Одно-муха Анализ на нагула поведения в<em&gt; Дрозофилы</em

Резюме

В этом видео статье мы опишем автоматизированную анализа для измерения эффекта голода или сытости на обонятельной зависимого поведения поиска пищи во взрослом плодовой мушки дрозофилы.

Аннотация

Для многих животных, голод способствует изменения в обонятельной системы таким образом, чтобы облегчает поиск соответствующих источников питания. В этом видео статье мы опишем автоматизированную анализа для измерения эффекта голода или сытости на обонятельной зависимого поведения поиска пищи во взрослом плодовой мушки дрозофилы. В светонепроницаемый ящик освещенной красным светом, который невидим для плодовых мушек, камера связана с программным обеспечением пользовательские сбора данных контролирует положение шести мух одновременно. Каждый муха ограничивается ходить в отдельных сферах, содержащих запах пищи в центре. Испытуемые арен отдыхать на пористой этаже, который функционирует, чтобы предотвратить накопление запах. Задержка найти источник запаха, метрику, которая отражает обонятельный чувствительность при различных физиологических состояниях, определяется путем анализа программного обеспечения. Здесь мы рассмотрим критические механику работает этот поведенческий парадигму и охватывают конкретные вопросы, касающиеся лету loadiнг, загрязнение запах, температура анализ, качество данных и статистического анализа.

Введение

Штаты голода способствовать два типа аппетитивной поведения: поиска пищи и потребления продуктов питания ^1. Эта простая поведенческая анализ является полезным для изучения хемотаксических поведения, связанных с нагула ^2,3. В частности, он отслеживает положение летать, скорость ходьбы и задержки в поиске цели пищевого запаха. Задержка обретения пищевой служит показателем для измерения изменений в чувствительности запаха системы обнаружения мухи вниз по течению от изменений в его внутренней аппетитивной государства. Руководство версия данного анализа ранее был использован, чтобы показать сигнализации рецепторов ГАМК-Б имеет важное значение для поведения локализации запах у взрослых мух ^3. Нынешний автоматизированный вариант анализа сыграл важную роль в изучении, как коротка нейропептида-F (sNPF) сигнализации перекраивает обонятельный карту у дрозофилы и влияет аппетитивной поведения ^2.

Тестирование проводится в темном, контролируемой температурой и влажностью помещения. Цифровойвидеокамеры, установленные над Прозрачный акриловый тестирования пластин отслеживать мух подсветкой, 660-нм светодиодной подсветкой. Информация от камеры обрабатывается в режиме реального времени с помощью компьютера, размещенных рядом с областью тестирования. Мы используем программное обеспечение сбора данных для записи и сохранить координаты лету позиций в период тестирования.

В этой парадигме субъект освобождается в арену, которая содержит запах пищи в центре; объект запах создает продовольственную запах градиент внутри арены, которая вызывает пищевое поведение поиска в лету. Аналогичный протокол Поиск запах был применен к изучению chemosensation в одной личинок дрозофилы ^7. В то время как другие поведенческие тесты, такие как четыре поля ольфактометра ^4,5 или трет-лабиринт ⁶ оценить запах отвращение или достопримечательность поведения, эта парадигма лучше всего подходит для оценки обонятельных чувствительности и хемотаксиса поведения.

Несколько ключевых преимущества сопровождать этот ASSAу. Во-первых, он позволяет быстро приобретение больших наборов данных, поскольку сбор и анализ данных в основном автоматизированы. Во-вторых, этот анализ изолятов и измеряет поведение отдельных мух, тем самым устраняя социальные обонятельные сигналы, которые могут повлиять на их поведение. В-третьих, простота протокола и простой эксперимента сделать анализ эффективной и простой, чтобы учить других.

Кроме того, этот анализ может быть использован для дальнейшего исследовать нейронные цепи, лежащие в основе пищевое поведение поиска, комбинируя его с обширной генетической инструментария, доступной для дрозофилы ^8. Целевые выражение трансгенов, что молчание или возбуждают нейроны могут быть достигнуты с помощью инструментов, таких, как системы GAL4-UAS, а также UAS-shibire ^ts1, UAS-столбняка-токсина, и UAS-TRPA1 (B) трансгенов ^9-12.

протокол

1. Fly Сбор и Голод

1. Задняя экспериментальные мухи в контролируемых условиях температуры и влажности (например, 21 ° С, 50-60% относительной влажности) на 12-часовой цикле свет / темнота.
2. Сбор женский летит в день вылупления и поместить их вместе с 4-5 самцов, в новых пищевых флаконах (максимум 30 на флакон). Возраст летит 2-5 дней.
3. Подготовьте камеры для золы голода.
   1. Нажмите один ткани (4,8 х 8,4 дюйма) до нижней части пустой пластиковой флаконе. Полностью смочите ткань дистиллированной водой. Используйте объект в надавите на ткани и аккуратно выдавить лишнюю воду.
   2. Переверните флакон отказаться от дополнительной воды. Там должно быть достаточно воды, чтобы держать мух гидратированных и голод камеру влажной, но не достаточно, чтобы утопить мух.
4. Трансфер мух от пищевой флакона в голодном камеры и подключить флакона о 18-24 час до начала эксперимента. Хранитефлаконы в контролируемых условиях температуры и влажности в течение ночи, пока эксперимент не начинается на следующий день.

2. Подготовка пищевого запаха

1. Приготовьте 1%-ный раствор агарозы путем добавления 0,1 г низкой температурой плавления агарозы в 10 мл дистиллированной воды в стеклянную колбу. Нагрейте раствора агарозы в микроволновой печи просто пока не начинает кипеть, но задолго до того, прорываются.
   1. Остановите микроволновая печь и вихрем колбу один раз. Повторите этот шаг еще два раза, пока агарозном полностью не растворится. Держите раствора агарозы в жидком состоянии, сохраняя колбу тепло на плите, установленной при 50 ° С
2. Добавить 990 мкл 1% раствора агарозы и 10 мкл яблочного уксуса на 1,5 мл трубки Эппендорф сделать 1%-ный раствор уксуса яблочного. Vortex решение до смешанных и место в сухом ванны инкубатор до 50 ° С

3. Тестирование номер и настройка палата Поведение

1. Установите тестирования комнату желаемых условий (например, температуры и влажности).
2. Включите панели светодиодов (660 нм).
3. Промыть сита и тестирования пластины с горячей водой и нагреть их в сушильном шкафу, пока вся влага не испарится. Охладите сита и тарелки до температуры испытания комнатной перед началом экспериментов.
4. Поместите мелкое блюдо в верхней части пластины рассеивателя и заполнить его водой, чтобы увеличить локальную влажности и маскировать воду в агарозном капли.
5. Расположите сита над водой блюдо.

4. Fly Загрузка в испытательных пластин

Диаграммы с спецификаций для тестирования пластин можно найти в разделе Справочная Files. Тестирование пластина выполнена из прозрачного акрила и состоит из 6 тестирования арен. Простой слайдер содержит удерживающие камеры, которые позволяют летать загрузку, временное сдерживание и одновременное освобождение 6 мух в своих камерах вначале эксперимента. Перекрестие травления в центре каждой арене в пластине указать, где отдушки должны быть пипеткой.

1. Вставьте ползунки в акриловой тестирования пластины.
2. Аккуратно вставьте аспиратор во флакон мимо ватный тампон и позвольте около 6 мухи, чтобы идти в aspirator.it важно быть как можно ласковее в обращении с ними. Можно воспользоваться phototactic поведения лету, чтобы побудить мух ползать к аспиратор, указывая флакон открытие к тусклой источника света. При необходимости, можно также применить нежный всасывания для аспирации приблизительно 6 женского мух.
3. Вставьте наконечник аспиратора в первое отверстие испытательной пластине. Разрешить один муха пройти в камере предварительного и осторожно продвигаться ползунок вперед, чтобы загрузить муху в следующее отверстие. Продолжайте, пока мухи не занимают все 6 Холдинг клетки пластины.
4. Внесите 5 мкл 1% яблочного уксуса агарозном раствора непосредственно на центре крОСС-волосы на внутренней поверхности испытательной пластины.

5. Размещение Тестирование Plate

1. Для центрирования тестирования тарелку, откройте файл с именем "Позиционирование Tool.vi." "LabVIEW VI для позиционирования инструмента. VI можно найти в разделе Справочная Files. Запустите файл, нажав на белой стрелкой в ​​левом верхнем углу экрана.
2. Поместите тестирования пластину на верхней части сита, так что отверстие арена сталкивается с сито пол и целевой запах на потолке пластины. Совместите перекрестие, выгравированные в задней части тестирования пластины с перекрестие на экране монитора.
3. Когда выравнивание была завершена, прервать выполнение, нажав на красную точку размещается в левом верхнем углу монитора.

6. Запишите Fly установки в ходе эксперимента

1. Для отслеживания и регистрации координаты лету во время каждой поисковой питания суда, откройте файл программного приобретение "Flу слежения -. Шесть Zones.vi "LabVIEW ВП для" Fly Tracking - Шесть Zones.vi "можно найти в разделе Справочная Files Запустите файл, нажав на белой стрелкой в ​​левом верхнем углу монитора. .
2. Связать файлу имя и нажмите "OK".
3. Авансовые ползунки в испытательных камерах выпустить мух в испытательных аренах. Будьте осторожны, чтобы не переместить тестирования камеры, так как это приведет к неправильной соответствие с программного обеспечения для анализа координат.
4. Нажмите кнопку "Пуск" (начинается запись) и убедитесь, что единственным источником света в испытательной камере является 660 нм светодиодные панели.
5. Когда завершения испытания, снимите сито и поведение камеры. Поднимите тестирования пластину с сито и удалить мух, погружая пластинку в лед. Аккуратно очистить тарелку с горячей водой и удалите агарозном мусора. Поместите тестирования пластины в сушильном шкафу для удаления влаги.
6. Проветривать помещение тестирования, повернув на Смальл вентилятора в течение примерно 2 мин. Переключите вентилятор и загрузить следующую группу мух в следующем тестирования пластины.

7. Анализ данных с помощью программного обеспечения на заказ

"Анализ данных для Fly слежения шесть зон" можно найти в разделе Справочная Files. Во время сбора данных, программное обеспечение приобретения записей индивидуальная позиция муха координаты для каждого момента времени в виде текстового файла. Один цифровая камера расположена над испытательных пластин получает изображения с частотой кадров 0,5 Гц. Программа программное обеспечение для анализа "Анализ данных для Fly Отслеживание шесть зон" извлекает информацию из этого текстового файла) рассчитать среднюю скорость, б) определить момент времени, в который муха удачно расположен источник запаха, и в) строительство графические окна которые позволяют пользователю просматривать: расположение, расстояние лету летать от источника запаха с течением времени и средней скорости лету с течением времени. Он также форматирует данные для легкого экспорта в SPREadsheet программа. В этой макрокоманды, пищевой задержки поиск определяется как момент времени, в который летит провести по крайней мере 5 сек в течение 5 мм радиус центре арены с.

1. Откройте файл программного обеспечения анализ "Анализ данных для Fly Tracking - Шесть зоны". На вкладке "Windows", нажмите на кнопку "Создать новую таблицу." Повторите этот шаг, пока шесть столов не были созданы.
2. На вкладке "Макрос", нажмите "Foodfinding." Главная панель должна появиться со следующими параметрами: Файл Открыть необработанных данных для макета; Файл Открыть необработанных данных для файла данных; Fly Расположение; Расстояние; Скорость; Макет; FormatDataFile.
3. Для просмотра исходных данных без добавления значения в текстовый файл, нажмите на кнопку "Файл Открыть исходные данные для макета." Найдите и выберите экспериментальный файл данных в окне браузера, которое появляется. Нажмите на кнопку "Открыть".
4. Нажмите на кнопку "Fly Откуда", чтобы просмотреть местоположение каждого мухи в каждой из шести арен (шесть XY участков, изображающие каждый муху »с позиции с течением времени должен появиться на экране).
5. Нажмите на "расстояние", чтобы посмотреть расстояние каждого мухи от источника запаха (шесть участков, изображающие расстояние мухи от источника запаха с течением времени должен появиться на экране). Горизонтальная линия на у = 5 мм указывает порог, при котором муха считается расположенный на источник питания.
6. Нажмите на "Speed", чтобы посмотреть среднюю скорость каждого мухи в ходе судебного разбирательства (шесть участков, изображающие скорость мухи со временем должна появиться на экране).
7. Нажмите на кнопку "Макет", чтобы отобразить макет со всеми муха расположение, расстояние, и скорость графиков в дополнение к средней скорости (в течение первых 50 сек) и латентности найти источник запаха для каждого лету (рис. 1). Для нормального просмотра макета, это может быть необходимо для настройки полей. Чтобы сделать это, сначала нажмите на окне макета. На вкладке "Файл", нажмите кнопку "Параметры страницы для разметки." Сброс поля до0.2 дюйма и нажмите "OK". Сразу слева от каждого местоположения участка составляет маленький стол с заголовками "Скорость" и "Latency". Значения, введенные под одной рубрикой указывают среднюю скорость в мм / сек и задержки поиска пищи в секундах. Пустые записи под Latency указывают муха не удалось найти источник запаха. Продукты задержки поиск определяется как момент времени, в который мухи отработавшего по крайней мере 5 сек в течение 5 мм радиуса от центра камеры а.
8. Для печати отчета нажмите на область макета (обновления макета для текущего файла). В меню "Файл", а затем нажмите "Разметка".
9. Для просмотра следующего файла, просто нажмите на "открытия файла необработанных данных для макета." Нажмите на следующем файле сырых данных, который вы хотите посмотреть и нажмите "ОК". Нажмите на окно Макет для обновления окна с новым файлом данных.
10. Настройки могут быть сохранены в файл эксперимента для последующего использования.

8. Экспортировать данные изПрограммное обеспечение для анализа данных в программу электронной таблицы

1. Чтобы экспортировать скорость и задержки данных для каждого файла, нажмите на кнопку "Открыть файл исходных данных для файла данных." Выберите экспериментальный файл данных и нажмите "Open". Появится новое окно браузера.
2. В новом окне браузера, щелкните правой кнопкой мыши на "Новый", а затем нажмите "Текстовый документ". Назовите новый текстовый документ. Выберите только по имени текстовый файл и нажмите на кнопку "Открыть". Это хранит данные от исходного файла данных в текстовом файле.
3. Чтобы экспортировать данные из другого файла, нажмите кнопку "Файл Открыть исходные данные для файла данных." Нажмите на другой файл и нажмите "Открыть". Выберите текстовый файл со стадии 8.2). Продолжайте этот процесс для остальных файлов данных, которые вы хотите экспортировать.
4. После того, как все нужные файлы данных, которые были добавлены в текстовый файл, нажмите на кнопку "Формат файла данных." Выберите Текстовый документ, используемый для хранения данных из предыдущих шагов и нажмите "Open" (новую Windoж автоматически откроется).
5. Создайте новый текстовый документ в окне, назначить файл имя, и нажмите "Сохранить". Это создает текстовый файл, содержащий имя файла, среднюю скорость, и время ожидания для каждого летать и могут быть импортированы в программу электронных таблиц.
6. Полезных участки построены на основе данных о общего числа мух достижения целевой пищевого запаха в зависимости от времени (рис. 3).
7. Экспериментальные наборы данных проанализированы на статистическую значимость с использованием Z-теста для пропорциях.

Результаты

Программное обеспечение для анализа данных и макет, пример которого можно увидеть на рисунке 1, используются для оценки работы каждого мухи во время его 10 мин суде в соответствии с набора критериев анализа. Следующие критерии используются для определения, будет ли использоват...

Обсуждение

В этом протоколе, мы описываем процедуру шаг за шагом для поиска пищи поведения анализа. В дополнение к еде, связанных с запахами, он также может быть приспособлен для изучения способности мухи, чтобы найти другие объекты запах. Например, она может быть применена к изучению поведения ло?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple Cider Vinegar	Spectrum		commercially available
Agarose, Type VII	Sigma-Aldrich	A0701	low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate		custom	Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens	National Instruments	780024-01	Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate	Edmund Optics	custom	Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight	Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply	GW Instek	GPS-1830D	Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard	Digikey	922354-ND	Breadboard for LEDs