in einer Arena, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte enthält freigesetzt; der Geruch Objekt schafft eine Nahrungsmittelgeruch Gradienten in der Arena, die Nahrungssuche in der Flugverhalten auslöst. Ein ähnlicher Geruch Suche Protokoll zu der Studie der Chemosensorik in einzelnen Drosophila-Larven ⁷ angewandt. Während andere Verhaltenstests, wie der Vier-Felder-Olfaktometer ^4,5 oder dem T-Labyrinth ⁶ bewerten Geruchsaversion oder Anziehung Verhalten, wird dieses Paradigma besten geeignet, um Geruchsempfindlichkeit und Chemotaxis Verhalten zu beurteilen.

Mehrere wichtige Vorteile begleiten diese assay. Erstens ermöglicht sie schnelle Erfassung großer Datenmengen, da die Datenerhebung und-analyse sind meist automatisiert. Zweitens trennt dieser Test und misst das Verhalten von Einzellinie, wodurch soziale olfaktorische Signale, die ihr Verhalten beeinflussen können. Drittens, die Einfachheit des Protokolls und einfachen experimentellen Design machen den Test effizient und einfach, andere zu lehren.

Zusätzlich kann dieser Test verwendet werden, um weitere Sonde neuronalen Schaltkreise durch die Kombination mit der umfangreichen genetischen Toolkit zur Verfügung, um Drosophila melanogaster ⁸ zugrunde liegenden Nahrungssuchverhalten werden. Gezielte Expression von Transgenen, dass Schweigen zu erregen oder Neuronen können mit Tools wie der GAL4-UAS-System sowie der FH-shibire ^ts1, UAS-Tetanus-Toxin und UAS-TRPA1 (B) erreicht werden Transgene ^12.09.

Protokoll

1. Fly-Sammlung und Hunger

1. Rück die Versuchsfliegen unter kontrollierten Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen (zB 21 ° C, 50-60% relative Luftfeuchtigkeit) auf einem 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus.
2. Sammeln weiblichen fliegt am Tag des Schlüpfens und sie, zusammen mit 4-5 Männchen, in neue Lebensmittelflaschen (maximal 30 pro Fläschchen). Alter fliegt 2-5 Tage.
3. Bereiten Sie die Kammern für Fliegen Hunger.
   1. Drücken Sie eine einzelne Gewebe (4,8 x 8,4 Zoll) bis auf den Boden eines leeren Kunststoffröhrchen. Komplett genießen das Gewebe mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie ein Objekt auf dem Gewebe nach unten drücken, und drücken Sie leicht heraus überschüssiges Wasser.
   2. Drehen Sie die Durchstechflasche um das zusätzliche Wasser zu verwerfen. Es sollte genug Wasser, um die Fliegen mit Feuchtigkeit versorgt und der Hunger Kammer feucht zu halten, aber nicht genug, um die Fliegen ertrinken.
4. Übertragen Sie die Fliegen aus der Lebensmittel Fläschchen in einen Hungerkammer und stecken Sie das Fläschchen etwa 18-24 Stunden, bevor das Experiment beginnt. Bewahren Sie dieFläschchen unter kontrollierten Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen über Nacht, bis das Experiment beginnt am nächsten Tag.

2. Vorbereitung der Speisen Geruch

1. Vorbereitung einer 1%-igen Lösung durch Zugabe von 0,1 g Agarose mit niedriger Schmelztemperatur zu 10 ml destilliertem Wasser in einem Glaskolben. Erhitzen Sie die Agarose-Lösung in der Mikrowelle nur, bis es anfängt zu kochen, aber gut, bevor es überkocht.
   1. Stoppen Sie die Mikrowelle und die Flasche einmal wirbeln. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal, bis die Agarose vollständig gelöst hat. Halten Sie die Agarose-Lösung in einem flüssigen Zustand durch, das den Kolben warmen auf einer Heizplatte bei 50 ° C eingestellt
2. In 990 ul der 1% igen Lösung und 10 ul von Apfelessig in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, um eine 1% Apfelessig Lösung. Vortex, bis die Lösung gemischt und in ein trockenes Bad Inkubator auf 50 ° C eingestellt

3. Testraum und Verhalten Kammer-Setup

1. Stellen Sie den Testraum, um den gewünschten Bedingungen (zB Temperatur und Luftfeuchtigkeit).
2. Schalten Sie das LED-Panel (660 nm).
3. Spülen der Siebe und Testplatten mit heißem Wasser und Wärme sie in einem Trockenofen, bis alle Feuchtigkeit verdunstet. Kühlen Sie die Siebe und Platten auf den Testraum Temperatur vor Beginn der Experimente.
4. Positionieren Sie eine flache Schale auf der Oberseite der Diffusorplatte und füllen es mit Wasser, um die lokale Luftfeuchte zu erhöhen und das Wasser in der Agarose Tröpfchen maskieren.
5. Positionieren Sie die Siebe über die Wasserschale.

4. Fly Laden in die Testplatten

Diagramme mit den Spezifikationen für die Prüfung Platten können in dem Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden. Die Testplatte aus klarem Acryl gefertigt und besteht aus 6 Tests Arenen. Eine einfache Schieberegler enthält Haltekammern, die Fliegenbelastung, Zeitbegrenzung, und gleichzeitiger Freisetzung von 6 Fliegen zu ermöglichen, in ihren jeweiligen Kammern andie zu Beginn des Experiments. Fadenkreuz in der Mitte jeder Arena in die Platte geätzt angeben, wo Duftstoffe sollten pipettiert werden.

1. Legen Sie die Schieberegler in die Acryltestplatte.
2. Schieben Sie den Absauger in das Fläschchen an der Watte und ermöglichen über 6 Fliegen in die aspirator.it Fuß ist von entscheidender Bedeutung, so sanft wie möglich zu sein im Umgang mit ihnen. Man kann Vorteil der phototaktischen Verhalten fly nehmen, um Fliegen zu bewegen, indem er das Fläschchen Öffnung hin zu einem trüben Licht der Quelle bis zum Wasserstrahlpumpe kriechen. Wenn nötig, kann man auch sanfte Saugwirkung gelten für ca. 6 weibliche Fliegen zu saugen.
3. Führen Sie die Spitze der Saugvorrichtung in das erste Loch der Testplatte. Lassen Sie eine Fliege in die Arrestzelle weitergeben und vorsichtig voran den Schieberegler nach vorne, eine Fliege in die nächste Loch zu laden. Fortfahren, bis alle Fliegen 6 Arrestzellen der Platte zu besetzen.
4. Pipette 5 ul 1% Apfelessig Agarose-Lösung direkt auf das Zentrum der Cross-Haare auf der Innenseite der Testplatte.

5. Die Positionierung des Testing-Kennzeichen

1. Um die Testplatte zu zentrieren, öffnen Sie die Datei mit dem Namen "Positionierung Tool.vi." "LabVIEW-VIs für Positionierungswerkzeug. vi kann im Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden. Führen Sie die Datei, indem Sie auf den weißen Pfeil in der linken oberen Ecke des Bildschirms.
2. Legen Sie die Testplatte oben auf das Sieb, so dass die Arena steht vor der Eröffnung Siebboden und der Geruch Ziel ist an der Decke der Platte. Richten Sie das Fadenkreuz mit dem Fadenkreuz auf dem Bildschirm in den Rücken der Testplatte geätzt.
3. Wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist, brechen Sie die Ausführung durch einen Klick auf den roten Punkt in der Nähe der oberen linken Ecke des Monitors.

6. Notieren Sie die Fly Position während des Experiments

1. Um bei jeder Nahrungssuche Prozess verfolgen und aufzeichnen die Koordinaten der Fliege, öffnen Sie die Datei Erfassungssoftware "Fly-Tracking - Sechs Zones.vi "LabVIEW-VIs für" Fliege-Tracking -. Six Zones.vi "finden Sie im Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden Führen Sie die Datei, indem Sie auf den weißen Pfeil in der linken oberen Ecke des Monitors. .
2. Geben Sie der Datei einen Namen und klicken Sie auf "OK".
3. Voraus die Schieberegler, der in den Testkammern, um die Fliegen in die Arenen Prüfung freizugeben. Achten Sie darauf, die Testkammern zu bewegen, da dies zu falschen Ausrichtung mit Analyse-Software Koordinaten führen.
4. Klicken Sie auf "Start" (die Aufnahme beginnt), und sicherzustellen, dass die einzige Lichtquelle in der Testkammer ist der 660 nm LED-Panel.
5. Als der Prozess abgeschlossen ist, entfernen Sie das Sieb und Verhalten Kammer. Heben Sie die Testplatte aus dem Sieb zu entfernen und die Fliegen durch Eintauchen der Platte in Eis. Reinigen Sie die Platte mit heißem Wasser und entfernen Sie Agarose Schutt. Platzieren Sie die Testplatten in einem Trockenofen, um Feuchtigkeit zu entfernen.
6. Lüften Sie den Testbereich durch Einschalten eines small Gebläse für ca. 2 min. Drehen Sie den Lüfter aus und laden Sie die nächste Gruppe von Fliegen in die nächste Testplatte.

7. Datenanalyse mit Custom Software

"Datenanalyse für Fly-Tracking-Six Zones" finden Sie im Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden. Während der Datenerfassung, koordiniert die Übernahme-Software zeichnet einzelnen Flugposition für jeden Zeitpunkt in eine Textdatei. Eine einzelne Digitalkamera über den Testplatten angeordnet nimmt Bilder mit einer Bildfrequenz von 0,5 Hz ist. Die Analyse-Software-Programm "Data Analysis für Fly-Tracking-Six Zones" extrahiert Informationen aus dieser Textdatei auf a) die Berechnung der Durchschnittsgeschwindigkeit, b) den Zeitpunkt, zu dem eine Fliege erfolgreich die Geruchsquelle befindet, und c) bauen Grafikfenstern , die den Benutzer über einen Blick ermöglichen: Fliegen Lage, Abstand der Fliege von der Geruchsquelle über die Zeit und die Durchschnittsgeschwindigkeit fliegen über die Zeit. Es formatiert die Daten auch für einfachen Export in eine spreadsheet Programm. In diesem Makro wird Nahrungssuche Latenz als Zeitpunkt, an dem fliegt verbringen mindestens 5 s innerhalb eines Radius von 5 mm von der Mitte der Arena definiert.

1. Öffnen Sie die Datei-Analyse-Software "Data Analysis für Fly-Tracking - sechs Zonen". Unter dem Reiter "Windows", klicken Sie auf "Create New Table." Wiederholen Sie diesen Schritt, bis sechs Tabellen erstellt wurden.
2. Unter dem Reiter "Makros", klicken Sie auf "Foodfinding." Ein Hauptsteuerung sollte mit den folgenden Optionen angezeigt: Open Raw-Datendatei für Layout-, Open Rohmaterial-Datendatei für Data File; Fly Location; Entfernung, Geschwindigkeit, Layout-, FormatDataFile.
3. Um Rohdaten ohne Anhängen von Werten in einer Textdatei anzuzeigen, klicken Sie auf "Öffnen Rohdaten-Datei für Layout." Suchen und wählen Sie die Versuchsdaten-Datei im Browser-Fenster, das erscheint. Klicken Sie auf "Öffnen".
4. Klicken Sie auf "Fly Location" auf Position jedes Haar in jeder der sechs Arenen (sechs XY-Plots Darstellung jedes fly 'ansehens Position im Laufe der Zeit sollte auf dem Bildschirm angezeigt).
5. Klicken Sie auf "Distanz" zu jeder Fliege Abstand von der Geruchsquelle (sechs Parzellen Darstellung der Fliege Abstand von der Geruchsquelle im Laufe der Zeit sollte auf dem Bildschirm) zu sehen. Die horizontale Linie bei y = 5 mm gibt die Schwelle, bei der die Fliege als bei der Nahrungsmittelquelle angeordnet sein.
6. Klicken Sie auf "Speed" zu Durchschnittsgeschwindigkeit der einzelnen Fliege während der Studie (sechs Grundstücke darstellt Geschwindigkeit der Fliege im Laufe der Zeit sollte auf dem Bildschirm) zu sehen.
7. Klicken Sie auf "Layout" ein Layout mit allen fly Lage, Distanz und Geschwindigkeitskurven neben der Durchschnittsgeschwindigkeit (während der ersten 50 sec) und Latenz der Suche nach der Geruchsquelle für jede Fliege (Abbildung 1) anzuzeigen. Um das Layout korrekt anzuzeigen, kann es notwendig sein, die Ränder anpassen. Um dies zu tun, klicken Sie zuerst auf das Layout-Fenster. Unter dem Reiter "Datei", klicken Sie auf "Seite einrichten für Layout." Stellen Sie die Ränder auf0,2 Zoll und klicken Sie auf "OK". Sofort von jedem Standort Grundstück links ist eine kleine Tabelle mit den Überschriften "Speed" und "Latency". Die unter den einzelnen Positionen eingegeben Werte geben die Durchschnittsgeschwindigkeit in mm / s und Nahrungssuche Latenzzeit in Sekunden. Blank Einträge unter Latency zeigen die Fliege nicht die Geruchsquelle zu lokalisieren. Essen Suche Latenz wird als Zeitpunkt, an dem die Fliegen verbrachte mindestens 5 s innerhalb eines Radius von 5 mm von der Mitte der Kammer definiert.
8. Um ein Layout zu drucken, klicken Sie auf den Layoutbereich (Updates auf aktuelle Layout-Datei). Klicken Sie auf "Datei" und dann auf "Seitenlayout."
9. Um die nächste Datei anzuzeigen, klicken Sie einfach auf "Open Raw Data File zum Layout." Klicken Sie auf der nächsten Rohdatendatei, die Sie anzeigen möchten, und klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf das Layout-Fenster, das Fenster mit der neuen Datendatei zu aktualisieren.
10. Die Einstellungen können in einem Experiment Datei zur späteren Verwendung gespeichert werden.

8. Export von Daten ausder Datenanalyse-Software auf einem Tabellenkalkulationsprogramm

1. Um die Geschwindigkeit und Latenz-Daten für jede Datei zu exportieren, klicken Sie auf "Open Raw-Datendatei für Datendatei." Wählen Sie einen experimentellen Daten-Datei und klicken Sie auf "Öffnen". Ein neues Browser-Fenster wird angezeigt.
2. In der neuen Browser-Fenster mit der rechten Maustaste auf "Neu" und dann auf "Textdokument." Nennen Sie den neuen Textdokument. Wählen Sie das neu benannte Textdatei und klicken Sie auf "Öffnen". Diese speichert Daten von der Rohdatendatei in die Textdatei.
3. Um Daten aus einer anderen Datei zu exportieren, klicken Sie auf "Öffnen Rohdaten-Datei für Datendatei." Klicken Sie auf eine andere Datei und klicken Sie auf "Öffnen". Wählen Sie die Textdatei aus Schritt 8.2). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die übrigen Dateien, die Sie exportieren möchten.
4. Sobald alle gewünschten Daten-Dateien in der Textdatei hinzugefügt wurde, klicken Sie auf "Format-Datendatei." Wählen Sie die verwendet werden, um Daten aus den vorherigen Schritten zu speichern, und klicken Sie auf "Öffnen" (ein neues Textdokument window wird automatisch geöffnet).
5. Erstellen Sie ein neues Textdokument in dem Fenster, weisen Sie der Datei einen Namen, und klicken Sie auf "Speichern". Dieser erstellt eine Textdatei, die die Dateinamen, Durchschnittsgeschwindigkeit, und Latenz enthält für jede fliegen und kann in ein Tabellenkalkulationsprogramm importiert werden.
6. Kumulative Stücke werden aus Daten über die Anzahl der Fliegen Erreichen der Nahrungsmittelgeruch Ziel als Funktion der Zeit (Fig. 3) ausgebildet ist.
7. Experimentelle Daten-Sets sind für die statistische Signifikanz mit einem z-Test für Proportionen analysiert.

Ergebnisse

Die Datenanalyse-Software und die Anordnung, von der ein Beispiel in Fig. 1 zu sehen ist, werden nach einer Reihe von Analysekriterien verwendet, um die Leistung der einzelnen Fliegen während der 10 Minuten Versuchs auszuwerten. Die folgenden Kriterien werden verwendet, um festzustellen, ob Daten von jeder Fliege wird für die Datenanalyse verwendet werden und sind entworfen, um jene Fliegen, die nicht in der Lage, die Nahrung Suchaufgabe aufgrund einer Verletzung, Krankheit, Stress oder mangelnde Moti...

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Lebensmittel-Suchverhalten Assay. Zusätzlich zu Lebensmitteln Gerüche, können aber auch für die Untersuchung des Fliegen Fähigkeit, andere Objekte zu lokalisieren Geruch angepasst werden. Zum Beispiel kann es zu der Studie von Mate-Lokalisierung Verhalten in männlichen Fliegen ³ angewendet werden Es gibt einige zusätzliche Überlegungen für dieses Protokoll, das wir zu diesem Verfahren hier zu erwähnen.:

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple Cider Vinegar	Spectrum		commercially available
Agarose, Type VII	Sigma-Aldrich	A0701	low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate		custom	Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens	National Instruments	780024-01	Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate	Edmund Optics	custom	Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight	Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply	GW Instek	GPS-1830D	Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard	Digikey	922354-ND	Breadboard for LEDs