A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

Resumo

Para muitos animais, a fome promove mudanças no sistema olfativo de uma forma que facilita a busca de fontes de alimentos apropriados. Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta. Em uma caixa à prova de luz iluminado por uma luz vermelha que é invisível para as moscas de fruta, uma câmera ligada ao software de aquisição de dados personalizado monitora a posição de seis moscas simultaneamente. Cada mosca se limita a caminhar em arenas individuais contendo um odor de alimentos no centro. As arenas de ensaio repousar sobre um piso poroso que funciona para prevenir a acumulação de odor. A latência para localizar a fonte de odor, uma métrica que reflecte a sensibilidade olfactiva em diferentes estados fisiológicos, é determinada por análise de software. Aqui, discutimos os mecanismos críticos de executar este paradigma comportamental e abranger questões específicas sobre mosca loading, a contaminação odor, temperatura do ensaio, a qualidade dos dados e análise estatística.

Introdução

Unidos da fome promover dois tipos de comportamentos apetitivas: busca de alimentos e consumo de alimentos ^1. Este ensaio comportamental simples é útil para o estudo de comportamentos quimiotáticos associados forrageamento ^2,3. Especificamente, ele rastreia a posição da mosca, velocidade de caminhada e latência para localizar um alvo odor de alimentos. Latência de encontrar comida serve como métrica para medir as mudanças na sensibilidade do sistema de detecção de odor da mosca a jusante das alterações no seu estado appetitive interno. Uma versão manual deste ensaio foi utilizado anteriormente para mostrar a sinalização do receptor de GABA-B é importante para o comportamento odor localização em moscas adultas ^3. A versão automatizada atual do ensaio foi fundamental para o estudo de como curto-neuropeptídeo F (SNPF) sinalização remodela o mapa olfativo em Drosophila e influências apetitivo comportamentos ^2.

O teste é realizado a uma temperatura e humidade ambiente escuro, controlado. Digitalcâmeras de vídeo definidas acima das placas de teste de acrílico transparente controlar moscas backlit pelo 660-nm iluminação LED. Informações da câmara é processada em tempo real por um computador estacionado próximo à área de testes. Nós usamos o software de aquisição de dados para gravar e salvar as coordenadas de posições voar durante o período de testes.

Neste paradigma, o sujeito é liberado em uma arena que contém um odor de alimentos no centro, o objeto odor cria um gradiente de odor de alimentos dentro da arena, que induz o comportamento de busca de alimentos em tempo real. Um protocolo semelhante busca odor tem sido aplicado para o estudo de chemosensation em larvas Drosophila único ^7. Enquanto outros ensaios comportamentais, tais como o de quatro campos olfatômetro ^4,5 ou o t-labirinto ⁶ avaliar odor aversão ou atração comportamentos, este paradigma é o mais adequado para avaliar a sensibilidade e de quimiotaxia comportamentos olfativos.

Vários principais vantagens acompanhar esta assay. Primeiro, ele permite a aquisição rápida de grandes conjuntos de dados, porque a coleta de dados e análise são principalmente automatizado. Em segundo lugar, este ensaio isola e mede o comportamento das moscas individuais, eliminando, assim, os sinais sociais olfativos que podem influenciar seus comportamentos. Em terceiro lugar, a simplicidade do protocolo e design experimental simples fazer o teste eficiente e fácil de ensinar aos outros.

Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar mais circuitos neurais subjacentes ao comportamento de busca de alimentos combinando-a com o grande conjunto de ferramentas genéticas disponíveis para Drosophila melanogaster ^8. Expressão Targeted de transgenes que o silêncio ou excitar neurônios pode ser conseguido com ferramentas como o sistema GAL4-UAS, bem como o ^TS1 UAS-Shibire, UAS-tétano-toxina, e UAS-TRPA1 (B) transgenes ^9-12.

Protocolo

1. Fly Recolha e fome

1. Rear as moscas experimentais sob condições de temperatura e umidade controladas (por exemplo, 21 ° C, 50-60% de umidade relativa) em um ciclo claro / escuro de 12 horas.
2. Colete feminino voa no dia da eclosão e colocá-los, juntamente com 4-5 machos, em novos frascos de alimentos (máximo de 30 por frasco). Idade voa de 2-5 dias.
3. Prepare as câmaras, fly fome.
   1. Empurrar um único tecido (4,8 x 8,4 polegadas) para a parte inferior de um frasco de plástico vazio. Molhar o tecido com água destilada. Use um objeto para empurrar para baixo sobre o tecido e esprema delicadamente o excesso de água.
   2. Inverta o frasco para descartar a água extra. Deve haver água suficiente para manter as moscas hidratado e da câmara de fome úmido, mas não o suficiente para afogar as moscas.
4. Transfira as moscas do frasco de comida em uma câmara de fome e ligar o frasco cerca de 18-24 horas antes do experimento começa. Armazenar ofrascos sob condições de temperatura e humidade controladas durante a noite até que o experimento começa no dia seguinte.

2. Preparação do Odor Alimentação

1. Prepara-se uma solução de agarose a 1% através da adição de 0,1 g de agarose de baixa temperatura de fusão de 10 ml de água destilada em um balão de vidro. Aquecer a solução de agarose em um forno de microondas apenas até que comece a ferver, mas bem antes que ferve.
   1. Pare o microondas e agite o frasco uma vez. Repita este passo mais duas vezes até que a agarose foi completamente dissolvido. Manter a solução de agarose, num estado líquido, mantendo o frasco quente numa placa de aquecimento fixada em 50 ° C.
2. Adicionar 990 mL da solução de agarose a 1% e 10 ml de vinagre de maçã para um tubo de 1,5 ml Eppendorf para fazer uma solução de 1% de vinagre de maçã. Vortex a solução até mista e coloque em uma incubadora de banho seco definido como 50 ° C.

3. Quarto Testing and Behavior Setup Câmara

1. Definir a sala de ensaios para as condições desejadas (por exemplo, temperatura e umidade).
2. Ligue o painel de LED (660 nm).
3. Lavar as peneiras e placas de teste com água quente e aquecê-los em um forno de secagem até que toda a umidade evapore. Arrefecer as peneiras e placas para baixo para a temperatura ambiente de testes antes dos experimentos iniciais.
4. Posicionar um prato raso na parte superior da placa difusora e enchê-lo com água para aumentar a humidade local e para mascarar a água na gota de agarose.
5. Posicione as peneiras sobre o prato de água.

4. Voar Carregando nas placas de teste

Diagramas com especificações para placas de teste pode ser encontrada na seção de arquivos complementares. A placa de teste é feita de acrílico transparente e é composto por 6 arenas de teste. Um controle deslizante simples contém câmaras de exploração que permitem o carregamento mosca, a contenção temporária e lançamento simultâneo de 6 moscas em suas respectivas câmaras emo início da experiência. -Mira gravadas no centro de cada área na placa indicar onde odorantes deve ser pipetada.

1. Insira os controles deslizantes para a placa de testes de acrílico.
2. Deslize suavemente o aspirador para o frasco após o tampão de algodão e permitir que cerca de 6 moscas para entrar no aspirator.it é fundamental para ser o mais suave possível em manuseá-los. Pode-se tirar proveito do comportamento da mosca fototáxico para induzir moscas a rastejar em direção ao aspirador, apontando a abertura do frasco para uma fonte de luz fraca. Se necessário, pode-se também aplicar sucção suave para aspirar aproximadamente 6 moscas do sexo feminino.
3. Inserir a extremidade do aspirador no primeiro orifício da placa de teste. Permitir uma única mosca passar para a cela e gentilmente avançar o controle deslizante para a frente para carregar uma mosca para o próximo buraco. Continue até que todos os 6 moscas ocupam celas da placa.
4. Pipetar 5 ul de solução de agarose de vinagre de cidra de maçã 1% directamente sobre o centro da crOSS-pêlos na face interior da placa de teste.

5. Posicionando a placa de teste

1. Para centralizar a placa de teste, abra o arquivo chamado "Posicionamento Tool.vi." "LabVIEW VI para o posicionamento da ferramenta. vi podem ser encontrados na seção Arquivos Suplementar. Execute o arquivo, clicando na seta branca no canto superior esquerdo da tela.
2. Colocar a placa de teste no topo do crivo de modo a que a área de abertura voltada para o chão peneira e o alvo é o odor no tecto da placa. Alinhe a mira gravado em volta da placa de teste com a mira na tela do monitor.
3. Quando o alinhamento tenha sido concluída, abortar a execução clicando no ponto vermelho localizado perto do canto superior esquerdo do monitor.

6. Registre o Fly Posição durante o experimento

1. Para acompanhar e registrar as coordenadas da mosca durante cada tentativa de busca de alimentos, abra o arquivo de software de aquisição de "Fly Tracking - Seis Zones.vi "LabVIEW VIs para" Fly Tracking -. Seis Zones.vi "pode ​​ser encontrado na seção Arquivos Suplementar Execute o arquivo, clicando na seta branca no canto superior esquerdo do monitor. .
2. Atribua um nome ao arquivo e clique em "OK".
3. Avance os controles deslizantes nas câmaras de teste para liberar as moscas nas arenas de teste. Tenha cuidado para não mover as câmaras de teste, pois isso levará a alinhamento impróprio com coordenadas de software de análise.
4. Clique em "Start" (gravação começa) e garantir que a única fonte de luz na câmara de teste é o painel de LED a 660 nm.
5. Quando o julgamento for concluído, retire a peneira e câmara de comportamento. Levante a placa de testes da peneira e remover as moscas, submergindo a placa de gelo. Limpe suavemente a placa com água quente e remover todos os detritos de agarose. Colocar as placas de ensaio em uma estufa de secagem para remover a humidade.
6. Ventile a área de teste, rodando em um small fã durante cerca de 2 min. Gire o ventilador desligado e carregar o próximo grupo de moscas na próxima placa de teste.

7. Análise de Dados Utilizando Software

"Análise de Dados para Fly rastreamento em seis zonas" podem ser encontrados na seção Arquivos Suplementar. Durante a aquisição de dados, coordena o programa de aquisição de registros de posição mosca individual para cada ponto de tempo em um arquivo de texto. A única câmera digital posicionada acima das placas de teste adquire imagens com uma taxa de quadros de 0,5 Hz. O programa de software de análise de "Análise de Dados para a mosca-Tracking seis zonas" extrai informações a partir desse arquivo de texto para a) calcular a velocidade média, b) determinar o ponto de tempo em que uma mosca localizado com sucesso a fonte odor, e c) construir janelas gráficas que permitem que o usuário vista: localização, distância da mosca voar a partir da fonte odor ao longo do tempo e velocidade média mosca ao longo do tempo. Ele também formata os dados para facilitar a exportação em um spreprograma adsheet. Nesta macro, a latência de pesquisa alimento é definida como o ponto temporal em que voa passar, pelo menos, 5 segundos dentro de um raio de 5 mm acima do centro da arena.

1. Abra o arquivo de software de análise de "Análise de Dados para Fly Tracking - seis zonas". Na aba "Windows", clique em "Create New Table". Repita este passo até seis mesas foram criadas.
2. Na guia "macros", clique em "Foodfinding". Um painel principal deve aparecer com as seguintes opções: Open Data Arquivo primas para layout; Open Data Arquivo primas para arquivo de dados; Fly Localização; Distância; velocidade; layout; FormatDataFile.
3. Para visualizar os dados brutos, sem acréscimo de valores em um arquivo de texto, clique em "Abrir arquivo de dados brutos para o Layout." Localize e selecione o arquivo de dados experimental na janela do navegador que aparece. Clique em "Abrir".
4. Clique em "Fly Location" para ver a localização de cada mosca em cada uma das seis arenas (seis parcelas XY retratando cada mosca 's posição ao longo do tempo deve aparecer na tela).
5. Clique em "Distância" para ver a distância de cada mosca da fonte de odor (seis parcelas retratando distância da mosca da fonte de odor ao longo do tempo deve aparecer na tela). A linha horizontal em y 5 mm indica o limiar para o qual a mosca é considerado para ser localizado na fonte de alimento.
6. Clique em "Speed" para ver a velocidade média de cada mosca durante o julgamento (seis parcelas retratando a velocidade da mosca ao longo do tempo deve aparecer na tela).
7. Clique em "Layout" para exibir um layout com todos os localização mosca, distância, velocidade e gráficos, além de a velocidade média (durante os primeiros 50 seg) e latência de encontrar a fonte de odor para cada mosca (Figura 1). Para visualizar adequadamente a disposição, pode ser necessário ajustar as margens. Para fazer isso, primeiro clique na janela de layout. Sob a guia "Arquivo", clique em "Configurar Página para Layout." Repor as margens para0,2 polegadas e clique em "OK". Imediatamente deixou de cada parcela localização é uma pequena mesa com os títulos de "Speed" e "Latência". Os valores inseridos em cada ponto indicam a velocidade média em mm / seg e pesquisa de alimentos latência em segundos. Entradas em branco sob Latência indicam a mosca não conseguiu localizar a fonte de odor. Alimentação latência de pesquisa é definido como o ponto no tempo em que as moscas passou pelo menos 5 segundos dentro de um raio de 5 mm a partir do centro da câmara.
8. Para imprimir um layout, clique na área de layout (atualizações de layout para o arquivo atual). Clique em "Arquivo" e depois clique em "Layout de impressão."
9. Para visualizar o próximo arquivo, basta clicar em "Abrir Arquivo de Dados-prima para Layout." Clique no seguinte arquivo de dados brutos que você deseja ver e clique em "OK". Clique na janela de Layout para atualizar a janela com o novo arquivo de dados.
10. As configurações podem ser salvos em um arquivo de experimento para uso posterior.

8. Exportar dados deo software de análise de dados para um programa de planilha

1. Para exportar dados de velocidade e latência para cada arquivo, clique em "Open Data Arquivo primas para arquivo de dados." Selecione um arquivo de dados experimentais e clique em "Abrir". Uma nova janela do navegador aparecerá.
2. Na nova janela do navegador, clique com o botão direito em "Novo" e depois clique em "Documento de texto." Nome do novo documento de texto. Selecione o arquivo de texto recém-nomeado e clique em "Abrir". Ele armazena os dados do arquivo de dados brutos para o arquivo de texto.
3. Para exportar dados de outro arquivo, clique em "Abrir Arquivo de Dados-prima para arquivo de dados." Clique em outro arquivo e clique em "Abrir". Selecione o arquivo de texto a partir do passo 8.2). Continue esse processo para os arquivos de dados restantes que deseja exportar.
4. Uma vez que todos os arquivos de dados desejadas tenham sido adicionadas ao arquivo de texto, clique em "Formato de Arquivo de Dados." Selecione o documento de texto usado para armazenar os dados dos passos anteriores e clique em "Abrir" (um novo window irá abrir automaticamente).
5. Crie um novo documento de texto na janela, atribuir um nome ao arquivo e clique em "Salvar". Isso cria um arquivo de texto que contém o nome do arquivo, velocidade média, e latência para cada voar e pode ser importado para um programa de planilha.
6. Parcelas cumulativas são construídos a partir de dados sobre o número total de moscas que atingem o alvo odor de alimentos como uma função do tempo (Figura 3).
7. Conjuntos de dados experimentais são analisados ​​para significância estatística usando um teste z para proporções.

Resultados

O software de análise de dados e a disposição, um exemplo dos quais pode ser visto na Figura 1, são utilizados para avaliar o desempenho de cada mosca durante a sua 10 min ensaio de acordo com um conjunto de critérios de análise. Os seguintes critérios são utilizados para determinar se os dados de cada mosca serão utilizados para análise de dados e são projetados para eliminar as moscas que não são capazes de realizar a tarefa de busca de alimentos, devido a lesão, doença, estresse ou fal...

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para o ensaio de comportamento de busca de alimentos. Além de odores alimentares relacionados com, mas também pode ser adaptada para o estudo da capacidade de voar para localizar outros objectos de odor. Por exemplo, ele pode ser aplicado para o estudo do comportamento de localização mate em moscas macho ³ Há várias considerações adicionais para este protocolo que vamos mencionar aqui em relação a este procedimento.:

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple Cider Vinegar	Spectrum		commercially available
Agarose, Type VII	Sigma-Aldrich	A0701	low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate		custom	Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens	National Instruments	780024-01	Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate	Edmund Optics	custom	Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight	Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply	GW Instek	GPS-1830D	Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard	Digikey	922354-ND	Breadboard for LEDs