Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi<em&gt; Drosophila</em

Özet

Bu video makalede, Drosophila melanogaster uçmak yetişkin meyve koku bağımlı gıda arama davranışı üzerine açlık veya tokluk etkisini ölçmek için otomatik bir deneyi açıklar.

Özet

Çok hayvan için, açlık uygun gıda kaynakları için arama kolaylaştıran bir şekilde koku alma sistemindeki değişiklikleri teşvik etmektedir. Bu video makalede, Drosophila melanogaster uçmak yetişkin meyve koku bağımlı gıda arama davranışı üzerine açlık veya tokluk etkisini ölçmek için otomatik bir deneyi açıklar. Meyve sinekleri üzerinde görünmez kırmızı ışıkla aydınlatılmış bir ışık geçirmez kutu, özel veri toplama yazılımı ile bağlantılı bir kamera aynı anda altı sineklerin konumunu izler. Her sinek merkezinde bir yemek kokusu içeren bireysel arenalarda yürümek sınırlıdır. Test arenalar fonksiyonları koku birikmesini önlemek için bir gözenekli katta dinlenme. Koku kaynağı, farklı fizyolojik durumlarda altında koku hassasiyeti yansıtan bir metrik bulmak için Gecikme, yazılım analizi ile belirlenir. İşte, bu davranış paradigma çalışan kritik mekaniği tartışmak ve sinek loadi ilgili özel konuları kapsamaktadırng, koku kirliliği, tahlil sıcaklık, veri kalitesi ve istatistiksel analizi.

Giriş

Yiyecek aramak ve gıda tüketimi ^1: açlık Devletleri iştahlı davranışları iki tür teşvik. Bu basit davranışsal deney ^2,3 yem ile bağlantılı kemotaktik davranışlarının çalışma için yararlıdır. Özellikle, bir gıda koku hedef bulma sinek pozisyon, yürüme hızı ve gecikme izler. Gıda bulgunun Gecikme iç iştahlı durumundaki değişikliklerin aşağı sineğin koku algılama sistemi duyarlılık değişiklikleri ölçmek için metrik olarak hizmet vermektedir. Bu deneyde, bir el sürümü daha önce GABA-B reseptör sinyal ³ uçan yetişkinde koku lokalizasyon davranışı için çok önemlidir göstermek için kullanılmıştır. Testin geçerli otomatik versiyon nöropeptid-F (SNPF) sinyal Drosophila koku haritayı yeniden şekillendirir ve etkileri davranışlarını ² iştahlı nasıl kısa çalışmada etkili oldu.

Test karanlık, sıcaklık ve nem kontrollü odada yapılır. Dijitalşeffaf akrilik test plakaları yukarıda belirtilen video kameralar 660-nm LED aydınlatma ile aydınlatmalı sinekler izleyebilirsiniz. Kameradan gelen bilgiler bir sonraki test alanına konuşlanmış bir bilgisayar tarafından gerçek zamanlı olarak işlenir. Biz test döneminde sinek pozisyonların koordinatlarını kaydetmek ve kaydetmek için veri toplama yazılımı kullanın.

Bu paradigmada, konu merkezinde bir gıda koku içeren bir arenaya salınır, koku nesne sinek yiyecek arama davranışı neden arenada bir gıda koku degrade oluşturur. Benzer bir koku ara protokol tek bir Drosophila larvalarının ⁷ chemosensation çalışma doğru uygulanmıştır. Böyle dört-alan olfactometer ^{4,5 'ya} da t-labirent ⁶ gibi diğer davranışsal deneyler koku kaçınma veya cazibe davranışlarını değerlendirmek iken, bu paradigma iyi koku hassasiyeti ve kemotaksis davranışlarını değerlendirmek için uygundur.

Birkaç anahtar avantajları bu assa eşliky. Veri toplama ve analiz çoğunlukla otomatik çünkü Birincisi, bu, büyük veri kümelerinin hızlı edinimine izin. İkincisi, bu testte izole ederek onların davranışlarını etkileyebilecek sosyal koku ipuçlarını ortadan kaldırarak, tek bir sinek davranışını ölçer. Üçüncü olarak, protokol ve basit deneysel tasarım basitliği tahlil verimli ve başkalarına öğretmek için kolaylaştırır.

Buna ek olarak, bu deney daha Drosophila melanogaster ^8'e uygun geniş genetik araç ile birleştirerek gıda arama davranışı altında yatan sinir devreleri araştırmak için kullanılabilir. Sessizlik veya heyecan nöronlar örneğin GAL4-UAS sistemi hem de UAS-shibire ^TS1 UAS-tetanoz-toksini ve UAS-TRPA1 (B) gibi araçlar ile elde edilebileceğini transgenlerin ifadesi hedeflenmiş ^9-12 transgenlerin.

Protokol

1.. Fly Toplama ve Açlık

1. Arka 12 saat ışık / karanlık döngüsü kontrollü sıcaklık ve nem koşulları (örn. 21 ° C,% 50-60 bağıl nem) altında deneysel sinekler.
2. Kadın eclosion gününde uçar toplayın ve (maksimum 30 şişe başına) yeni gıda şişeleri içine, 4-5 erkek ile birlikte koyun. Yaş 2-5 gün uçuyor.
3. Sinek açlık için odaları hazırlayın.
   1. Boş bir plastik şişenin dibine bir tek doku (4.8 x 8.4 inç) itin. Tamamen saf su ile doku ıslatın. Doku üzerinde bastırın ve yavaşça fazla suyunu sıkın bir nesne kullanın.
   2. Ilave su atmak için şişeyi ters çevirin. Orada nemli nemli sinekler ve açlık odasını tutmak için yeterli su olabilir, ama sinekler boğmak için yeterli olmamalıdır.
4. Bir açlık odasına gıda şişesinden sinek aktarın ve deney başlamadan önce şişenin yaklaşık 18-24 saat takın. Mağazagece boyunca kontrol edilen sıcaklık ve nem koşulları altında şişeler, deney ertesi gün başlayana kadar.

2. Gıda Koku hazırlanması

1. Agaroz, bir cam şişe içinde damıtılmış su, 10 ml düşük erime sıcaklığının 0.1 g eklenmesi ile bir% 1 agaroz çözeltisi hazırlayın. Kaynamaya başlayınca kadar sadece bir mikrodalga agaroz çözüm Isı ama kaynar çok önce.
   1. Mikrodalga durdurmak ve bir kez şişeyi girdap. Agaroz tamamen çözülene kadar iki kez daha bu adımı tekrarlayın. 50 ° C'de ayarlanmış bir sıcak plaka üzerindeki bir şişe sıcak tutarak sıvı halde agaroz çözüm tutun
2. % 1 elma sirkesi çözüm yapmak için 1.5 ml Eppendorf tüpüne% 1 agaroz çözüm 990 ul ve elma sirkesi 10 ul ekleyin. Vortex kadar solüsyon 50 ° C'ye ayarlanmış bir banyo kuru inkübatör içinde karıştırılmış ve bir yer

3. Test Odası ve Davranış Odası Kurulumu

1. İstenen koşullar (örneğin sıcaklık ve nem) için test odası ayarlayın.
2. LED panel (660 nm) açın.
3. Sıcak su ile elekler ve test plakaları durulayın ve nem buharlaşana kadar bir kurutucu fırında ısı. Deney başlamadan önce, test, oda sıcaklığına kadar elekler ve plakalar soğutun.
4. Dağıtıcı plaka üstüne basit bir çanak yerleştirin ve yerel nemi arttırmak için ve agaroz damlacık içindeki suyu maske için su ile doldurun.
5. Su kabının üzerinde elekler yerleştirin.

4. Test Plakalar içine yükleniyor sinek

Test plakaları için özellikleri ile şemaları Ek Dosyalar bölümünde bulunabilir. Test plakası berrak akrilik yapılmış ve 6 test alanları oluşur. Basit kaydırıcı de kendi odalarına sinek yükleme, geçici çevreleme ve 6 sinek eşzamanlı salınımına imkan tutarak odalarını içeriyorDeneyin bir başlangıç. Katkılar pipetle gerektiği yerde plaka her arena merkezinde kazınmış çapraz kıllar göstermektedir.

1. Akrilik test plakasına sürgü takın.
2. Yavaşça pamuk tıkaç geçmiş şişenin içine trombu kaydırın ve yaklaşık 6 sinekler aspirator.it yürümek izin ellemeden mümkün olduğunca nazik olmak önemlidir. Bir loş bir ışık kaynağına doğru şişe açılış işaret ederek aspiratörün doğru tarama sinekler ikna etmek phototactic sinek davranış yararlanabilir. Gerekirse, bir de yaklaşık 6 erkek sineklerin aspire nazik vakum uygulanabilir.
3. Test plakanın birinci deliğe aspiratör ucu yerleştirin. Tek bir sinek tutma hücreye geçmek ve yavaşça bir sonraki deliğe bir sinek yüklemek için ileri sürgüsünü ilerlemek için izin verin. Sinekler plaka 6 tutarak hücreleri işgal kadar devam edin.
4. Doğrudan cr merkezinde üzerine% 1 elma sirkesi agaroz çözeltisi Pipet 5 ultest plakasının iç yüzünde OSS kıllar.

5. Test Plakası konumlandırılması

1. Test plakasını ortalamak için, "Konumlandırma Tool.vi." adlı dosyayı açın Konumlandırma Aracı "LabVIEW VI. vi Ek Dosyalar bölümünde bulunabilir. Ekranın sol üst köşesindeki beyaz oka tıklayarak dosyayı çalıştırın.
2. Arena açma elek taban yüzleri ve koku hedef plaka tavanına olduğu şekilde eleğin üzerine test plakası yerleştirin. Monitör ekranında çapraz kıllar ile test plakasının arkasına kazınmış gözlemeye hizalayın.
3. Hizalama tamamlandığında, monitörün sol üst köşesine yakın bulunan kırmızı nokta tıklayarak yürütme iptal.

6. Deney sırasında Fly Konumunu kaydedin

1. Her yiyecek arama duruşma sırasında sineğin koordinatlarını izlemek ve kaydetmek için, kazanım yazılım dosyasını açın "Fly Takip -. Altı Zones.vi "LabVIEW VI'ları için" Fly Takip - Altı Zones.vi "Ek Dosyalar bölümünde bulunabilir monitörün sol üst köşesinde beyaz oka tıklayarak dosyayı çalıştırın. .
2. Dosyaya bir ad atamak ve üzerine tıklayın "Tamam."
3. Test arenalarda içine sinekleri serbest bırakmak için test odalarına sürgüleri Advance. Bu analiz yazılımı koordinatları ile yanlış uyuma yol açacak gibi test odalarına taşımak için dikkatli olun.
4. "Start" (kayıt başlar) tıklayın ve test odasındaki ışığın tek kaynağı 660 nm LED panel olduğundan emin olun.
5. Deneme bittiğinde, elek ve davranış odasına çıkarın. Elekten gelen test levhası kaldırın ve buz içinde plaka daldırarak sinekler çıkarın. Yavaşça sıcak su ile plaka temizlemek ve herhangi bir agaroz enkaz kaldırmak. Nemin ayrılması için bir kurutma fırınında test plakaları yerleştirin.
6. Bir küçük açarak test alanı havalandırın, yaklaşık 2 dakika boyunca l fan. Fanı kapatın ve bir sonraki test plaka içine sinek sonraki grubu yükleyin.

7. Özel Yazılım kullanma Veri Analizi

"Fly İzleme-Altı Bölgeleri için Veri Analizi" Ek Dosyalar bölümünde bulunabilir. Veri toplama sırasında, toplama yazılım kayıtları tek tek sinek pozisyonu bir metin dosyasında her zaman noktası koordinatları. Test plakaları üzerinde konumlandırılmış tek bir dijital fotoğraf makinesi 0.5 Hz'lik bir kare hızında görüntü kazanır. "Fly İzleme-Altı Bölgeleri için Veri Analizi" a bu metin dosyasından bilgileri ayıklar analiz yazılım programı) ortalama hızınızı hesaplamak, b) başarıyla koku kaynağı bulunan ve bir sinek c) grafik pencereleri oluşturmak hangi zaman noktasını belirlemek görünümüne kullanıcıya izin: zamanla zaman ve ortalama bir sinek hızı üzerinde koku kaynağından konumu, sinek mesafe uçmak. Ayrıca Spre içine kolayca ihracat verileri biçimlendiriradsheet programı. Bu makro, yiyecek arama gecikme arena merkezine 5 mm yarıçap içinde en az 5 saniye harcamak uçar hangi zaman noktası olarak tanımlanır.

1. Analiz yazılımı dosya "- Altı Bölgeleri Fly Takip için Veri Analizi" açın. "Windows" sekmesi altında "Yeni Tablo oluşturma." Üzerine tıklayın Altı tablo oluşturuluncaya kadar bu adımı tekrarlayın.
2. "Makro" sekmesi altında "tıklayın Foodfinding." A Ana Panel aşağıdaki seçeneklerden görünmelidir: Açık Ham Veri Düzeni için Dosya; Açık Ham Veriler Dosya için Dosya, Fly Konumu; Mesafe, Hız, Düzen; FormatDataFile.
3. , Bir metin dosyasına değerlerini ekleme olmadan ham verilerini görüntülemek için tıklayın "Düzeni için Açık Ham veri dosyası." Bulup görünen tarayıcı penceresinde deneysel veri dosyasını seçin. Tıklayın "Aç."
4. Altı arenalarda (her sinek gösteren altı XY araziler 'her birinde, her sineğin yerini görmek için "Fly Location" üzerine tıklayınzamanla pozisyonu) ekranda görünmesi gerekir.
5. Koku kaynağı (zamanla koku kaynağından sineğin mesafeyi gösteren altı araziler ekranda görünmesi gerekir) her sineğin mesafeyi görebilmek için "Mesafe" tıklayın. Y = 5 mm yatay çizgi sinek gıda kaynağında yer olarak kabul edildiği eşiğini gösterir.
6. Deneme (zamanla sineğin hızını gösteren altı araziler ekranda görünmesi gerekir) sırasında her sineğin ortalama hızını görüntülemek için "Speed" e tıklayın.
7. Ortalama (ilk 50 sn boyunca) hız ve her sinek için koku kaynağı (Şekil 1) bulma gecikme ek olarak tüm sinek yer, mesafe ve hız grafikleri ile bir düzen görüntülemek için "Düzen" e tıklayın. Düzgün düzenini görüntülemek için, kenar boşluklarını ayarlamak için gerekli olabilir. Bunu yapmak için, önce mizanpaj penceresinde tıklatın. "Dosya" sekmesi altında, tıklayın "Düzeni için Sayfa Yapısı." Için kenar boşluklarını sıfırlamak0.2 inç ve üzerine tıklayın "Tamam." Hemen her yeri arsa sol başlıkları "Hız" ve küçük bir tablodur "Gecikme." Her başlık altında girilen değerler mm / sn ve saniyeler içinde yiyecek arama gecikme ortalama hızı gösterir. Gecikme altında boş girdiler sinek koku kaynağını bulmak için başarısız olduğunu gösteriyor. Gıda ara gecikme sinekler odasının merkezine 5 mm yarıçapında, en az 5 saniye geçirdiği de zaman noktası olarak tanımlanmaktadır.
8. Bir düzen yazdırmak için, düzen alanında (Geçerli dosya güncellemeleri düzen) tıklayın. "Dosya" seçeneğine tıklayın ve sonra tıklayın "Yazdırma Düzeni."
9. Sonraki dosyayı görüntülemek için, tıklamanız yeterlidir "Düzeni için Açık Ham veri dosyası." Eğer görüntülemek ve tıklatın istediğiniz sonraki ham veri dosyası üzerine tıklayın "Tamam." Yeni bir veri dosyası ile pencereyi güncellemek için Düzen penceresinde tıklayın.
10. Ayarları daha sonra kullanmak için bir deney dosyasına kaydedilmiş olabilir.

8. İhracat VerileriElektronik Tablo Programına Veri Analizi Yazılımı

1. Her dosya için hız ve gecikme veri aktarmak için, tıklayın "Açık Ham Veriler Dosya için dosya." Deneysel bir veri dosyasını seçin ve üzerine tıklayın "Aç." Yeni bir tarayıcı penceresi açılacaktır.
2. Yeni tarayıcı penceresinde, "Yeni" sağ-tıklatın ve sonra tıklayın "Metin Belgesi." Yeni bir metin belgesi adlandırın. Yeni adlandırılan metin dosyasını seçin ve üzerine tıklayın "Aç." Bu depolar metin dosyasına ham veri dosyasından veri.
3. Başka bir dosyadan veri aktarmak için "Veri Dosyası için Açık Ham veri dosyası." Üzerine tıklayın Başka bir dosya üzerine tıklayın ve üzerine tıklayın "Aç." ) Aşama 8.2 metin dosyasını seçin. Vermek istediğiniz kalan veri dosyaları için bu işleme devam edin.
4. Istenen tüm veri dosyalarını metin dosyasına eklendikten sonra, üzerine tıklayın "Format Veri Dosyası." Önceki adımları verileri depolamak ve bir yeni vitrinler ("Aç" üzerine tıklayın kullanılan Metin Belgesi'ni seçinw otomatik) açılacaktır.
5. Penceresinde yeni bir Metin Belgesi oluşturun, dosyayı bir isim atamak, ve üzerine tıklayın "Kaydet." Bu, her sinek ve bir elektronik tablo programı içine alınabilir için dosya adı, ortalama hız ve gecikme içeren bir metin dosyası oluşturur.
6. Kümülatif araziler, zamanın bir fonksiyonu (Şekil 3) gibi bir gıda koku hedefe ulaşma sinekler toplam sayısı ile ilgili verileri inşa edilir.
7. Deneysel veriler oranlarda bebekler için bir z-testi kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilir.

Sonuçlar

Veri analiz yazılımı ve düzeni, Şekil 1 'de görülebilir bir örneği, analiz, bir dizi kritere uygun olarak 10 dakika boyunca her bir deneme sineğin performansını değerlendirmek için kullanılır. Aşağıdaki kriterler her anında veri veri analizi için kullanılacak ve sakatlığı nedeniyle, hastalık, stres, ya da motivasyon eksikliği yiyecek arama görevi gerçekleştirmek için mümkün olan bu sinekler ortadan kaldırmak için tasarlanmış olup olmadığını belirlemek için k...

Tartışmalar

Bu protokol, biz gıda arama davranışı deneyi için bir adım-adım prosedürü açıklar. Gıda kokuları ile ilgili ek olarak, aynı zamanda, diğer koku nesneleri bulmak için sineğin yeteneğinin incelenmesi için adapte edilebilir. Örneğin, erkek sinekler ³ arkadaşı yerelleştirme davranış çalışmanın doğru uygulanabilir çeşitli ek noktalar biz bu prosedüre ilişkin burada değineceğim bu protokol için vardır.:

İlk olarak, yetiştirme sıcaklık deneysel ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple Cider Vinegar	Spectrum		commercially available
Agarose, Type VII	Sigma-Aldrich	A0701	low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate		custom	Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens	National Instruments	780024-01	Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate	Edmund Optics	custom	Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight	Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply	GW Instek	GPS-1830D	Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard	Digikey	922354-ND	Breadboard for LEDs