Une simple mouche Essai de comportement alimentaire dans<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Dans cet article, vidéo, nous décrivons un test automatisé pour mesurer l'effet de la faim ou de satiété sur le comportement dépend olfactif de recherche de nourriture dans le fruit de mouche adulte Drosophila melanogaster.

Résumé

Pour beaucoup d'animaux, la faim favorise des changements dans le système olfactif d'une manière qui facilite la recherche de sources de nourriture appropriés. Dans cet article, vidéo, nous décrivons un test automatisé pour mesurer l'effet de la faim ou de satiété sur le comportement dépend olfactif de recherche de nourriture dans le fruit de mouche adulte Drosophila melanogaster. Dans une boîte étanche à la lumière éclairé par une lumière rouge qui est invisible pour les mouches des fruits, une caméra reliée à un logiciel d'acquisition de données personnalisées surveille la position des six mouches simultanément. Chaque volée est limitée à marcher dans les arènes individuelles contenant une odeur de nourriture au centre. Les arènes de tests reposent sur ​​un sol poreux qui sert à prévenir l'accumulation d'odeurs. La latence pour localiser la source de l'odeur, une métrique qui reflète la sensibilité olfactive sous différents états physiologiques, est déterminée par analyse de logiciels. Ici, nous discutons les mécanismes essentiels de l'exécution de ce paradigme comportemental et portent sur des questions spécifiques relatives à la mouche loading, la contamination de l'odeur, de la température d'essai, la qualité des données, et l'analyse statistique.

Introduction

États de la faim promouvoir deux types de comportements d'appétit: la recherche de la nourriture et de consommation alimentaire ^1. Ce test comportemental simple est utile pour l'étude des comportements associés à la recherche de nourriture chimiotactiques ^2,3. En particulier, il permet de suivre la position de la mouche, la vitesse de marche et la latence à la localisation d'une cible de l'odeur des aliments. Latence de la recherche de nourriture sert métrique pour mesurer les changements dans la sensibilité du système de détection d'odeur de la mouche en aval de l'évolution de son état interne appétit. Une version manuelle de ce test a déjà été utilisé pour montrer la signalisation du récepteur GABA-B est important pour le comportement odeur de localisation en mouches adultes ^3. La version actuelle automatisé du test a contribué à l'étude de la façon dont court neuropeptide F (SNPF) signalisation remodèle la carte olfactive chez la drosophile et influences appétit comportements ^2.

Les tests sont effectués dans une pièce sombre de température et humidité contrôlées. Numériquecaméras vidéo fixées ci-dessus les plaques d'essai acrylique Clear Track vol rétro-éclairé par 660 nm éclairage LED. L'information depuis l'appareil photo est traitée en temps réel par un ordinateur stationné à côté de la zone de test. Nous utilisons un logiciel d'acquisition de données à enregistrer et sauvegarder les coordonnées de positions à la mouche au cours de la période d'essai.

Dans ce paradigme, l'objet est libéré dans une arène qui contient une odeur de nourriture au centre, l'objet d'odeur crée un gradient odeur de la nourriture dans l'arène qui induit la nourriture comportement de recherche dans la mouche. Une odeur protocole de recherche similaire a été appliquée vers l'étude des chemosensation en simple larves de drosophile ^7. Alors que d'autres tests comportementaux tels que le-champ quatre olfactomètre ^4,5 ou le t-labyrinthe ⁶ évaluer l'aversion ou attraction comportements d'odeur, ce paradigme est le mieux placé pour évaluer les comportements de sensibilité et de chimiotaxie olfactifs.

Plusieurs avantages clés accompagnent cette assay. Tout d'abord, il permet l'acquisition rapide de grands ensembles de données, car la collecte et l'analyse des données sont pour la plupart automatisées. Deuxièmement, cette analyse isole et mesure le comportement des mouches simples, éliminant ainsi les signaux olfactifs sociaux qui peuvent influencer leurs comportements. Troisièmement, la simplicité du protocole et de design expérimental simple faire le dosage efficace et facile à enseigner aux autres.

En outre, ce test peut être utilisé pour sonder davantage les circuits neuronaux sous-jacents alimentaire comportement de recherche en la combinant avec la boîte à outils génétique vaste disponible à Drosophila melanogaster ^8. Expression ciblée de transgènes silence ou exciter les neurones peuvent être obtenus avec des outils tels que le système GAL4 UAS ainsi que le ^SAMU-TS1 shibire, UAS-tétanos-toxine, et UAS-TRPA1 (B) transgènes ^9-12.

Protocole

Une. Fly Collection et famine

1. Arrière Les mouches expérimentales en température et d'humidité des conditions contrôlées (par exemple 21 ° C, 50-60% d'humidité relative) sur un cycle de lumière de 12 h / sombre.
2. Récupérer mouches femelles le jour de l'éclosion et les placer, avec 4-5 hommes, dans de nouveaux flacons alimentaires (maximum de 30 par flacon). Âge vole 2-5 jours.
3. Préparer les chambres pour voler la famine.
   1. Poussez un tissu unique (4,8 x 8,4 pouces) vers le bas d'un flacon en plastique vide. Complètement tremper le tissu avec de l'eau distillée. Utilisez un objet à pousser vers le bas sur le tissu et presser doucement l'excès d'eau.
   2. Retourner le flacon de jeter le surplus d'eau. Il devrait y avoir suffisamment d'eau pour garder les mouches hydratés et la chambre de la famine humide, mais pas assez pour noyer les mouches.
4. Transférer les mouches du flacon de la nourriture dans une chambre de la famine et de brancher le flacon sur 18-24 h avant le début de l'expérience. Rangez leflacons dans des conditions de température et d'humidité contrôlées durant la nuit jusqu'à ce que l'expérience commence le lendemain.

2. Préparation de l'odeur des aliments

1. Préparer une solution d'agarose à 1% par addition de 0,1 g de basse température de fusion d'agarose à 10 ml d'eau distillée dans un ballon en verre. Chauffer la solution d'agarose dans un micro-ondes juste jusqu'à ce qu'il commence à bouillir, mais bien avant, il déborde.
   1. Arrêtez le micro-ondes et agiter le flacon une fois. Répétez cette étape deux fois plus que l'agarose est complètement dissous. Conserver la solution d'agarose à l'état liquide en gardant le ballon au chaud sur une plaque fixée à 50 ° C.
2. Ajouter 990 ul de la solution d'agarose à 1% et 10 pi de vinaigre de cidre dans un tube Eppendorf de 1,5 ml pour obtenir une solution à 1% de vinaigre de cidre de pomme. Vortex la solution jusqu'à ce que mitigés et le placer dans un incubateur de bain sèche réglée à 50 ° C.

3. Test chambres et Comportement installation de chambre

1. Définir la salle d'examen pour les conditions souhaitées (par exemple, température et humidité).
2. Mettez le panneau de LED (660 nm).
3. Rincer les tamis et les plaques d'essai avec de l'eau chaude et faites-les chauffer dans un four de séchage jusqu'à ce que toute l'humidité soit évaporée. Refroidir les tamis et les plaques jusqu'à la température ambiante d'essai avant les expériences débutants.
4. Placez un plat peu profond sur le dessus de la plaque de diffusion et de le remplir avec de l'eau pour augmenter l'humidité locale et pour masquer l'eau dans la goutte d'agarose.
5. Placez les tamis sur le plat d'eau.

4. Fly Chargement en cours dans les plaques d'essai

Diagrammes avec des spécifications pour les plaques de test peuvent être trouvés dans la section Fichiers supplémentaires. La plaque d'essai est faite d'acrylique clair et se compose de 6 arènes de test. Un simple curseur contient chambres de retenue qui permettent mouche chargement, le confinement temporaire, et la libération simultanée de 6 mouches dans leurs chambres respectives àle début de l'expérience. Réticules gravés au centre de chaque scène dans la plaque indiquent où odorants doivent être déposés à la pipette.

1. Insérer les curseurs dans la plaque de test de l'acrylique.
2. Faites glisser doucement l'aspirateur dans le flacon au-delà du tampon de coton et permettre à environ 6 vol à pied dans le aspirator.it est essentiel d'être aussi doux que possible dans leur manipulation. On peut profiter de comportement de la mouche phototactiques pour induire vol à ramper vers l'aspirateur en soulignant l'ouverture du flacon vers une source de lumière faible. Si nécessaire, on peut aussi appliquer une aspiration douce pour aspirer environ 6 mouches femelles.
3. Insérer l'embout de l'aspirateur dans le premier trou de la plaque de test. Laisser une mouche de passer dans la cellule de détention et doucement avancer le curseur vers l'avant pour charger une mouche dans le trou suivant. Continuez jusqu'à ce que les mouches occupent tous les 6 cellules de détention de la plaque.
4. 5 ul de solution de vinaigre d'agarose à 1% de cidre de pomme directement sur le centre de la cross-poils sur la face interne de la plaque de test.

5. Positionnement de la plaque d'essai

1. Pour centrer la plaque de test, ouvrez le fichier nommé "Positionnement Tool.vi." "VI LabVIEW pour Outil de positionnement. vi peut être trouvé dans la section Fichiers supplémentaires. Exécutez le fichier en cliquant sur la flèche blanche dans le coin supérieur gauche de l'écran.
2. Placer la plaque de test au-dessus du tamis de sorte que l'ouverture fait face à la scène de la chaussée tamis et la cible d'odeur est présent dans le plafond de la plaque. Aligner les réticules gravés dans l'arrière de la plaque de test avec le réticule sur l'écran du moniteur.
3. Lorsque l'alignement est terminé, interrompre l'exécution en cliquant sur le point rouge situé dans le coin supérieur gauche de l'écran.

6. Enregistrer la position Fly cours de l'expérience

1. Pour suivre et d'enregistrer les coordonnées de la mouche au cours de chaque essai de recherche de la nourriture, ouvrez le fichier du logiciel d'acquisition "Fly Tracking - Six Zones.vi "VIs LabVIEW pour" Suivi Fly -. Six Zones.vi "peut être trouvé dans la section Fichiers supplémentaires Exécutez le fichier en cliquant sur la flèche blanche dans le coin supérieur gauche de l'écran. .
2. Attribuez un nom au fichier et cliquez sur "OK".
3. Avancer les curseurs dans les chambres d'essai pour libérer les mouches dans les arènes de test. Veillez à ne pas déplacer les chambres de test comme cela conduira à un mauvais alignement avec les coordonnées de logiciels d'analyse.
4. Cliquez sur "Démarrer" (l'enregistrement commence) et veiller à ce que la seule source de lumière dans la chambre d'essai est le panneau LED 660 nm.
5. Lorsque le procès est terminé, retirez le tamis et la chambre de comportement. Soulevez la plaque de test du tamis et enlever les mouches en immergeant la plaque de glace. Nettoyez délicatement la plaque avec de l'eau chaude et enlever tous les débris agarose. Placer les plaques d'essai dans un four de séchage pour éliminer l'humidité.
6. Aérer la zone de test en tournant sur un small ventilateur pendant environ 2 min. Arrêter le ventilateur et charger le prochain groupe de mouches dans la plaque de test suivante.

7. Analyse des données au moyen de logiciels personnalisés

"Analyse des données de suivi Fly-Six zones" peut être trouvé dans la section Fichiers supplémentaires. Lors de l'acquisition de données, les coordonnées de position de mouche individuelle des dossiers de logiciels d'acquisition pour chaque point de temps dans un fichier texte. Un appareil photo numérique unique positionné au-dessus des plaques d'essai acquiert des images à un taux de 0,5 Hz de trame. Le logiciel d'analyse "analyse des données pour la mouche de suivi-Six zones" extrait les informations de ce fichier texte à un) calculer la vitesse moyenne, b) déterminer le moment où une mouche situé succès la source de l'odeur, et c) la construction des fenêtres graphiques temps qui permettent à l'utilisateur de vue: voler l'emplacement, la distance de la mouche de la source de l'odeur dans le temps et la vitesse de vol moyenne au fil du temps. Il met également en forme les données pour l'exportation facile en spreprogramme de adsheet. Dans cette macro, nourriture recherche de latence est définie comme le point de temps à qui vole passer au moins 5 secondes dans un rayon de 5 mm du centre de l'arène.

1. Ouvrez le fichier du logiciel d'analyse «l'analyse des données pour le suivi Fly - Six zones". Sous l'onglet "Windows", cliquez sur "Créer une nouvelle table." Répétez cette étape jusqu'à six tableaux ont été créés.
2. Sous l'onglet "Macros", cliquez sur "Foodfinding." Un panneau principal devrait apparaître avec les options suivantes: Ouvrir fichier de données brutes pour la disposition; Ouvrir les données brutes du fichier pour un fichier de données; Fly Lieu, Distance, vitesse, mise en page; FormatDataFile.
3. Pour afficher les données brutes sans ajoutant des valeurs dans un fichier texte, cliquez sur "Ouvrir un fichier de données brutes pour la disposition." Recherchez et sélectionnez le fichier de données expérimentales dans la fenêtre du navigateur qui apparaît. Cliquez sur "Ouvrir".
4. Cliquez sur "Fly Lieu" pour voir l'emplacement de chaque mouche dans chacun des six domaines (six parcelles XY représentant chaque volée »s la position dans le temps devrait apparaître sur l'écran).
5. Cliquez sur "Distance" pour afficher la distance de chaque volée de la source de l'odeur (six parcelles représentant la distance de la mouche de la source de l'odeur dans le temps doivent apparaître sur l'écran). La ligne horizontale à y = 5 mm indique le seuil à partir duquel la volée est considéré comme étant situé à la source de nourriture.
6. Cliquez sur "Speed" pour afficher la vitesse moyenne de chaque volée pendant le procès (six parcelles représentant la vitesse de la mouche dans le temps doivent apparaître sur l'écran).
7. Cliquez sur "Mise en page" pour afficher une mise en page avec tous les emplacement à la mouche, la distance et la vitesse des graphiques en plus de la vitesse moyenne (pendant les 50 premières secondes) et la latence de trouver la source de l'odeur pour chaque volée (figure 1). Pour voir correctement la mise en page, il peut être nécessaire d'ajuster les marges. Pour ce faire, cliquez d'abord sur la fenêtre de mise en page. Sous l'onglet "Fichier", cliquez sur "Mise en page pour la disposition." Enlever les marges de0,2 pouces et cliquez sur "OK". Immédiatement à gauche de chaque parcelle de l'emplacement est un petit tableau avec les rubriques "Speed" et "latence". Les valeurs entrées sous chaque rubrique indiquent la vitesse moyenne en mm / sec et la recherche de la nourriture de latence en secondes. Entrées vides sous latence indiquent la mouche n'a pu trouver la source de l'odeur. Recherche alimentaire de latence est définie comme le point de temps au cours de laquelle les mouches ont passé au moins 5 secondes dans un rayon de 5 mm du centre de la chambre.
8. Pour imprimer une mise en page, cliquez sur la zone de mise en page (les mises à jour de mise en page dans le fichier en cours). Cliquez sur «Fichier» puis cliquez sur «Mise en page».
9. Pour voir l'image suivante, cliquez simplement sur "Ouvrir un fichier de données brutes pour la disposition." Cliquez sur le fichier de données brutes suivante que vous souhaitez voir et cliquez sur "OK". Cliquez sur la fenêtre de mise en page pour mettre à jour la fenêtre avec le nouveau fichier de données.
10. Les réglages peuvent être sauvegardés dans un fichier de l'expérience pour une utilisation ultérieure.

8. Exporter des données dele logiciel d'analyse de données sur un tableur

1. Pour exporter données de vitesse et de latence pour chaque fichier, cliquez sur «Ouvrir les données brutes du fichier pour le fichier de données." Sélectionnez un fichier de données expérimentales et cliquez sur «Ouvrir». Une nouvelle fenêtre de navigateur apparaît.
2. Dans la nouvelle fenêtre de navigateur, cliquez sur "Nouveau" puis cliquez sur "Document texte". Nommez le nouveau document texte. Sélectionnez le fichier texte nouvellement nommé et cliquez sur «Ouvrir». Cette stocke les données du fichier de données brutes dans le fichier texte.
3. Pour exporter des données depuis un autre fichier, cliquez sur "Ouvrir un fichier de données brutes pour le fichier de données." Cliquez sur un autre fichier et cliquez sur «Ouvrir». Sélectionnez le fichier de texte de l'étape 8.2). Continuez ce processus pour les fichiers de données restants que vous souhaitez exporter.
4. Une fois tous les fichiers de données souhaités ont été ajoutés au fichier de texte, cliquez sur "Format de fichier de données." Sélectionnez le document texte utilisé pour stocker les données des étapes précédentes et cliquez sur «Ouvrir» (une nouvelle window ouvrira automatiquement).
5. Créez un nouveau document de texte dans la fenêtre, attribuer un nom au fichier, et cliquez sur "Enregistrer". Cela crée un fichier texte qui contient le nom du fichier, la vitesse moyenne et temps de latence pour chaque mouche et peuvent être importés dans un tableur.
6. Parcelles cumulatifs sont construits à partir de données sur le nombre total de mouches atteignant la cible de l'odeur des aliments en fonction du temps (figure 3).
7. Ensembles de données expérimentales sont analysées pour la signification statistique en utilisant un test z pour les proportions.

Résultats

Le logiciel d'analyse de données et la mise en page, un exemple de ce qui peut être vu sur la figure 1, sont utilisés pour évaluer les performances de chaque volée lors de son essai de 10 min, selon un ensemble de critères d'analyse. Les critères suivants sont utilisés pour déterminer si les données de chaque volée seront utilisées pour l'analyse de données et sont conçus pour éliminer les mouches qui sont incapables d'accomplir la tâche de recherche de nourriture en rais...

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pas-à-pas pour l'essai du comportement de recherche de nourriture. En plus des odeurs liées à l'alimentation, il peut également être adapté pour l'étude de la capacité de la mouche de la placer d'autres objets d'odeurs. Par exemple, il peut être appliqué vers l'étude du comportement de localisation de compagnon dans les mouches mâles ³ Il ya plusieurs considérations supplémentaires pour ce protocole que nous allons mention...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple Cider Vinegar	Spectrum		commercially available
Agarose, Type VII	Sigma-Aldrich	A0701	low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate		custom	Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens	National Instruments	780024-01	Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate	Edmund Optics	custom	Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight	Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply	GW Instek	GPS-1830D	Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard	Digikey	922354-ND	Breadboard for LEDs