Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

En este artículo de vídeo, se describe un ensayo automatizado para medir el efecto del hambre o la saciedad en el comportamiento de búsqueda de comida dependiente olfativo en la mosca adulta fruta Drosophila melanogaster.

Resumen

Para muchos animales, el hambre promueve cambios en el sistema olfativo de una manera que facilita la búsqueda de las fuentes de alimentos apropiados. En este artículo de vídeo, se describe un ensayo automatizado para medir el efecto del hambre o la saciedad en el comportamiento de búsqueda de comida dependiente olfativo en la mosca adulta fruta Drosophila melanogaster. En una caja hermética a la luz iluminada por la luz roja que es invisible para moscas de la fruta, una cámara vinculada al software de adquisición de datos personalizadas controla la posición de las seis moscas simultáneamente. Se limita Cada mosca caminar en arenas individuales que contienen un olor de comida en el centro. Las arenas de prueba descansan sobre un suelo poroso que sirve para evitar la acumulación de olores. Latencia para localizar la fuente de olor, una medida que refleja la sensibilidad olfativa en diferentes estados fisiológicos, se determina mediante análisis de software. Aquí, vamos a discutir la mecánica críticos de la gestión de este paradigma conductual y cubrimos cuestiones específicas relativas a loadi moscang, la contaminación de olores, la temperatura de ensayo, la calidad de los datos, y el análisis estadístico.

Introducción

Estados de promover el hambre dos tipos de comportamientos del apetito: búsqueda de alimentos y consumo de alimentos ^1. Este ensayo de comportamiento simple es útil para el estudio de los comportamientos asociados con la búsqueda de alimento quimiotácticos ^2,3. En concreto, hace un seguimiento de la posición marcha, la velocidad al caminar y la latencia para localizar un blanco de olor de los alimentos. Latencia de hallazgo de alimentos sirve como métrica para medir los cambios en la sensibilidad del sistema de detección de olor de la mosca aguas abajo de los cambios en su estado de apetencia interna. Una versión manual de este ensayo se utilizó previamente para mostrar la señalización del receptor de GABA-B es importante para el comportamiento de olor localización en moscas adultas ^3. La actual versión automatizada de la prueba fue fundamental en el estudio de cómo corto neuropéptido F (sNPF) Señalización remodela el mapa olfativa en Drosophila y las influencias apetitiva comportamientos ^2.

La prueba se realiza en una habitación oscura, temperatura y humedad controladas. Digitalcámaras de vídeo que figuran por encima de las placas de prueba de acrílico claras seguimiento moscas retroiluminada por 660 nm de la iluminación LED. Información de la cámara es procesada en tiempo real por un ordenador colocado junto a la zona de pruebas. Utilizamos el software de adquisición de datos para registrar y guardar las coordenadas de las posiciones de la mosca durante el periodo de prueba.

En este paradigma, el sujeto se libera en una arena que contiene un olor del alimento en el centro; el objeto olor crea un olor gradiente de alimentos dentro de la arena que induce el comportamiento de búsqueda de comida en la mosca. Un protocolo similar de búsqueda de olores se ha aplicado hacia el estudio de chemosensation en solo larvas de Drosophila ^7. Mientras que otros ensayos de comportamiento como el de cuatro campos olfatómetro ^4,5 o el t-laberinto ⁶ evalúan olor de aversión o atracción comportamientos, este paradigma es el más adecuado para evaluar la sensibilidad y la quimiotaxis comportamientos olfativas.

Varias ventajas clave acompañan esta assaY. En primer lugar, permite la adquisición rápida de grandes conjuntos de datos, debido a la recolección y análisis de datos son en su mayoría automatizado. En segundo lugar, este ensayo aísla y mide el comportamiento de las moscas individuales, eliminando así las señales sociales olfativos que pueden influir en su comportamiento. En tercer lugar, la sencillez del protocolo y el diseño experimental sencillo hacer el ensayo eficaz y fácil de enseñar a otros.

Además, este ensayo puede ser utilizada para explorar aún más circuitos neurales que subyacen el comportamiento de búsqueda de alimentos mediante la combinación con la caja de herramientas genética extensa disposición de Drosophila melanogaster ^8. Expresión dirigida de transgenes que el silencio o excitar las neuronas se pueden lograr con herramientas como el sistema GAL4-UAS, así como la ^ts1 UAS-shibire, UAS-tétanos-toxina, y UAS-TRPA1 (B) transgenes ^9-12.

Protocolo

1. Fly Collection y el hambre

1. Posterior a las moscas experimentales bajo condiciones de temperatura y humedad controladas (por ejemplo, 21 ° C, humedad relativa 50-60%) en un 12 hr luz / oscuridad ciclo.
2. Recoger las moscas hembra en el día de la eclosión y colocarlos, junto con 4-5 machos, en nuevos frascos de comida (máximo 30 por vial). Edad vuela 2-5 días.
3. Preparar las cámaras de hambre mosca.
   1. Empuje un único tejido (4,8 x 8,4 pulgadas) hasta el fondo de un frasco de plástico vacía. Completamente empape el tejido con agua destilada. Utilice un objeto para empujar hacia abajo en el tejido y apretar suavemente el exceso de agua.
   2. Invierta el frasco para desechar el exceso de agua. Debe haber suficiente agua para mantener las moscas hidratados y la cámara de la inanición húmeda, pero no lo suficiente como para ahogar a las moscas.
4. Transfiera las moscas del frasco de comida en una cámara de la inanición y conecte el vial sobre 18-24 horas antes de que comience el experimento. Guarde elviales bajo condiciones de temperatura y humedad controladas durante la noche hasta el experimento comienza el día siguiente.

2. Preparación del olor del alimento

1. Preparar una solución de agarosa al 1% mediante la adición de 0,1 g de agarosa de baja temperatura de fusión a 10 ml de agua destilada en un matraz de vidrio. Calentar la solución de agarosa en el microondas justo hasta que comience a hervir, pero mucho antes de que hierva de nuevo.
   1. Detener el microondas y agitar el frasco una vez. Repita este paso dos veces más hasta que la agarosa se haya disuelto completamente. Mantenga la solución de agarosa en estado líquido, manteniendo el frasco caliente sobre una placa caliente a 50 ° C.
2. Añadir 990 l de la solución de agarosa al 1% y 10 l de vinagre de sidra de manzana a un tubo Eppendorf de 1,5 ml para obtener una solución de vinagre de sidra de manzana 1%. Vortex la solución hasta que se mezcle y coloque en una incubadora de baño seco ajustado a 50 ° C.

3. Sala de pruebas y configuración Cámara Comportamiento

1. Establecer la sala de pruebas a las condiciones deseadas (por ejemplo, temperatura y humedad).
2. Encienda el panel de LED (660 nm).
3. Enjuague las cribas y placas de ensayo con agua caliente y calentar en un horno de secado hasta que toda la humedad se haya evaporado. Enfriar los tamices y los platos a la temperatura ambiente antes de la prueba los experimentos iniciales.
4. Coloque un plato poco profundo en la parte superior de la placa difusora y llenarlo con agua para aumentar la humedad local y para enmascarar el agua de la gota de agarosa.
5. Colocar los tamices en el plato de agua.

4. Vuela Cargando en las placas de ensayo

Diagramas con las especificaciones de las placas de prueba se pueden encontrar en la sección Archivos Suplementarios. La placa de la prueba está hecha de acrílico transparente y consta de 6 escenarios de prueba. Un sencillo control deslizante contiene cámaras de retención que permiten la carga de la mosca, la contención temporal, y la liberación simultánea de 6 moscas en sus respectivas cámaras enel inicio del experimento. Cruz filar grabadas en el centro de cada escenario en la placa indican dónde odorantes deben pipetearse.

1. Inserte los controles deslizantes en la placa de pruebas de acrílico.
2. Deslice suavemente el aspirador en el vial más allá del tapón de algodón y permiten unos 6 moscas a pie hasta el aspirator.it es fundamental para ser lo más suave posible en el manejo de ellos. Uno puede tomar ventaja de la conducta mosca fototácticas para inducir moscas a arrastrarse hacia el aspirador al señalar la apertura vial hacia una fuente de luz tenue. Si es necesario, también se puede aplicar una suave succión para aspirar aproximadamente 6 moscas hembras.
3. Inserte la punta del aspirador en el primer agujero de la placa de la prueba. Permitir una sola mosca pase a la celda de detención y suavemente avanzar el cursor hacia adelante para cargar una mosca en el siguiente hoyo. Continúe hasta moscas ocupan los 6 celdas de detención de la placa.
4. Pipetear 5 l de solución de agarosa de sidra de manzana vinagre 1% directamente sobre el centro de la CRoss-pelos en la cara interior de la placa de la prueba.

5. Colocación de la placa de pruebas

1. Para centrar la plancha de prueba, abra el archivo llamado "Posicionamiento Tool.vi." "LabVIEW VI para la herramienta de posicionamiento. vi se pueden encontrar en la sección Archivos Suplementarios. Ejecute el archivo haciendo clic en la flecha blanca en la esquina superior izquierda de la pantalla.
2. Coloque la placa de prueba en la parte superior del tamiz de manera que la abertura Arena enfrenta el piso de tamiz y el objetivo es el olor en el techo de la placa. Alinear el punto de mira grabadas en parte posterior de la plancha de prueba con la mira en la pantalla del monitor.
3. Cuando la alineación se ha completado, abortar la ejecución haciendo clic en el punto rojo situado cerca de la esquina superior izquierda de la pantalla.

6. Registre el Fly Posición durante el experimento

1. Para realizar un seguimiento y registrar las coordenadas de la marcha durante cada ensayo de búsqueda de alimentos, abra el archivo de software de adquisición "Fly seguimiento -. Seis Zones.vi "LabVIEW VIs para" Tracking Fly - Seis Zones.vi "se pueden encontrar en la sección Archivos Suplementarios Ejecute el archivo haciendo clic en la flecha blanca en la esquina superior izquierda de la pantalla. .
2. Asigne un nombre al archivo y haga clic en "Aceptar".
3. Avanzar en los controles deslizantes en las cámaras de prueba para liberar las moscas en las arenas de prueba. Tenga cuidado de no mover las cámaras de prueba, ya que esto dará lugar a la alineación incorrecta con coordenadas de software de análisis.
4. Haga clic en "Start" (comienza la grabación) y asegúrese de que la única fuente de luz en la cámara de pruebas es el panel LED de 660 nm.
5. Una vez finalizada la prueba, retire el tamiz y la cámara de comportamiento. Levante la placa de la prueba del tamiz y retire las moscas al sumergir la placa de hielo. Limpie suavemente la placa con agua caliente y eliminar los residuos de agarosa. Colocar las placas de ensayo en un horno de secado para eliminar la humedad.
6. Ventilar la zona de pruebas mediante la activación de un small ventilador durante aproximadamente 2 min. Apague el ventilador y cargar el siguiente grupo de moscas en la placa de la prueba siguiente.

7. Análisis de datos mediante software por pedido

"Análisis de Datos para Fly seguimiento en seis zonas" se puede encontrar en la sección Archivos Suplementarios. Durante la adquisición de datos, la posición de la mosca individuo registros de software de adquisición de coordenadas de cada punto en un archivo de texto en tiempo. Una cámara digital único situado por encima de las placas de prueba adquiere imágenes a una velocidad de 0,5 Hz. El programa de software de análisis de "Análisis de datos para Fly Tracking-seis zonas" extrae la información de ese archivo de texto que a) calcular la velocidad media, b) determinar el punto de tiempo en el que una mosca se encuentra con éxito la fuente de olor, y c) crear ventanas gráficas que permitirá al usuario ver: la ubicación, la distancia de la mosca vuela desde la fuente de olor con el tiempo y la velocidad media mosca con el tiempo. También da formato a los datos para facilitar la exportación en un spreprograma adsheet. En esta macro, la búsqueda de latencia alimentaria se define como el punto en el tiempo que vuela pasar por lo menos 5 segundos dentro de un radio de 5 mm del centro de la arena.

1. Abra el archivo de software de análisis de "Análisis de datos para el seguimiento de la mosca - seis zonas". Bajo la pestaña "Windows", haga clic en "Crear nueva tabla." Repita este paso hasta que se hayan creado seis mesas.
2. Bajo la pestaña "Macros", haga clic en "Foodfinding." Un Panel principal debería aparecer con las siguientes opciones: Open Data Archivo sin formato para el diseño, Open Data Archivo sin formato de archivo de datos; Fly Location; Distancia, velocidad, diseño, FormatDataFile.
3. Para ver los datos en bruto sin anexar valores a un archivo de texto, haga clic en "Abrir archivo de datos sin procesar para el diseño." Busque y seleccione el archivo de datos experimental en la ventana del navegador que aparece. Haga clic en "Abrir".
4. Haga clic en "Fly Location" para ver la ubicación de cada marcha en cada uno de los seis escenarios (seis parcelas XY representan cada mosca 's posición con el tiempo debería aparecer en la pantalla).
5. Haga clic en "Distance" para ver la distancia de cada mosca de la fuente de olor (seis parcelas que representan la distancia a la mosca de la fuente de olor con el tiempo deben aparecer en la pantalla). La línea horizontal en y = 5 mm indica el umbral a partir del cual se considera que la marcha que se encuentra en el origen de los alimentos.
6. Haga clic en "Speed" para ver la velocidad media de cada mosca durante el ensayo (seis parcelas que representan la velocidad de la marcha con el tiempo deben aparecer en la pantalla).
7. Haga clic en "Formato" para visualizar una presentación con todas las moscas ubicación, distancia, velocidad y gráficos, además de la velocidad media (durante los primeros 50 segundos) y la latencia de encontrar la fuente de olor para cada vuelo (Figura 1). Para ver correctamente el diseño, puede ser necesario ajustar los márgenes. Para hacer esto, primero haga clic en la ventana de diseño. Bajo la pestaña "Archivo", haga clic en "Configuración de página para el diseño." Cambiar los márgenes de0.2 pulgadas y haga clic en "Aceptar". Inmediatamente a la izquierda de cada parcela lugar es una pequeña mesa con los títulos "Speed" y "latencia". Los valores introducidos en cada epígrafe indican la velocidad media en mm / seg y la latencia de la búsqueda de alimentos en cuestión de segundos. Entradas en blanco bajo Latencia indican la marcha no pudo localizar la fuente del olor. Búsqueda latencia alimentaria se define como el punto de tiempo en el que las moscas pasaron al menos 5 segundos dentro de un radio de 5 mm desde el centro de la cámara.
8. Para imprimir una presentación, haga clic en el área de disposición (layout actualizaciones de archivo actual). Haga clic en "Archivo" y luego haga clic en "Diseño de impresión".
9. Para ver el siguiente archivo, simplemente haga clic en "Abrir archivo de datos sin procesar para el diseño." Haga clic en el siguiente archivo de datos brutos que desea ver y haga clic en "Aceptar". Haga clic en la ventana de diseño para actualizar la ventana con el nuevo archivo de datos.
10. Los ajustes se pueden guardar en un archivo de experimento para su uso posterior.

8. Exportar datos deEl software de análisis de datos a una hoja de cálculo

1. Para exportar datos de velocidad y latencia para cada archivo, haga clic en "Open Data Archivo sin formato de archivo de datos." Seleccione un archivo de datos experimentales y haga clic en "Abrir". Aparecerá una nueva ventana del navegador.
2. En la nueva ventana del explorador, haga clic en "Nuevo" y luego haga clic en "Documento de texto". Nombre del nuevo documento de texto. Seleccione el archivo de texto recién nombrado y haga clic en "Abrir". Esto almacena los datos del archivo de datos brutos en el archivo de texto.
3. Para exportar datos desde otro archivo, haga clic en "Abrir archivo de datos brutos para archivo de datos." Haga clic en otro archivo y haga clic en "Abrir". Seleccione el archivo de texto del paso 8.2). Continúe este proceso para los archivos de datos restantes que desea exportar.
4. Una vez que todos los archivos de datos deseados se han añadido al archivo de texto, haga clic en "Formato de archivo de datos." Seleccione el documento de texto se utiliza para almacenar los datos de los pasos anteriores y haga clic en "Open" (un nuevo window se abrirá de forma automática).
5. Cree un nuevo documento de texto en la ventana, asigne un nombre al archivo y haga clic en "Guardar". Esto crea un archivo de texto que contiene el nombre del archivo, la velocidad media, y la latencia para cada vuelan y se pueden importar en un programa de hoja de cálculo.
6. Parcelas acumulativas se construyen a partir de datos sobre el número total de moscas alcanzar el objetivo olor del alimento como función del tiempo (Figura 3).
7. Los conjuntos de datos experimentales se analizan para la significación estadística utilizando una prueba z para proporciones.

Resultados

El software de análisis de datos y el diseño, un ejemplo de que se puede ver en la Figura 1, se utilizan para evaluar el rendimiento de cada mosca durante su prueba de 10 min de acuerdo con un conjunto de criterios de análisis. Los siguientes criterios se utilizan para determinar si los datos de cada una mosca se utilizarán para el análisis de datos y están diseñados para eliminar esas moscas que son incapaces de realizar la tarea de búsqueda de los alimentos debido a una lesión, enfermedad, es...

Discusión

En este protocolo, se describe un procedimiento paso a paso para el ensayo de comportamiento de búsqueda de alimento. Además de los olores relacionados con los alimentos, también se puede adaptar para el estudio de la capacidad de la mosca para localizar otros objetos de olor. Por ejemplo, se puede aplicar hacia el estudio de la yerba comportamiento localización en las moscas macho ³ Hay varias consideraciones adicionales para este protocolo que vamos a hablar aquí con respecto a este procedimiento.:

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple Cider Vinegar	Spectrum		commercially available
Agarose, Type VII	Sigma-Aldrich	A0701	low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate		custom	Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens	National Instruments	780024-01	Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate	Edmund Optics	custom	Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight	Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply	GW Instek	GPS-1830D	Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard	Digikey	922354-ND	Breadboard for LEDs